蜂毒肽抗腫瘤作用研究進(jìn)展

馮 挺，胡福良

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)1801 班，浙江 杭州 310058；2.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

1 引言

蜂毒取自蜜蜂(Apis)工蜂的毒腺以及副腺，為多種蛋白質(zhì)多肽類、生物胺類和非蛋白物質(zhì)組成的混合物。其中約占蜂毒干重的50%的蜂毒肽（Melittin） 是蜂毒中的重要活性成分。根據(jù)部分C-末端氨基酸殘基所存在的差異，可將蜂毒肽分為蜂毒肽-1 和蜂毒肽-2 兩種類型。其中蜂毒肽-1 由26 個氨基酸殘基構(gòu)成，分子式為C131H229N39O31，分子量為2.84 kD[1]。

蜂毒肽-1 構(gòu)成成分中，賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸比例較大，所占比例為23.1%。進(jìn)一步作蜂毒肽等電點(diǎn)測定可確定其pI＞7[2]。此外，蜂毒肽具有的兩親性主要來自于多肽鏈中特定的氨基酸排列順序，即非極性、疏水性以及中性氨基酸主要集中于N-末端，而親水性和堿性氨基酸則大部分位于C-末端。在水溶液中蜂毒肽由于單體空間位阻所限，往往趨于形成以四聚體為主的寡聚體。就功能而言，蜂毒肽具有潛在膜活性，其寡聚體可在細(xì)胞膜上形成親水性小孔干擾磷脂雙分子層的完整性，使胞內(nèi)物質(zhì)滲漏造成滲透壓改變，繼而導(dǎo)致細(xì)胞組織的溶解。研究發(fā)現(xiàn)蜂毒肽濃度與其同體細(xì)胞結(jié)合能力在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)關(guān)系，高濃度四聚體的蜂毒肽具有較明顯的細(xì)胞殺傷作用。由于蜂毒肽無序蛋白具有自發(fā)組裝四聚體的物化性質(zhì)以及其獨(dú)特的作用機(jī)制，在臨床具體應(yīng)用中蜂毒肽表現(xiàn)出具抗菌、抗感染、抗腫瘤、抗病毒等生理效應(yīng)，其中抗腫瘤作用更是成為近年來研究熱點(diǎn)。

2 蜂毒肽抗腫瘤機(jī)制

蜂毒肽抗腫瘤作用的具體機(jī)制主要表現(xiàn)在對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷效應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生損傷和凋亡，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，改變腫瘤細(xì)胞生存環(huán)境和免疫調(diào)節(jié)作用等方面，以下分點(diǎn)論述。

2.1 直接殺傷腫瘤細(xì)胞

2.1.1 直接形成胞膜孔隙溶解細(xì)胞

中性水溶液中蜂毒肽主要以隨機(jī)卷曲的單體形式存在[3]，在環(huán)境體系中pH 值上升以及相應(yīng)離子比例改變的情況下，蜂毒肽即發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，最終形成螺旋狀四聚體形態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽高級結(jié)構(gòu)具低穩(wěn)定性，即高度無序性，其在不同溶液中多肽本身內(nèi)部結(jié)構(gòu)存在相當(dāng)差異性，此為固有無序蛋白的顯著特征。該差異可能為蜂毒肽對腫瘤細(xì)胞廣譜性殺傷作用提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。且如上文所述蜂毒肽N-末端主要為非極性、疏水性以及中性氨基酸，C-末端為親水性氨基酸以及堿性氨基酸，具有兩親性。該特征決定了蜂毒肽能插入天然或人工合成的磷脂雙分子層，從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞毒素作用。且蜂毒肽可通過垂直構(gòu)象與平行構(gòu)象2 種不同形式與生物膜結(jié)合。垂直構(gòu)象下蜂毒肽將導(dǎo)致孔隙形成，而水平構(gòu)象下由于增大膜無效面積，反而阻止其他蜂毒肽表現(xiàn)為垂直構(gòu)象。目前相關(guān)主流觀念認(rèn)為蜂毒肽相對濃度決定蜂毒肽的具體作用機(jī)制，即在低濃度下蜂毒肽主要以平行構(gòu)象的形式與生物膜結(jié)合，在高濃度下蜂毒肽主要以垂直構(gòu)象的形式與生物膜結(jié)合，即兩步結(jié)合模式。但在分子動力學(xué)上蜂毒肽如何克服平行構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榇怪睒?gòu)象相關(guān)能閾尚需做進(jìn)一步研究。

2.1.2 水解腫瘤細(xì)胞膜蛋白殺傷細(xì)胞

研究發(fā)現(xiàn)蜂毒肽對PLA2 作用具有雙重性，在低濃度條件下蜂毒肽抑制PLA2 活性，而在高濃度條件下蜂毒肽則會激活PLA2。且蜂毒肽與PLA2 與腫瘤細(xì)胞相互作用后，會水解失活腫瘤細(xì)胞膜蛋白Band-3 蛋白[4]。Band-3 蛋白作為腫瘤細(xì)胞膜蛋白的重要組成部分，是腫瘤細(xì)胞膜上的重要離子通道，主要起到維持腫瘤細(xì)胞滲透壓內(nèi)外平衡的作用。除此之外，Band-3 蛋白尚具有維持細(xì)胞獨(dú)立性與防止膜蛋白被錯誤水解的重要功能。當(dāng)Band-3 蛋白異常水解后，腫瘤細(xì)胞膜內(nèi)外離子交換代謝活動將發(fā)生紊亂，將影響腫瘤細(xì)胞整體滲透壓平衡以及細(xì)胞生化代謝反應(yīng)強(qiáng)度，腫瘤細(xì)胞長期失代償后即發(fā)生細(xì)胞凋亡。

2.2 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

蜂毒肽尚可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用，具體機(jī)制主要包括線粒體凋亡，死亡受體途徑以及影響鈣離子分布等。

2.2.1 線粒體凋亡途徑

細(xì)胞凋亡可根據(jù)凋亡因子的來源分為外源性細(xì)胞凋亡和內(nèi)源性細(xì)胞凋亡，其中內(nèi)源性細(xì)胞凋亡主要效應(yīng)器為線粒體，在接受相應(yīng)損傷信息刺激后線粒體可釋放出CytC 等凋亡因子[5]，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的胱天蛋白酶 caspases-9，而后caspases-9 會激活下游級聯(lián)反應(yīng)，并以正反饋形式促進(jìn)CytC 釋放，實(shí)現(xiàn)快進(jìn)程的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)不同濃度蜂毒肽對腫瘤細(xì)胞的損傷程度也不同，高濃度的蜂毒肽往往直接造成對腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，低濃度的蜂毒肽則主要通過上調(diào)某些損傷刺激程度來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。李玉梅[6]等研究發(fā)現(xiàn)蜂毒肽能夠上調(diào)人成骨肉瘤細(xì)胞U2OS 細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2 相關(guān)X 蛋白Bax 蛋白基因表達(dá)水平，Bax/Bcl-2 比例的增加將依次激活內(nèi)源性細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白酶caspases-9 與caspases-3的活性，并提高線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP） 通透性，腫瘤細(xì)胞離子平衡發(fā)生紊亂進(jìn)而膜電位發(fā)生去極化，最終誘導(dǎo)人成骨肉瘤細(xì)胞U2OS 細(xì)胞凋亡。

2.2.2 死亡受體途徑

死亡受體主要可分為活化誘導(dǎo)的CD95（Fas 或APO-1）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosisfactor，TNF） 和凋亡誘導(dǎo)配體受體TRAILR 三類。當(dāng)胞外對應(yīng)的凋亡刺激傳遞至體細(xì)胞細(xì)胞膜表面對應(yīng)的跨膜死亡受體后，跨膜死亡受體會將凋亡信號先后由銜接蛋白與效應(yīng)蛋白傳至胞漿內(nèi)，并激活相應(yīng)的細(xì)胞凋亡機(jī)制，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。張晨[7]用濃度為32μg/mL 的蜂毒肽處理人肝癌BEL-7402 細(xì)胞后，通過RT-PCR 擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行蜂毒肽與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白基因表達(dá)譜之間相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)蜂毒肽可上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Fas 蛋白表達(dá)以及其配體FasL 基因表達(dá)水平，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞死亡受體易感性，并促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而阻止腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。且Wang等[8]通過構(gòu)建小鼠荷瘤模型，發(fā)現(xiàn)5μg/mL 蜂毒肽便可激活CaMK II-TAK1-JNK/p38 以及抑制IκBα Kinase-NF-κB 的協(xié)同效應(yīng)，該協(xié)同效應(yīng)提高了腫瘤細(xì)胞對TRAIL 的敏感性并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。而JO 等[9]研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度蜂毒肽可有效抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3 和人類卵巢畸胎瘤細(xì)胞(PA)-1 的增殖，具體機(jī)制則為其通過上調(diào)死亡受體(DR)表達(dá)以阻止細(xì)胞惡性增殖。

2.2.3 影響鈣離子分布

鈣離子作為人體細(xì)胞各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的中心離子，對細(xì)胞各項(xiàng)信號通路以及生命活動均具有關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)功能。生理情況下細(xì)胞通過上游各種復(fù)雜機(jī)制調(diào)節(jié)鈣泵與鈣離子通道的活性，從而影響細(xì)胞內(nèi)外鈣動態(tài)平衡。但在異常情況下可能會產(chǎn)生鈣超載的相關(guān)效應(yīng)，如當(dāng)Ca2＋從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后會激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近的calpain[10]，然后作用于caspases-12使之活化并釋放入細(xì)胞質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能損傷以致細(xì)胞凋亡。CHU 等[11]研究發(fā)現(xiàn)在人骨瘤細(xì)胞MG63 中蜂毒肽能提高L 型Ca2＋通道通透性并誘導(dǎo)胞外Ca2＋內(nèi)流，升高細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度，激活細(xì)胞內(nèi)鈣超載反應(yīng)體系，誘導(dǎo)人骨瘤細(xì)胞MG63 發(fā)生細(xì)胞凋亡。且由蜂毒肽引起的Ca2＋內(nèi)流與PKC 和PLA2活性并無直接相關(guān)性。

2.3 影響腫瘤細(xì)胞行為

惡性腫瘤細(xì)胞主要生理性行為即為浸潤性生長以及擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，其間伴隨著一系列多步驟、多因素、多階段的復(fù)雜相互作用，如細(xì)胞的脫落和聚合，黏附與去黏附等過程。蜂毒肽可能在其中多環(huán)節(jié)具體負(fù)性調(diào)控作用。

李紹祥等[12]研究發(fā)現(xiàn)蜂毒肽基因轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2 后HepG2 細(xì)胞中CD54 表達(dá)水平明顯下調(diào)，CD54 為細(xì)胞表面重要黏附受體，在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常高表達(dá)。CD54 具有協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃脫T 細(xì)胞的免疫監(jiān)視，以實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞回避機(jī)體細(xì)胞免疫系統(tǒng)攻擊，從而表現(xiàn)出腫瘤的高存活性與高轉(zhuǎn)移性。故CD54 表達(dá)水平下調(diào)可抑制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散以及惡性增殖。PARK 等[13]通過研究蜂毒肽與人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 細(xì)胞中NF-κB 和JNK/ p38 信號通路活動強(qiáng)度分析，證明蜂毒肽對該體系存在負(fù)性下調(diào)作用，該作用可影響基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9） 的表達(dá)水平。后者往往與腫瘤細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的降解以及腫瘤浸潤性生長和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的概率密切相關(guān)。Liu 等[14]研究表明，8μg/mL 蜂毒肽能有效抑制Jun 通路，而后者為肝癌細(xì)胞MHCC97L 獲得浸潤及遷移能力所必須的Ras 相關(guān)的C3 肉毒素底物(Rac)-1 依賴性通路的關(guān)鍵依賴通路，故其可通過下調(diào)Jun通路活性以最終達(dá)到阻止肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的生理作用。

2.4 改變腫瘤細(xì)胞生存環(huán)境

原發(fā)性腫瘤在直徑達(dá)到1～2 mm，若無新生血管生成以供給營養(yǎng)，常生長停滯，表明血管生成對腫瘤發(fā)生具有根本性影響，此外血管形成也為腫瘤細(xì)胞血道轉(zhuǎn)移提供重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)蜂毒肽可有效減少骨肉瘤UNR-106 細(xì)胞裸鼠移植瘤新生血管數(shù)量，并改變骨肉瘤UNR-106 細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)成分。此外PARK等[13]研究發(fā)現(xiàn)蜂毒肽對血管內(nèi)皮生長因子A誘導(dǎo)Lewis 肺癌體內(nèi)腫瘤的生長和腫瘤相關(guān)血管的生成具有抑制作用，這種抑制效應(yīng)可能與VEGF-2 和COX-2 通過促分裂原活化的蛋白激酶信號通路有關(guān)。

2.5 免疫調(diào)節(jié)作用

免疫調(diào)節(jié)是指在機(jī)體免疫系統(tǒng)整體作用下，在免疫器官、免疫細(xì)胞以及免疫分子三級間相互作用共同調(diào)整免疫反應(yīng)，使機(jī)體能維持較高水平的免疫應(yīng)答強(qiáng)度，保證正常的免疫清除和免疫監(jiān)控功能。異常的免疫調(diào)節(jié)往往是絕大多數(shù)腫瘤逃脫機(jī)體免疫監(jiān)視的主要原因。NAM 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽能上調(diào)T-bet 水平并選擇性地誘導(dǎo)Th1 細(xì)胞譜系發(fā)展，終效應(yīng)為增加Th1 細(xì)胞的特異性細(xì)胞因子γ-干擾素的表達(dá)。且蜂毒肽該效應(yīng)無需依賴任何抗原呈遞細(xì)胞即可完成CD4+T 細(xì)胞誘導(dǎo)。γ-干擾素則為細(xì)胞免疫體系的重要調(diào)節(jié)因子，具有極強(qiáng)的抗腫瘤作用。熊浪平等[16]研究發(fā)現(xiàn)蜂毒肽能調(diào)整Th1 細(xì)胞活性和增加機(jī)體內(nèi)γ-干擾素濃度，并減少IL-4濃度，綜合多種細(xì)胞因子的改變最終實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)。朱萱萱等[17]則通過不同濃度蜂毒皮下連續(xù)給藥S180 肉瘤鼠5 d 發(fā)現(xiàn)其在增強(qiáng)T 淋巴細(xì)胞活性的基礎(chǔ)上可增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)RES 單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬功能，以實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

3 結(jié)語與展望

蜂毒肽集抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、抗輻射等多種藥理學(xué)作用于一身，被廣泛應(yīng)用于治療血液及心血管系統(tǒng)疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面。此外，據(jù)報(bào)道在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也有所運(yùn)用，為重要的醫(yī)藥開發(fā)節(jié)點(diǎn)。具體而言，如在抗腫瘤領(lǐng)域，蜂毒肽可通過對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷效應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生損傷和凋亡，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，改變腫瘤細(xì)胞生存環(huán)境和免疫調(diào)節(jié)作用等途徑實(shí)現(xiàn)其生理活性。但蜂毒肽在投入臨床實(shí)際應(yīng)用前尚存在許多問題，如蜂毒肽分離提純純度較低，蜂毒肽本身具一定的溶血性問題等。當(dāng)前前沿研究砥礪于改進(jìn)色譜法，由粗蜂毒中提取蜂毒肽以及生物工程技術(shù)利用酵母表達(dá)體系，以及大豆發(fā)根細(xì)胞表達(dá)蜂毒肽效率，如莫偉亮[18]等通過將螢火蟲熒光素酶和蜂毒肽融合蛋白通過發(fā)根農(nóng)桿菌K599 介導(dǎo)入大豆發(fā)根細(xì)胞并表達(dá)，實(shí)現(xiàn)每100 g 大豆發(fā)根大約能提純出1 mg 具更高活性與可溶性的蜂毒肽蛋白。而就解決蜂毒肽不良影響這一問題的前沿研究，則已開發(fā)出利用仿高密度脂蛋白多肽脂質(zhì)納米顆粒作為蜂毒肽的運(yùn)載體以及新型融合蛋白melittin-mhil-2 等技術(shù)，較為成功地克服了蜂毒肽的溶血性和潛在的免疫效應(yīng)所帶來的負(fù)面影響。概而論之，蜂毒肽尚需且必要進(jìn)行進(jìn)一步研究分析以克服其負(fù)面影響，實(shí)現(xiàn)更加寬廣的實(shí)際應(yīng)用。