銀屑病的動物模型與細(xì)胞模型研究進(jìn)展

彭玲玲, 延祝, 夏育民

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，陜西 西安 710004)

銀屑病是一種較常見的免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，影響約2%的人群，對患者心理和經(jīng)濟(jì)狀況產(chǎn)生重大影響，其特征是表皮增生、免疫細(xì)胞浸潤、皮膚血管生成增加和局部各種炎性介質(zhì)上調(diào)[1]。由于缺乏模擬人類疾病復(fù)雜表型和發(fā)病機(jī)制的天然實(shí)驗(yàn)動物模型，目前銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究受到嚴(yán)重阻礙。近年，各種自發(fā)突變性、轉(zhuǎn)基因動物、異種移植產(chǎn)生的銀屑病動物模型以及各種細(xì)胞模型正在被研究，并逐漸應(yīng)用于銀屑病的病理生理學(xué)研究。

1 動物模型

1.1 自發(fā)動物模型

自發(fā)動物模型是在未經(jīng)過任何人工干預(yù)，在自然情況下發(fā)生自發(fā)性基因突變而產(chǎn)生的疾病模型。銀屑病的自發(fā)性突變小鼠模型主要包括：慢性增殖性皮炎(Sharpincpdm/Sharpincpdm)突變、鱗片狀皮膚(Ttc7fsn/Ttc7fsn)突變、同型ascbia(Scd1ab/Scd18b)突變以及無毛(hr/hr)突變等。這些自發(fā)性突變小鼠通常表現(xiàn)出銀屑病的一些組織學(xué)特征，例如棘層增厚，肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤，以及脈管系統(tǒng)增加，可用于研究某些免疫機(jī)制。由于一般不存在T淋巴細(xì)胞浸潤，并且對抗銀屑病藥物缺乏反應(yīng)，這些小鼠不能反映銀屑病的所有特征，不適于銀屑病的發(fā)病機(jī)制及新藥的研究。

1.2 轉(zhuǎn)基因動物模型

1.2.1 角蛋白14-AREG(K14-AREG)轉(zhuǎn)基因模型 雙調(diào)蛋白(amphiregulin,AREG)是銀屑病中表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)受體的關(guān)鍵配體，在正常表皮中低表達(dá)，但在銀屑病皮損中表達(dá)升高[2]。Cook等[3]研發(fā)了K14-AREG轉(zhuǎn)基因小鼠，該種小鼠出現(xiàn)表皮增生、角化過度和角化不全、真皮和表皮中炎癥細(xì)胞浸潤等特征。此外，抑制AREG的表達(dá)可改善表皮的異常增生。在使用角蛋白5(keratin 5, K5)啟動子建立的含有5’-3’非翻譯區(qū)序列(AREG-UTR)的AREG轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，除出現(xiàn)銀屑病樣癥狀外，還表現(xiàn)出明顯的毛發(fā)油膩、指甲伸長，伴隨皮脂腺增生，這與銀屑病患者中觀察到的皮脂腺萎縮相反[4]。AREG對調(diào)節(jié)表皮及其附屬物具有多方面的作用，為進(jìn)一步探索提供了新的思路。

1.2.2 角蛋白5-STAT3 (K5-STAT3) 轉(zhuǎn)基因模型 STAT3即信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3。STAT的激活需要經(jīng)過受體相關(guān)的Janus激酶的酪氨酸磷酸化[5]。STAT3可能介導(dǎo)表皮先天免疫反應(yīng)，參與銀屑病相關(guān)細(xì)胞因子的下游信號傳導(dǎo)[6]。Sano等[7]研究證實(shí)，銀屑病患者皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞的STAT3表達(dá)呈現(xiàn)激活狀態(tài)。在銀屑病皮損中，對STAT3具有激活效應(yīng)的細(xì)胞因子和生長因子如EGF、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，基本呈過度表達(dá)。

Sano等[8]以K5為啟動子建立K5-STAT3轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在2周齡之后，皮膚變紅出現(xiàn)鱗狀，尾部發(fā)生角化過度，在一些小鼠中皮損擴(kuò)散到背部和后足。這些小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞中的STAT3呈持續(xù)性激活狀態(tài)。這些皮損不會自發(fā)消退，反而會隨著時(shí)間的推移變得更加嚴(yán)重。在K5-STAT3小鼠的角質(zhì)形成細(xì)胞中，幾種銀屑病相關(guān)基因包括VEGF、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)、細(xì)胞間黏附分子1和核因子-κB的表達(dá)均上調(diào)。STAT3可通過細(xì)胞因子、生長因子途徑對銀屑病角化細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生重要作用，STAT3抑制劑將成為潛在的銀屑病有效治療的新方法。

1.2.3 角質(zhì)形成細(xì)胞-血管生成素受體Tie2(KC-Tie2)轉(zhuǎn)基因模型 Tie2是血管生成素家族的共同受體，具有酪氨酸激酶活性，廣泛表達(dá)于各種血管內(nèi)皮細(xì)胞中，在血管成熟和功能維持中起重要作用。Tie2可通過與細(xì)胞因子、宿主防御分子的相互作用介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖。KC-Tie2轉(zhuǎn)基因小鼠的角質(zhì)形成細(xì)胞中Tie2過度表達(dá)，導(dǎo)致該小鼠出現(xiàn)棘層增厚，炎癥細(xì)胞浸潤，銀屑病相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)增加[9]。該種小鼠在3周齡時(shí)，皮膚出現(xiàn)紅斑，皮下脈管系統(tǒng)明顯增加；8周齡時(shí)皮膚出現(xiàn)紅腫、鱗屑和角化過度。KC-Tie2轉(zhuǎn)基因小鼠表皮中磷酸化的STAT3上調(diào)、Th1相關(guān)細(xì)胞因子及Th17衍生的細(xì)胞因子增加，而Th2相關(guān)細(xì)胞因子保持不變，這些與人銀屑病中觀察到的細(xì)胞因子和T細(xì)胞譜一致。此外，全身免疫抑制劑對該模型的銀屑病病變治療有效[10]。KC-Tie2銀屑病樣小鼠模型為評估銀屑病臨床前期的靶向治療策略提供了理想的工具。

1.2.4 TGF-β1轉(zhuǎn)基因模型 TGF-β1是一種非常有效的趨化性刺激物，可促進(jìn)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的遷移[11]。Han等[12]建立的K5-TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠，大約4周后出現(xiàn)局部鱗屑性紅斑，繼而發(fā)展至全身；病理學(xué)上出現(xiàn)明顯的表皮增生和過度角化，新生血管形成和表皮基底膜降解，在真皮和真皮-表皮交界處有大量的CD4+和CD8+T細(xì)胞浸潤。

與STAT3或AREG轉(zhuǎn)基因小鼠模型相比，K5-TGF-β1小鼠表現(xiàn)出較低的表皮增殖。TGF-β1主要促進(jìn)Th1、Th17相關(guān)的細(xì)胞因子產(chǎn)生，但在某些病理狀況下K5-TGF-β1小鼠也可促進(jìn)Th2相關(guān)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[11]。激活的T細(xì)胞在皮膚炎癥中的作用僅限于K5-TGF-β1小鼠的起始階段，這些小鼠對IL-23抗體治療無反應(yīng)，而表現(xiàn)出高水平的IL-4和IgE。單純TGF-β1過表達(dá)不足以模擬銀屑病的所有特征，但可能是多種炎癥性皮膚病變的一個重要的促成因素。

1.2.5 K14 -VEGF轉(zhuǎn)基因模型 銀屑病與皮膚滲透性屏障異常和過量的VEGF生成有關(guān)，有研究表明銀屑病嚴(yán)重程度與VEGF血清水平相關(guān)[13]。K14 -VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠在表皮基底層中過表達(dá)VEGF-A164。該小鼠可發(fā)生類似銀屑病樣皮膚炎癥：真皮微血管密度增加，表皮增生與KC異常分化和真皮、表皮CD4+、CD8+T細(xì)胞浸潤[14]。6個月的純合K14-VEGF小鼠中可自發(fā)產(chǎn)生類似于銀屑病的皮損，并隨著年齡的增長而加重。將咪喹莫特(imiquimod，IMQ)應(yīng)用于2月齡的純合K14-VEGF小鼠皮膚，與野生小鼠模型相比，K14-VEGF小鼠具有更嚴(yán)重的皮膚炎癥，甚至在第14天，炎癥狀況仍在皮膚中穩(wěn)定存在[15]。純合K14-VEGF小鼠耳部多次外用伏波醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯后，可發(fā)展為長時(shí)間的皮膚炎癥，并伴有血清VEGF水平升高、表皮血管擴(kuò)增、T細(xì)胞浸潤和棘皮增厚。

1.3 IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型

IMQ是Toll樣受體(TLR7/8)激動劑，其誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型在表皮增厚、角質(zhì)形成細(xì)胞異常分化、炎性細(xì)胞浸潤及相關(guān)炎癥細(xì)胞因子等方面，產(chǎn)生與人銀屑病相似的改變[16]。目前普遍認(rèn)為該模型的病變主要由IL-23/IL-17軸介導(dǎo)[17]。IMQ 誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損在給藥的第 6～8 天(1次/24 h)最嚴(yán)重，此后逐漸消退，這可能與皮膚炎癥起始是由樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)有關(guān)[17]。

IMQ誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠病變模型具有品系依賴性，IMQ觸發(fā)了一個關(guān)鍵旁路，這個旁路在許多皮膚疾病中同樣會被激活。雖然IMQ誘導(dǎo)的模型能夠在一定程度上反映銀屑病，但在BALB/c、129/SvJ、DBA和MOLF小鼠中，IMQ誘導(dǎo)后的皮損表觀及炎癥反應(yīng)與其他人類皮膚病病變(如傷口或感染)更相似。IMQ 誘導(dǎo)的B6小鼠模型在皮膚表觀及炎癥反應(yīng)上與人銀屑病最相符[18]。

1.4 移植模型

異體移植模型的受體主要為SCID小鼠和AGR129小鼠。這種模型最接近人類銀屑病的病理生理學(xué)特點(diǎn)，是目前研究銀屑病的最佳模型[19]。由于SCID小鼠T細(xì)胞受體和免疫球蛋白基因重排所需的DNA依賴性蛋白激酶(Prkdc/DNA-PKcs)基因突變，使該小鼠缺乏體液和細(xì)胞免疫；銀屑病樣皮損可在移植的皮損中維持?jǐn)?shù)周至數(shù)月。該模型可在新生物制劑的臨床前期研究中評估其功效。AGR129是缺乏Ⅰ型與Ⅱ型IFN受體和活性重組酶基因的三重基因敲除小鼠，當(dāng)銀屑病患者正常皮膚移植到AGR129小鼠上時(shí)，該移植皮膚可自發(fā)發(fā)生銀屑病樣表型轉(zhuǎn)化；該轉(zhuǎn)化在移植后第4周開始出現(xiàn)，6～8周時(shí)完全轉(zhuǎn)化；病變的發(fā)展與移植物內(nèi)特別是表皮內(nèi)的CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞有關(guān)[20]。該模型已被用于銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究。

2 細(xì)胞模型

根據(jù)銀屑病組織病理學(xué)上表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和體外培養(yǎng)的細(xì)胞自身生物學(xué)特征，銀屑病的體外細(xì)胞模型常選用人表皮鱗癌細(xì)胞株COLO-1 6、人表皮永生化細(xì)胞株HaCaT及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV-304、人成纖維細(xì)胞。通過對凋亡、細(xì)胞因子、基因序列等分析，進(jìn)行銀屑病發(fā)病機(jī)制及藥物篩選的研究。此外，在體外給予角質(zhì)形成細(xì)胞特定的刺激因子，可用于研究銀屑病的相關(guān)研究[20]。用IL-17A、IL-22、SOM、TNF-α和IL-1α(M5)在體外刺激角質(zhì)形成細(xì)胞后抗微生物肽和趨化因子的表達(dá)增加，與銀屑病皮損相關(guān)。這些細(xì)胞模型為新藥篩選提供了有效的工具。然而該模型缺乏生理性層狀分化過程及復(fù)雜的人體皮膚的微環(huán)境特征，有一定的缺陷。

在人體表皮培養(yǎng)模型中，角質(zhì)形成細(xì)胞生長到氣-液交界面并進(jìn)行分化和分層，可模擬正常表皮形態(tài)。該模型中的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞可來自銀屑病患者，也可以來自正常個體，然后用各種細(xì)胞因子、生長因子處理，模擬銀屑病表皮的某些特征。在該衍生的模型中，角質(zhì)形成細(xì)胞表現(xiàn)出許多與人銀屑病相同的特征，例如趨化因子上調(diào)、角蛋白表達(dá)增加。這些細(xì)胞模型因缺乏炎癥細(xì)胞浸潤和血管結(jié)構(gòu)，具有一定局限性，目前用于角質(zhì)形成細(xì)胞的刺激反應(yīng)和分化過程的研究。

3 總結(jié)與展望

目前用于銀屑病研究的模型均不能完整反映該疾病的發(fā)生發(fā)展過程。自發(fā)模型突變率發(fā)生低，其應(yīng)用受到限制。轉(zhuǎn)基因動物模型是處理單個基因誘導(dǎo)產(chǎn)生的模型，雖然不能夠模擬出全部的銀屑病樣表現(xiàn)及炎癥情況，但具有較明顯的某些臨床表現(xiàn)，能夠用于研究某個基因在銀屑病皮損中的表達(dá)和效應(yīng)功能。IMQ模型是誘導(dǎo)時(shí)間最短、最經(jīng)濟(jì)、最方便的動物模型，與人體銀屑病的多種病變特征較近似，所以廣泛用于銀屑病的相關(guān)領(lǐng)域研究。異體移植模型是目前最接近人類銀屑病的模型，越來越多地被用于探討銀屑病的發(fā)病機(jī)制。細(xì)胞模型為新藥的篩選提供了有效的工具。相信隨著對涉及銀屑病易感基因和功能的深入研究，最終有望開發(fā)出更易行且符合銀屑病特征的理想模型。