王家雄，朱慧勇

目前手術(shù)和(或)放化療仍然是治療惡性腫瘤的主要方法，然而盡管各種手術(shù)及輔助放化療的方案在不斷優(yōu)化，并且改善了患者的生活質(zhì)量，但對于長期存活率并沒有顯著提高[1-3]。有臨床研究表明，目前應(yīng)用的化療試劑如5-氟尿嘧啶能殺傷腫瘤中的分化細(xì)胞，但腫瘤中存在一些具有分化潛能的干細(xì)胞樣細(xì)胞，對此的反應(yīng)較差，治療后反而使這些細(xì)胞富集，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，且新生腫物與原發(fā)腫瘤有近似的遺傳學(xué)改變[4]。推測術(shù)后新生腫瘤可能與這些具有增殖分化潛能的細(xì)胞團(tuán)塊有密切聯(lián)系。目前對一些新輔助治療方法的探索已經(jīng)興起，比如腫瘤干細(xì)胞理論。該理論對腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等行為提出了較為合理的解釋，提供了新的治療方向[5-6]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子(Krüppel-like factors，KLFs)家族可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)，而腫瘤干細(xì)胞可能在KLFs與腫瘤行為的聯(lián)系中起重要作用。

1 腫瘤干細(xì)胞與腫瘤的關(guān)系

1.1 腫瘤干細(xì)胞

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)指腫瘤中具有無限增殖能力及分化出異質(zhì)腫瘤細(xì)胞能力的細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞中存在一個(gè)特定的具有干細(xì)胞樣特征的細(xì)胞亞群，即“腫瘤干細(xì)胞”，或稱“腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞”，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)。這些細(xì)胞類似正常的組織干細(xì)胞，具有自我更新與分化潛力，能形成不同的腫瘤細(xì)胞類型，從而導(dǎo)致腫瘤的異質(zhì)性。同時(shí)，腫瘤內(nèi)其他細(xì)胞不具有無限增殖能力，不能分化出所有類型的腫瘤細(xì)胞。腫瘤側(cè)群細(xì)胞(Side Population cells，SP cells)也可認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞。Ojha等[7]通過對膀胱癌SP細(xì)胞及非SP細(xì)胞，膀胱癌細(xì)胞系T24及UM-UC-3的研究，發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞相對于其他細(xì)胞高表達(dá)Sox-2、Nanog、KLF-4、Oct-4、ABCG2、MDR1，并且具有更強(qiáng)的成球能力，且SP細(xì)胞能增殖出非SP細(xì)胞，表明SP細(xì)胞同樣具有干性。

Bánkfalvi等[8-9]對口腔癌組織的組織型、表現(xiàn)型及染色體組型做了研究分析，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了口腔癌的細(xì)胞異質(zhì)性，其中存在著不同表型及分化程度的腫瘤細(xì)胞。這些細(xì)胞的增殖活性和克隆形成能力具有很大差異，Mackenzie等通過對不同口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)細(xì)胞系的培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)形成的惡性細(xì)胞團(tuán)塊來自于一小部分細(xì)胞，即其中只有一小部分細(xì)胞具有克隆形成能力。Chiou等[10]通過對OSCC細(xì)胞系以及OSCC原代細(xì)胞進(jìn)行無血清成球培養(yǎng)，成功富集了干細(xì)胞樣細(xì)胞，其能高表達(dá)Oct-4、Nanog、CD117、Nestin、CD133等細(xì)胞干性標(biāo)記物，表明口腔癌中確實(shí)存在腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞。

此外，在乳腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌等腫瘤組織中也均發(fā)現(xiàn)有腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的存在[11-14]。

1.2 腫瘤干細(xì)胞與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系

大部分的癌癥死亡是由于轉(zhuǎn)移引起的，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤中逃逸，通過淋巴與血管系統(tǒng)在遠(yuǎn)處器官存活下來，進(jìn)而形成繼發(fā)腫瘤。而其中只有極少數(shù)腫瘤細(xì)胞能夠逃過人體的免疫系統(tǒng)而幸存[15]。研究發(fā)現(xiàn)，每克腫瘤組織每天能釋放多達(dá)1×106個(gè)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，但腫瘤的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移卻沒有這么多[16]。這說明腫瘤中僅極小部分細(xì)胞能成功地遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。但這種特性在涉及到非腫瘤干細(xì)胞至腫瘤干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化潛能時(shí)，尚需更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。但通過一些特定的標(biāo)志物，如CD26、CXCR4及CD44等能夠檢測出這些具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞亞群[17-19]。

Lawson等[20]構(gòu)建了基于人乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移模型，發(fā)現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移細(xì)胞具有明顯的干細(xì)胞樣基因表達(dá)特征，而與之相反的，晚期轉(zhuǎn)移細(xì)胞的基因特征與原發(fā)腫瘤的基因特征更為接近，分化標(biāo)記物的表達(dá)增加，干細(xì)胞樣特征則減少。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)移由干細(xì)胞樣細(xì)胞啟動(dòng)，這些細(xì)胞增殖和分化引起腫瘤的轉(zhuǎn)移。

1.3 腫瘤干細(xì)胞與腫瘤抗性

近50年來，外科手術(shù)與放化療一直是治療癌癥較為有效的方法。然而，盡管治療方案在不斷改進(jìn)，大部分患者仍然存在著腫瘤的復(fù)發(fā)與耐藥現(xiàn)象。大量的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明，腫瘤干細(xì)胞可能是癌癥復(fù)發(fā)與耐藥性的罪魁禍?zhǔn)譡21-23]。腫瘤干細(xì)胞大多處于休眠狀態(tài)，而當(dāng)前化療試劑如順鉑、5-氟脲嘧啶等多指向分裂期的細(xì)胞，這也使腫瘤干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性存在差異。Colak等[24]報(bào)道，結(jié)腸癌干細(xì)胞能選擇性地抵抗由化療介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而已分化結(jié)腸癌細(xì)胞則對化療相對敏感。且存活的腫瘤干細(xì)胞還能重啟增殖，證明了腫瘤干細(xì)胞與腫瘤治療的耐藥性相關(guān)。而Ojha等對膀胱癌SP細(xì)胞的研究，發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞表現(xiàn)出較低的活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平及較高的谷胱甘肽比率(GSH/GSSG)，這可能與腫瘤的放射抗性相關(guān)[7]。此外放化療也會導(dǎo)致普通腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞(induced cancer stem cells，iCSCs)，從而導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移[6，25]。

2 KLFs與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系

KLFs是一類廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的包含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，其通過3個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)與DNA富GC區(qū)域結(jié)合，這種結(jié)構(gòu)在該組轉(zhuǎn)錄因子中高度保守，與首批被鑒別的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子SP1具有同源性，因此又被歸類為KLFs/SP家族(Krüppel-like factors/ specificity protein，KLFs/SP)[26]。目前研究已發(fā)現(xiàn)17種KLF因子，分別命名為KLF1～KLF17，其功能與人類各大系統(tǒng)生理過程及疾病發(fā)生密切相關(guān)[27-31]。它們在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡甚至腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移等方面起到重要的作用。例如KLF-4能夠通過影響致癌基因K-ras的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的生長[32]。還可通過下調(diào)組織金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1/TIMP-2，以及E-cadherin和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關(guān)蛋白如Snail等來抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲性[33]。KLF-17也能夠抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[34]。而KLF6-SV1和KLF-8的高表達(dá)則會促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移[35-36]。

KLFs對于腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等行為的調(diào)控可能與腫瘤干細(xì)胞有關(guān)。其在腫瘤干細(xì)胞干性的建立或維持中起重要作用[37]。而KLFs對腫瘤干細(xì)胞干性的影響則可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)。CDKs家族是重要的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，KLFs尤其是KLF-4與KLF-5會影響編碼細(xì)胞周期蛋白相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，Yang等對食管癌細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞接受紫外線照射損傷DNA后，KLF-4與KLF-5可上調(diào)CDK抑制劑p21的表達(dá)，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)KLF-4可能優(yōu)先激活DNA修復(fù)通路，而KLF-5則在紫外線照射后誘導(dǎo)DNA修復(fù)和凋亡[38]。

此外，Wnt/β-catenin通路在腫瘤行為中也起到了重要的作用。Wnt/β-catenin通路是細(xì)胞因子調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖的重要通路，是KLFs的共同靶點(diǎn)。比如KLF-4通過拮抗TCF-4與β-catenin的結(jié)合從而抑制Wnt通路[39-40]，KLF-6同樣抑制Wnt通路[41]，而相反的，KLF-5與KLF-8則會增強(qiáng)Wnt通路[42-43]。

TGF-β也是腫瘤細(xì)胞增殖的重要通路。KLF-10的過表達(dá)可增加內(nèi)源性TGF-β調(diào)控基因p21與PAI-1的表達(dá)[44]，KLF-5在存在TGF-β情況下會抑制癌基因Myc的表達(dá)，而缺乏TGF-β的情況下則相反[45]。

目前對于腫瘤細(xì)胞干性相關(guān)的研究結(jié)果多指向KLF-4。而其他如KLF-5/6/7/8等作為KLFs家族的一員，推測其同樣參與腫瘤干細(xì)胞干性的建立及維持。

2.1 KLF-4與腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)性

KLF-4是一種重要的腫瘤抑制因子，有多項(xiàng)臨床研究表明KLF-4在口腔癌、鼻咽癌及前列腺癌等腫瘤中均呈低表達(dá)，并且多因素分析表明低水平的KLF-4表達(dá)可能是導(dǎo)致腫瘤預(yù)后不良的重要不利因素[46-48]。KLF-4也是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，早在2003年，Chen等利用cDNA微陣列分析的方法在已建立的含有誘導(dǎo)KLF-4基因的人細(xì)胞系中鑒定了KLF-4的靶基因。研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)發(fā)生顯著變化的基因中許多上調(diào)基因是細(xì)胞周期的抑制因子，而許多下調(diào)基因是細(xì)胞周期的啟動(dòng)子[49]。結(jié)果提示KLF-4在細(xì)胞自我更新上的重要調(diào)控作用。

另一方面，KLF-4還是維持細(xì)胞干性，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的重要因素，是誘導(dǎo)體細(xì)胞脫分化為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS )的4個(gè)因子之一[50]。Takanashi與Yamanaka等篩選了不同的基因組合，最終用Oct-3/4，Sox2，c-Myc，KLF-4的基因組合成功將成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞。而此后其他研究者在此基礎(chǔ)上用該組合將結(jié)果在膀胱上皮細(xì)胞等其他組織細(xì)胞上重現(xiàn)[51]。此外，在干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞中，KLF-4均能通過端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶通路(telomerase reverse transcriptase,TERT)保持端粒酶活性。且KLF-4尚能通過促進(jìn)β-catenin的結(jié)合來反式激活TERT[52]，提示了KLF-4與細(xì)胞干性在腫瘤發(fā)生過程中的密切關(guān)系。這充分表明了KLF-4在細(xì)胞干性維持上的潛能。

研究發(fā)現(xiàn)KLF-4抑制腫瘤的效果是通過誘導(dǎo)CDK抑制因子CDKN1A和CDKN1B的表達(dá)及抑制細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin-D1)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子FoxM1(forkhead box M1)的表達(dá)來抑制腫瘤的生長[53-55]。而CDKs被證明與細(xì)胞干性以及癌基因Myc的表達(dá)密切相關(guān)[20，56]。表明KLF-4在細(xì)胞干性維持及細(xì)胞自我更新過程中起重要作用。據(jù)此推測其可通過調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞周期進(jìn)一步調(diào)控腫瘤的生長分化，是聯(lián)系腫瘤的生物學(xué)行為與腫瘤干細(xì)胞干性的重要橋梁。

2.2 KLF-7與腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)性

KLF-7是KLFs/SP轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)家族的一員，在成體各組織中低水平廣泛表達(dá)，因此又稱UKLF(ubiquitous Krüppel-like factor)[57]。目前研究表明KLF-7是癌癥、肥胖癥、Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、面部發(fā)育異常、氧化磷酸化缺陷和Ⅰ型自身免疫性胰腺炎等疾病的相關(guān)基因。

Ciribilli等[58]對人類癌癥中存在的一種過度表達(dá)基因c-Myc的研究發(fā)現(xiàn)，在癌癥樣本中，KLF-7對c-Myc基因的表達(dá)起到協(xié)同轉(zhuǎn)錄作用，而在非癌癥樣本中則不然。而另有研究通過對比胃癌樣本與正常鄰近組織樣本的KLF-7表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，KLF-7在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)有顯著的升高，且其表達(dá)量與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[59]。這提示KLF-7在癌癥發(fā)生及發(fā)展中可能有表達(dá)增高的情況，并起到調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生與發(fā)展的作用。

Caiazzo等通過對神經(jīng)干細(xì)胞中KLF-7表達(dá)水平的研究發(fā)現(xiàn)，KLF-7表達(dá)水平受多種干細(xì)胞自我更新的調(diào)節(jié)因子如Oct4和Nanog的調(diào)控[60]。過表達(dá)或者沉默KLF-7基因后，神經(jīng)外胚層和中胚層多個(gè)譜系細(xì)胞的分化潛能發(fā)生了變化。這表明KLF-7 在維持多能干細(xì)胞干性中起到了重要的作用，并對干細(xì)胞的多種分化潛能具有調(diào)控作用。而Klein等對角膜上皮細(xì)胞分化的研究發(fā)現(xiàn)KLF-4和KLF-5可促進(jìn)角膜上皮分化[61]。而KLF-7在許多過程中可拮抗促進(jìn)角膜分化的KLF-4，使角膜上皮維持在祖細(xì)胞狀態(tài)。這表明KLF-7在該過程中具有細(xì)胞干性維持的重要作用。

2.3 KLF-8與腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)性

KLF-8也是KLFs家族中一種重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，與KLF-7類似，KLF-8在EMT的激活過程中也起到重要作用[62]。KLF-8與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)，在肝癌、胃癌、肺癌等許多惡性腫瘤中均存在過表達(dá)現(xiàn)象。

Shen等對KLF-8在肝癌中的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，KLF-8在原發(fā)性肝癌腫瘤組織、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組織及肝癌干細(xì)胞中均有高表達(dá)，且KLF-8下調(diào)的肝癌細(xì)胞相比于對照組，在相同劑量索拉菲尼及順鉑作用下能夠觀察到更明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，說明KLF-8與腫瘤藥物敏感性相關(guān)。且KLF-8的表達(dá)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。該研究者還發(fā)現(xiàn)下調(diào)KLF-8的肝癌細(xì)胞后核β-catenin蛋白表達(dá)量降低，并且β-catenin下游基因，如c-Myc、cyclin D1等mRNA表達(dá)也顯著降低，而Wnt通路激活劑LiCl則能消除KLF-8下調(diào)的影響。研究者據(jù)此認(rèn)為KLF-8可通過激活Wnt/β-catenin通路維持腫瘤細(xì)胞干性，促進(jìn)化療耐藥[63]。

另有學(xué)者在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的研究中采用異種移植模型研究KLF-8對腫瘤生長及替莫唑胺敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)在KLF-8缺失的情況下，膠質(zhì)瘤細(xì)胞對替莫唑胺表現(xiàn)出更大的敏感性，導(dǎo)致細(xì)胞生長受到抑制，凋亡增強(qiáng)，而KLF-8過表達(dá)的情況下情況則相反[64]。

2.4 其他KLFs與腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)性

KLF-5也是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，在結(jié)腸癌細(xì)胞中其表達(dá)的缺失會降低Wnt/β-catenin通路的激活。與KLF-4類似，KLF-5同樣可誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的形成[65]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在食管癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)KLF-5的上調(diào)[66]，表明KLF-5同樣與腫瘤細(xì)胞干性維持及自我更新有關(guān)。

Ying等通過研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中KLF-9的表達(dá)發(fā)現(xiàn)KLF-9是一種重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子，它可通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中與腫瘤發(fā)生及干性調(diào)節(jié)相關(guān)通路(如整合素通路)，來抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的干性[67]。

3 總 結(jié)

以目前的研究看來，腫瘤干細(xì)胞理論對于惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等行為的解釋具有較好的臨床及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。而KLFs家族在腫瘤行為中起到了非常重要的作用，這可能是通過調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞的多能性來實(shí)現(xiàn)。從上述研究來看，KLF-4/7/8等均表現(xiàn)出了這樣的趨勢。然而目前對于KLFs的研究，相較于KLF-4，對其他KLFs的研究仍相對不足，對于KLFs與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)性的直接研究也較少，且許多相關(guān)研究仍停留在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。其能否準(zhǔn)確反映腫瘤在人體內(nèi)的活動(dòng)仍然有待研究。

研究腫瘤干細(xì)胞發(fā)生的機(jī)理，基因突變的位點(diǎn)，相應(yīng)的信號通路，通過腫瘤干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)新的靶向治療的途徑，將能有效提高惡性腫瘤患者的生存率與生活質(zhì)量。而其中KLFs家族在對于腫瘤干細(xì)胞的進(jìn)一步研究中應(yīng)是有潛力的切入點(diǎn)。