胡 康, 張伊動, 唐燕瓊, 李 宏, 馬 香, 劉 柱

(海南大學(xué) 生命科學(xué)與藥學(xué)院 熱帶生物資源教育部重點實驗室， ?？?570228)

AcrR蛋白是轉(zhuǎn)錄抑制因子TetR家族的成員，是一種負調(diào)控因子[1]。在大腸桿菌中已經(jīng)對AcrR蛋白開展了廣泛研究，其N末端形成典型的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，是其與DNA鏈的結(jié)合位點。被誘導(dǎo)時，AcrR會抑制acrAB的表達[2]。研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素-鎂復(fù)合物與AcrR結(jié)合能降低AcrR與DNA結(jié)合的親和力，并使多藥物外排復(fù)合物AcrAB轉(zhuǎn)錄活性增強[3]。AcrAB-TolC作為大腸桿菌中最主要的多藥外排泵，包括外膜通道蛋白TolC、周質(zhì)融合蛋白AcrA和藥物質(zhì)轉(zhuǎn)運子AcrB。最新研究表明，在植物乳桿菌中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子AcrR可通過調(diào)節(jié)脂肪酸合成提高乙醇耐受性，還可通過調(diào)控醛-醇脫氫酶(AdhE)控制植物乳桿菌對甘露醇和山梨醇的利用[4-5]。在假單胞菌中，AcrR可以調(diào)節(jié)鐵清除劑的合成，提高細菌在環(huán)境中的競爭力[6]。在流感嗜血桿菌中，AcrR與細菌在熱應(yīng)激反應(yīng)中對亞胺培南抗性增強相關(guān)[7]。另外AcrR突變會導(dǎo)致大腸桿菌對苯酚的抗藥性增強[8]。多藥物外排泵能外排有機溶劑、氧化劑及細菌產(chǎn)生的有害代謝物，并且能外排多種抗生素[9]。研究表明acrR基因的缺失會造成細菌致病性、運動性、耐藥性以及生物膜等表型變化，表明在細菌生長代謝中AcrR蛋白具有多重功能[10]。

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)隸屬弧菌科氣單胞菌屬，是革蘭氏陰性桿菌，其普遍存在于自然環(huán)境中[11]。作為一種新型水生動物病原菌，維氏氣單胞菌主要感染諸如錦鯉、草魚等經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類，可導(dǎo)致其大量死亡[12]。這些年有關(guān)其感染人的病例也有逐年增多的趨勢，人食用了維氏氣單胞菌菌株污染的水產(chǎn)品、蔬菜時可引發(fā)腹瀉、敗血癥、心內(nèi)膜炎等[13]。本研究以AcrAB-TolC多藥外排泵為切入點，構(gòu)建acrR基因敲除菌株，對其生長特性及生物膜成膜特性進行初步研究，試圖解析維氏氣單胞菌的致病機制及耐藥機理。研究結(jié)果對于防治重要水產(chǎn)病害、促進水產(chǎn)經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及引物

自殺質(zhì)粒pRE112以及大腸桿菌WM3064菌株(Escherichiacoli,WM3064)、維氏氣單胞菌C4菌株(A.veronii, C4)均由本實驗室提供。本實驗用到的驗證及擴增引物序列信息如表1所示，由上海生物工程股份有限公司提供測序及引物合成。

表1 本實驗使用的引物序列

1.1.2 試劑盒、酶及藥品

細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；2×PCR Mix、質(zhì)粒提取試劑盒及DNA/膠純化試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；T4連接酶、T4連接酶Buffer、BstX I、KpnI-HF和SacI-HF限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；氯霉素(Cam)、氨卞青霉素(Amp)、二氨基庚二酸(Dap)及瓊脂粉購自索萊寶科技有限公司；蛋白胨、酵母提取物及氯化鈉均購自西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1acrR基因上、下游同源序列擴增

用相應(yīng)試劑盒提取維氏氣單胞菌C4的基因組DNA，隨后以其為模板，分別用acrR F1/R1和acrR F2/R2擴增目的片段。按照基因組DNA 1 μL，2×PCR Mix 13 μL，上或下游引物各1 μL，ddH2O 10 μL的體系配制好溶液后，再進行如下PCR程序：95 ℃ 預(yù)變性 8 min；95 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 60 s，25 cycles；72 ℃ 再延伸 10 min。

1.2.2 pRE112-ΔacrR載體構(gòu)建

首先用質(zhì)粒提取試劑盒獲得自殺質(zhì)粒pRE112，在37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育經(jīng)KpnⅠ-HF和ScaⅠ-HF內(nèi)切酶處理過的酶切產(chǎn)物30 min，隨后用純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物。在37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育經(jīng)BstXⅠ內(nèi)切酶處理過的酶切產(chǎn)物30 min，再用純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物。按以下連接體系(10 μL)：pRE112載體酶切產(chǎn)物(12 ng/μL) 5.0 μL、acrR上/下游同源臂酶切產(chǎn)物(60 ng/μL)各1 μL，10×T4 Buffer 1 μL，T4連接酶1 μL，ddH2O 1 μL，將質(zhì)粒酶切產(chǎn)物與片段酶切產(chǎn)物在22 ℃下體外連接2 h。吸取1 μL上述連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到E.coliWM3064感受態(tài)細胞中，在37 ℃下于含有Dap和Cam的抗性平板中培養(yǎng)，隔天挑菌驗證陽性克隆。

1.2.3 雙親接合及acrR基因敲除菌株的篩選

將維氏氣單胞菌C4于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，并將攜帶有pRE112-ΔacrR質(zhì)粒的大腸桿菌WM3064于含Dap和Cam的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)的菌分別轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，將維氏氣單胞菌C4和大腸桿菌WM3064按1∶1、1∶3和1∶7的比例混合至終體積為800 μL。6 000 r/min離心3 min 后除去大部分上清液，將剩余菌液混勻后滴于含有DAP的LB平板上，30 ℃ 倒置培養(yǎng)24 h后，在平板上滴加1 mL液體LB培養(yǎng)基并用涂布棒將長出的菌落刮下，取100 mL菌液涂布于含有Cam和Amp的雙抗平板上，待菌落長出后PCR驗證接合結(jié)果。將接合成功的維氏氣單胞菌C4于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取100 μL涂布于含有22%蔗糖和Amp的LB固體培養(yǎng)基上30 ℃倒置培養(yǎng)16 h。菌落PCR驗證敲除菌株。

1.2.4 生長曲線測定

挑取野生型維氏氣單胞菌C4和ΔacrR菌株的單菌落，在含Amp的LB液體培養(yǎng)基中30 ℃，150 r/min振蕩過夜培養(yǎng)，次日轉(zhuǎn)接菌液于含Amp的新鮮LB培養(yǎng)基中至終濃度OD600為0.02，每間隔1 h取樣，分別測定培養(yǎng)菌的OD600數(shù)值，然后繪制野生型維氏氣單胞菌C4和ΔacrR菌株的生長曲線。

1.2.5 生物膜測定

在24孔聚苯乙烯培養(yǎng)板中每孔添加1 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基，按OD600為0.01分別接種過夜培養(yǎng)的野生型維氏氣單胞菌C4及ΔacrR的菌液，30 ℃靜置孵育24 h；將培養(yǎng)液吸出，每孔加入1 mL無菌PBS緩沖液沖洗；再向每孔中加入1 mL甲醇處理20 min，隨后將培養(yǎng)孔中殘余的甲醇吸出；向每孔中加入1 mL 0.5%結(jié)晶紫溶液，染色10 min；吸出培養(yǎng)孔中的結(jié)晶紫染色液后，用流水把殘余的染料沖凈；隨后將培養(yǎng)板倒置在濾紙上以便除去殘余的水分，并于37 ℃烘箱中徹底烘干水分；再向每孔加入1 mL 33%醋酸溶液，在37 ℃下反應(yīng)30 min以溶解結(jié)晶紫；用酶標(biāo)儀測定培養(yǎng)孔中溶液的OD570值。

2 結(jié)果與分析

2.1 pRE112-ΔacrR載體的構(gòu)建

以野生型維氏氣單胞菌C4(WT)基因組DNA為模板，PCR擴增得到acrR上、下游同源臂片段。凝膠電泳結(jié)果顯示，acrR上游同源臂和下游同源臂的PCR產(chǎn)物均在300 bp左右，而且PCR產(chǎn)物條帶單一、明亮(圖1)。acrR上游同源臂長度為304 bp，acrR下游同源臂片段長度為311 bp，表明目的產(chǎn)物擴增成功。

M: DL5000 DNA Marker; 1: acrR上游同源臂; 2: acrR下游同源臂

將提取的pRE112質(zhì)粒以及PCR擴增得到的acrR上、下游同源臂片段分別進行酶切，然后用T4連接酶22 ℃孵育2 h，通過電轉(zhuǎn)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌WM3064感受態(tài)細胞，并涂布于氯霉素抗性板中用于篩選，次日隨機挑選單菌落，然后使用載體驗證引物pRE112F/R進行菌落PCR擴增驗證，并用空載體pRE112為模板作為陽性對照，以篩選陽性克隆。結(jié)果顯示，空載體pRE112的PCR產(chǎn)物長度約為500 bp, 驗證片段大小約為1 100 bp (圖2)，說明pRE112-ΔacrR載體構(gòu)建成功。

M: DL5000 DNA Marker; 1～6: pRE112-ΔacrR基因敲除質(zhì)粒菌落PCR產(chǎn)物; 7: 陽性對照; 8: 陰性對照

2.2 雙親接合及ΔacrR菌株的篩選

將上述轉(zhuǎn)入大腸桿菌WM3064中的重組載體pRE112-ΔacrR通過雙親接合實驗轉(zhuǎn)入到野生型維氏氣單胞菌中，在含Cam和Amp的雙抗平板上篩選陽性菌株，并用載體驗證引物pRE112F/R進行菌落PCR擴增驗證。結(jié)果顯示，擴增條帶大約為1 100 bp，pRE112-ΔacrR載體質(zhì)粒已經(jīng)成功接合至維氏氣單胞菌中(圖 3)。然后利用22%蔗糖壓力篩選以獲得陽性突變菌株。使用acrR-F0/R0引物進行菌落PCR，選取野生型維氏氣單胞菌C4基因組PCR產(chǎn)物為陽性對照。結(jié)果顯示，突變株菌落PCR擴增條帶明顯低于野生型維氏氣單胞菌C4的擴增條帶。挑取3個陽性突變株進行PCR擴增，回收PCR產(chǎn)物并送測序，測序結(jié)果顯示ΔacrR菌株構(gòu)建成功(圖 4)。

M: DL5000 DNA Marker; 1～6: PCR驗證產(chǎn)物; 7: 陽性對照; 8: 陰性對照

2.3 ΔacrR敲除對生長的影響

為了探究acrR基因的敲除是否會影響維氏氣單胞菌的生長，分別在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)野生型維氏氣單胞菌C4和ΔacrR菌株，并每隔1 h對OD600值進行測定。結(jié)果顯示ΔacrR菌株同野生型菌株生長速率一致，即acrR基因的敲除不會影響維氏氣單胞菌的生長(圖5)。

M: DL5000 DNA Marker; 1～6: 敲除株驗證PCR產(chǎn)物; 7: 陽性對照; 8: 陰性對照

圖5 野生型維氏氣單胞菌C4及acrR敲除株生長曲線測定

2.4 ΔacrR敲除對生物膜形成的影響

為了探究acrR基因敲除對維氏氣單胞菌生物膜形成的影響，將在24孔板中培養(yǎng)24 h后的野生型維氏氣單胞菌C4及ΔacrR菌株的培養(yǎng)液吸出，經(jīng)PBS洗滌、甲醇固定、0.5%結(jié)晶紫染色、PBS洗滌及33%醋酸染色后，用酶標(biāo)儀測定培養(yǎng)孔中溶液的OD570值。結(jié)果顯示ΔacrR菌株測出的OD570值顯著高于野生型菌株，即敲除acrR基因后，細菌形成生物膜的能力顯著增強(圖 6)。

圖6 野生型維氏氣單胞菌C4及acrR敲除株生物膜形成測定

3 結(jié)論

本研究鑒定了AcrR蛋白對于維氏氣單胞菌生長和成膜能力的影響。通過對野生型菌株及ΔacrR菌株的生長特性分析發(fā)現(xiàn),AcrR蛋白的缺失并不影響維氏氣單胞菌的生長，維氏氣單胞菌株中敲除acrR基因?qū)е戮晷纬缮锬さ哪芰︼@著增加，這一結(jié)果與醫(yī)院不動桿菌acrR基因敲除株的表型一致,暗示AcrR蛋白通過調(diào)控AcrAB外排泵而參與生物膜的形成[10]。本研究結(jié)果為抵抗生物膜形成相關(guān)的病原菌提供了新的研究思路和作用靶標(biāo)。