豬流行性腹瀉病毒蛋白拮抗宿主天然免疫應(yīng)答的研究進(jìn)展

成溫玉 白云 賈懷杰 強(qiáng)桃艷 趙鴻遠(yuǎn) 張博藝 郭曉薈

（1. 安康學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，安康 725000；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046）

腹瀉病是困擾當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一，不僅影響豬群的生產(chǎn)性能、降低飼料轉(zhuǎn)化率和增加養(yǎng)殖成本，而且還會(huì)引起豬只的死亡，干擾豬肉市場(chǎng)的穩(wěn)定性。冠狀病毒是引起豬腹瀉病主要病毒性病原之一，其中以豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的腹瀉病尤為嚴(yán)重，可導(dǎo)致仔豬100%的發(fā)病率和死亡率，患畜主要表現(xiàn)為厭食、嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水等癥狀［1］。自1978年首次在英國(guó)發(fā)現(xiàn)PED以來，全球各大養(yǎng)豬國(guó)家均有報(bào)道且均發(fā)生過爆發(fā)的情況，是當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)重視的豬病之一［2-3］。在我國(guó)，早在1984年就確認(rèn)并分離到PEDV，而在隨后的26年里該病毒僅引起部分豬場(chǎng)零星發(fā)病，直到2010年10月PEDV引起的豬急性腹瀉突然爆發(fā)并迅速席卷全國(guó)，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2-3］。

天然免疫是機(jī)體非特異性抵御病原感染和有害物質(zhì)入侵的第一道防線，并啟動(dòng)和參與獲得性免疫應(yīng)答。天然免疫系統(tǒng)中的多種成分包括模式識(shí)別受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)節(jié)因子、Ⅰ型-III型干擾素（Interferon，IFN）、干擾素刺激基因（Interferonstimulated genes，ISGs）和趨化因子從多個(gè)層面參與并抑制病原的感染。然而，病原在與宿主長(zhǎng)期的相互作用過程中進(jìn)化出一套能夠逃逸和破壞宿主免疫系統(tǒng)的機(jī)制，通過拮抗宿主天然免疫信號(hào)通路的激活，逃逸免疫應(yīng)答，促進(jìn)自身增殖，維持其在宿主體內(nèi)的生存［4］。PEDV具有典型的免疫抑制能力，依賴于自身編碼的免疫拮抗蛋白和隱藏自身病原體相關(guān)分子模式（dsRNA）逃逸宿主的免疫反應(yīng)［5］。研究證實(shí)，PEDV至少編碼10種蛋白參與拮抗宿主天然免疫反應(yīng)，但目前人們對(duì)其逃逸機(jī)制認(rèn)識(shí)不深［6］。為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)PEDV拮抗宿主天然免疫應(yīng)答機(jī)制，深入探究病原的致病機(jī)理，本文就PEDV蛋白如何拮抗宿主天然免疫應(yīng)答進(jìn)行總結(jié)，以期為疫苗的創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。

1 PEDV基因組結(jié)構(gòu)

與其他冠狀病毒科的成員類似，PEDV屬于囊膜病毒，包含單股正鏈RNA基因組，由至少7個(gè)開放閱讀框（Open reading frame，ORF）以5'UTRORF1a-ORF1b-S-ORF3-E-M-N-3'UTR為順序組成近乎28 nt大小的基因組，共編碼2個(gè)多聚蛋白前體（pp1a和pp1ab）、4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（S、E、M和N）和1個(gè)輔助蛋白（ORF3）。其中基因組5'端的ORF1a和ORF1b基因占據(jù)整個(gè)基因組2/3，編碼的兩個(gè)病毒復(fù)制酶多聚蛋白（pp1a和pp1ab）經(jīng)剪切加工后形成16個(gè)成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp1-nsp16），參與病毒RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄；其余靠近3'端的1/3基因組編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白ORF3［7］。值得注意的是，編碼輔助蛋白ORF3的基因位于S基因和E基因之間，屬PEDV特異性基因，與病毒毒力密切相關(guān)［8］。

2 PEDV蛋白抑制宿主天然免疫應(yīng)答

2.1 非結(jié)構(gòu)蛋白

冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白屬于早期蛋白，主要參與病毒RNA的合成。然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，其中nsp1、nsp3、nsp5、nsp7、nsp14、nsp15和nsp16還參與對(duì)宿主免疫調(diào)節(jié)的功能［5-6，8］。在病原感染早期，上述非結(jié)構(gòu)蛋白通過多種方式抑制宿主天然免疫應(yīng)答，為病毒的侵入和復(fù)制創(chuàng)造機(jī)會(huì)。

2.1.1 nsp1 nsp1大小為110個(gè)氨基酸，是pp1a蛋白N端剪切后的產(chǎn)物，僅表達(dá)于α和β冠狀病毒屬的各成員中，但其序列在α和β屬各成員中卻表現(xiàn)出較大的變異性，是種屬特異性基因［9］。PEDV nsp1定位在宿主細(xì)胞的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中，參與病毒基因的表達(dá)［10］。近幾年，多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)nsp1也參與了宿主基因調(diào)節(jié)并逃避宿主免疫應(yīng)答（圖1）。在拮抗宿主干擾素通路中，nsp1依賴于蛋白酶體途徑降解宿主胞核中的CBP蛋白，使得后者不能與IRF3組裝，從而阻礙I型干擾素及其ISGs的表達(dá)［11］。同時(shí)nsp1也能夠抑制III型干擾素IFN-λ的抗病毒活性［12］。研究發(fā)現(xiàn)，在PECDQ，LLC-PK1和MARC-145細(xì)胞中，nsp1通過阻礙IRF1入核，降低細(xì)胞中病毒活化的過氧化物酶體數(shù)量來干擾IFN-λ的產(chǎn)生。進(jìn)一步利用突變體的研究發(fā)現(xiàn)，nsp1干擾IFN-λ產(chǎn)生的能力主要依賴于其序列中保守的氨基酸區(qū)域［12］。同時(shí)，對(duì)同屬α冠狀病毒TGEV nsp1的結(jié)構(gòu)研究證實(shí)，第91-95位氨基酸序列高度保守，是構(gòu)成nsp1蛋白抑制宿主調(diào)控免疫應(yīng)答的主要基序，決定TGEV的毒力［13］。

除拮抗宿主干擾素通路外，nsp1還具有阻礙NF-κB核轉(zhuǎn)移，影響IFN-β及多個(gè)細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-15和IL-17）表達(dá)的能力［14］。在PEDV感染LLC-PK1細(xì)胞早期，促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)受到抑制，nsp1通過靶向干擾IκBα的磷酸化和泛素化，阻礙了p65亞基的核移位，從而切斷NF-κB信號(hào)激活通路，抑制一系列抗病毒細(xì)胞因子的表達(dá)（圖1）。

圖1 PEDV蛋白拮抗宿主天然免疫信號(hào)通路

2.1.2 nsp3 冠狀病毒nsp3是一個(gè)多結(jié)構(gòu)域的大分子蛋白，包含重要的泛素樣結(jié)構(gòu)域和木瓜樣蛋白酶（Papain-like protease，PLpro）結(jié)構(gòu)域，且這些結(jié)構(gòu)域在不同種屬的冠狀病毒成員中存在較大的結(jié)構(gòu)差異。nsp3因其具有PLpro活性，在病毒復(fù)制過程中，參與了病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成，依賴于自身PLpro結(jié)構(gòu)域與nsp5的3CLpro結(jié)構(gòu)域共同完成了對(duì)前體多聚蛋白pp1a和pp1ab的加工［15］。同樣，nsp3拮抗宿主天然免疫應(yīng)答也依賴于其PLpro活性。Xing等［16］研究證實(shí)，PEDV nsp3蛋白借助PLpro的去泛素化活性阻礙STING和RIG-I泛素化，從而干擾STING和RIG-I介導(dǎo)的I型干擾素通路的激活，致使宿主I型干擾素以及ISGs的表達(dá)受阻（圖1）。此外，來自于對(duì)SARS-CoV和TGEV nsp3的研究證實(shí)，nsp3還可通過抑制IκBα的泛素化以及p56的磷酸化阻止NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞因子應(yīng)答反應(yīng)［17］。因此，nsp3抗宿主免疫應(yīng)答主要依賴于其PLpro活性，而nsp3是否具有其他抑制宿主免疫應(yīng)答的機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

2.1.3 nsp5 nsp5是一種具有蛋白水解功能的3C樣蛋白酶（3C-like protease，3CLpro），富含組氨酸和半胱氨酸，在所有冠狀病毒間具有很高的保守型。該蛋白是冠狀病毒的主蛋白酶，通常以二聚體的形式負(fù)責(zé)對(duì)病毒多聚前體蛋白pp1ab進(jìn)行切割形成nsp4-nsp16［18］。除具有切割病毒自身蛋白的功能外，nsp5也能切割宿主蛋白。Wang等［19］起初發(fā)現(xiàn)，nsp5具有降低仙臺(tái)病毒（Sendai virus，SEV）誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)能力的現(xiàn)象，進(jìn)一步研究證實(shí)nsp5能夠靶向切割天然免疫RIG-I/MDA5信號(hào)通路上的重要接頭分子NEMO，從而破壞宿主產(chǎn)生I型干擾素。nsp5依賴于其保守的組氨酸和半胱氨酸催化位點(diǎn)切割NEMO位于第231位的谷氨酸殘基，致使NEMO喪失激活下游信號(hào)分子的能力，阻礙I型干擾素生成（圖1）。同樣，PDCoV的nsp5也能通過切割宿主NEMO抑制IFN-β的產(chǎn)生，且切割位點(diǎn)也位于NEMO的第231氨基酸殘基，這與nsp5在冠狀病毒中具有較高保守性密切相關(guān)［20］。此外，PDCoV的nsp5還能抑制IFN-α介導(dǎo)的ISGs轉(zhuǎn)錄，其通過靶向切割I(lǐng)型干擾素下游JAK-STAT通路中的關(guān)鍵分子STAT2抑制ISGs的表達(dá)，從而拮抗I型干擾素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［21］。盡管nsp5切割STAT2的能力僅存在于PDCoV中，但有研究發(fā)現(xiàn)PEDV能夠抑制感染細(xì)胞中STAT1的表達(dá)。Guo等［22］發(fā)現(xiàn)，PEDV依賴于宿主的泛素蛋白酶系統(tǒng)降解病毒誘導(dǎo)的STAT1，進(jìn)而降低其下游I型干擾素的表達(dá)（圖1）。另外，在PEDV感染的細(xì)胞中出現(xiàn)STAT3被激活的現(xiàn)象，作為負(fù)調(diào)控I型干擾素表達(dá)的JAK2-STAT3通路中關(guān)鍵分子STAT3，其上游的關(guān)鍵性配體——表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal growth factor，EGF）在被PEDV激活的EGFR競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合后處于激活狀態(tài)，導(dǎo)致I型干擾素表達(dá)受阻［23］（圖1）。上述PEDV通過降解STAT1和激活STAT3途徑抑制干擾素表達(dá)的能力已經(jīng)得到充分證實(shí)，但參與調(diào)節(jié)此過程的病毒蛋白尚未明確，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.1.4 nsp7 PEDV非結(jié)構(gòu)蛋白7是一包含83個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，在不同毒株間高度保守，主要定位于細(xì)胞質(zhì)［24］。病毒在復(fù)制過程，nsp7與nsp8形成多聚體復(fù)合物，參與病毒RNA合成和病毒粒子組裝。同時(shí)，多篇文獻(xiàn)證實(shí)nsp7具有調(diào)節(jié)宿主I型干擾素表達(dá)的功能［11，24-25］。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和熒光定量PCR證實(shí)，nsp7能夠抑制IFN-α介導(dǎo)的ISRE啟動(dòng)子活化和ISGs的表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PEDV nsp7通過與宿主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α1（Karyopherin α1，KPNA1）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合STAT1，阻礙了KPNA1與STAT1的相互識(shí)別，導(dǎo)致干擾素刺激因子3（Interferon-stimulated gene factor 3，ISGF3）核轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，從而抑制I型干擾素及其相關(guān)基因的表達(dá)［25］。ISGF3是STAT1、STAT2與IRF9三者形成的復(fù)合體，nsp7除了與STAT1結(jié)合之外，還可以靶向結(jié)合于STAT2的DBD結(jié)構(gòu)域（DNA-binding domain），但并不影響ISGF3的形成［25］（圖1）。

2.1.5 nsp15 nsp15是冠狀病毒的內(nèi)切核糖核酸酶，參與病毒RNA的合成。起初，nsp15被認(rèn)為是病毒復(fù)制復(fù)合體的重要組分，后來的研究發(fā)現(xiàn)其并非在病毒復(fù)制時(shí)所必須，而是在拮抗宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用［26］。Zhang等［11-12］通過雙熒光素報(bào)告酶系統(tǒng)篩選抑制干擾素應(yīng)答功能的PEDV蛋白質(zhì)時(shí)，鑒定出nsp15分別具有抑制Poly（I：C）誘導(dǎo)的IFN-β和IFN-λ激活的功能。Deng等［27］通過反向遺傳技術(shù)建立的PEDV感染性克隆證實(shí)，nsp15必須依賴其內(nèi)切核糖核酸酶活性拮抗宿主I型（IFN-β）和III型干擾素（IFN-λ）應(yīng)答。病毒喪失核糖核酸酶活性后激活細(xì)胞（LLC-PK1）中I型（IFN-β）和III型干擾素大量表達(dá)，導(dǎo)致其在豬上皮細(xì)胞中的增殖能力減弱。同時(shí)，喪失核糖核酸酶活性的PEDV對(duì)仔豬的致病力也顯著降低［27］。然而，針對(duì)PDCoV nsp15的研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白也具有抑制SEV誘導(dǎo)的IFN-β激活的能力，但并非依賴于nsp15核糖核酸酶活性，而是通過靶向抑制NF-κB p65亞基的激活和核移位阻斷下游I干擾素通路的活化，從而拮抗宿主的免疫應(yīng)答［28］。上述研究結(jié)果表明，PEDV和PDCoV依賴于nsp15通過不同形式拮抗宿主天然免疫應(yīng)答，然而我們依然不明確PEDV如何利用nsp15的核糖核酸酶活性發(fā)揮抗宿主I型（IFN-β）和III型干擾素（IFN-λ）應(yīng)答。有文獻(xiàn)推測(cè)，病毒在復(fù)制時(shí)nsp15與其他非結(jié)構(gòu)蛋白在宿主細(xì)胞中構(gòu)成雙膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，包裹病毒RNA以逃避其被宿主核酸識(shí)別受體的識(shí)別［28］，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。

2.1.6 nsp16 冠狀病毒編碼的nsp16是一種2'氧位甲基轉(zhuǎn)移酶，主要參與病毒RNA的合成，其氨基酸序列高度保守，存在Lys-Asp-Lys-Glu（KDKE）四個(gè)一組的氨基酸基序是維持甲基轉(zhuǎn)移酶活性的關(guān)鍵［29］。dsRNA作為RNA病毒復(fù)制過程中的中間產(chǎn)物，其能被宿主模式識(shí)別受體（PPRs）識(shí)別并誘導(dǎo)機(jī)體干擾素應(yīng)答。為了逃避宿主免疫系統(tǒng)對(duì)dsRNA的識(shí)別，冠狀病毒在復(fù)制過程中，借助nsp14的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和nsp16甲基轉(zhuǎn)移酶活性與nsp10協(xié)同作用對(duì)病毒RNA的5'端進(jìn)行加帽反應(yīng)，避免病毒RNA受宿主核酸識(shí)別受體的識(shí)別［29］。針對(duì)PEDV拮抗宿主干擾素的研究發(fā)現(xiàn)，nsp16依賴其甲基轉(zhuǎn)移酶活性通過抑制IRF3磷酸化阻斷RIG-I和MDA5引發(fā)的天然免疫信號(hào)通路發(fā)揮抗宿主免疫反應(yīng)，其保守的KDKE基序是阻礙IFN-β和ISRE啟動(dòng)子激活的關(guān)鍵［30］（圖1）。當(dāng)人為缺失或者突變病毒nsp16的KDKE基序后，病毒誘發(fā)強(qiáng)大的干擾素應(yīng)答反應(yīng)［30］。同時(shí)nsp10具有協(xié)同nsp16抑制宿主I型干擾素應(yīng)答的能力，而nsp10自身卻無此功能，這可能與nsp10參與激活nsp16甲基轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān)［31］。同樣，來自MERS-CoV nsp16的研究也證實(shí)其具有拮抗宿主I型干擾素應(yīng)答的能力，并且突變其保守KDKE基序的病毒對(duì)小鼠具有很好的免疫保護(hù)作用［32］。因此，nsp16可作為疫苗設(shè)計(jì)的良好靶點(diǎn)。

除上述幾種非結(jié)構(gòu)蛋白外，nsp14也被證實(shí)能夠抑制IFN-β啟動(dòng)子活性，nsp8和nsp14具有抑制III型干擾素IFN-λ1啟動(dòng)子活性的能力［11-12］，但其具體的作用機(jī)制尚未見報(bào)道。我們對(duì)nsp14的功能預(yù)測(cè)顯示，其具有外切酶核酸活性和N7甲基轉(zhuǎn)移酶活性。利用反向重組技術(shù)構(gòu)建的缺失N7甲基轉(zhuǎn)移酶活性的PEDV感染細(xì)胞后，病毒的增殖不受影響但對(duì)外源性IFN-β敏感性增加，表明nsp14的N7甲基轉(zhuǎn)移酶活性在抗IFN-β的應(yīng)答中起到關(guān)鍵性的作用（待發(fā)表）。然而目前我們尚未發(fā)現(xiàn)nsp14拮抗宿主I型干擾素應(yīng)答具體機(jī)制。

2.2 結(jié)構(gòu)蛋白

在位于PEDV基因組的3'端，編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，即棘突蛋白S（Spike）、包膜蛋白E（Envelope）、膜蛋白M（Membrane）和核衣殼蛋白N（Nucleocapsid），主要參與病毒構(gòu)成。利用異位表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，其中E、N和M表現(xiàn)出抑制IFN-β和IRF3活性的能力。此外還參與宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和NF-κB激活反應(yīng)。

2.2.1 棘突蛋白S 棘突蛋白S屬于I型糖蛋白，包含S1和S2兩個(gè)亞基并以三聚體的形式存在于病毒粒子表面，決定病毒的宿主范圍和組織嗜性［33］。S1亞基又含有N端區(qū)域（N-terminal domain，S1-NTD）和 C端 區(qū) 域（C-terminal domain，S1-CTD），二 者均屬于PEDV的受體結(jié)合域，其中S1-CTD識(shí)別并特異性結(jié)合宿主受體氨肽酶N（Aminopeptidase N，APN），而S1-NTD則可以與病毒的輔助性受體糖結(jié)合［34］。病毒入侵細(xì)胞時(shí)借助于S蛋白與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合并通過膜融合的形式進(jìn)入胞內(nèi)。盡管利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)未發(fā)現(xiàn)S蛋白具有抑制I型干擾素的能力，然而在PEDV感染的腸細(xì)胞中，S蛋白表現(xiàn)出削弱宿主I型干擾素應(yīng)答的潛能［23］。Yang等［23］發(fā)現(xiàn)，S蛋白能與宿主表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）結(jié) 合并使EGFR激活，活化后的EGFR進(jìn)一步激活下游JAK2-STAT3通路。作為負(fù)調(diào)控I型干擾素表達(dá)的STAT3被激活后，反過來抑制I型干擾素的產(chǎn)生，從而促進(jìn)病毒感染。此外，S1亞基具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力［35］，雖然細(xì)胞凋亡阻礙了病毒復(fù)制并暴露細(xì)胞中的病毒，但同時(shí)也有利于病毒釋放以及逃避宿主胞內(nèi)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

2.2.2 囊膜蛋白E和膜蛋白M E蛋白是由76個(gè)氨基酸組成的分子量約為 8.8 kD最小的結(jié)構(gòu)蛋白，在PEDV出芽過程中扮演重要的角色［36］。該蛋白在病毒感染過程中主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，有研究證實(shí)其能夠通過上調(diào)宿主葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（Glucose-regulated protein 78，GRP78）的表達(dá)誘導(dǎo)感染細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)激活NF-κB活性并上調(diào)炎癥因子IL-8和抗凋亡分子Bcl-2的表達(dá)［37］。據(jù)此，該研究推測(cè)E蛋白通過激活NF-κB上調(diào)IL-8和Bcl-2的表達(dá)分別促進(jìn)細(xì)胞炎性反應(yīng)和限制細(xì)胞凋亡，維持病毒在細(xì)胞中增殖。

膜蛋白M分子量大小約為30 kD，在冠狀病毒中高度保守，定位于整個(gè)宿主細(xì)胞中，主要參與病毒粒子的組裝和出芽。早期研究發(fā)現(xiàn)，PEDV M蛋白可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生IFN-α和特異性抗體，還能介導(dǎo)細(xì)胞融合，因此被作為病毒抗體疫苗的候選靶點(diǎn)［38］。與E蛋白類似，盡管M蛋白不具有拮抗I型和III型干擾素的能力，然而其能夠抑制細(xì)胞周期素A（cyclin A）阻礙腸道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)使其停滯在細(xì)胞周期的S期，暗示病毒可能通過干擾細(xì)胞周期促進(jìn)其增殖［38］。

2.2.3 核衣殼蛋白N N蛋白是所有PEDV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白中表達(dá)最豐富、最保守的蛋白，大小為55-58 kD，主要定位于宿主細(xì)胞胞質(zhì)中，參與病毒基因組轉(zhuǎn)錄和合成、病毒粒子組裝以及宿主應(yīng)激和免疫反應(yīng)［39］。N蛋白作為病毒逃逸宿主免疫應(yīng)答策略的一部分，具有拮抗I型和III型干擾素的能力。利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，異位表達(dá)的N蛋白分別具有抑制SEV誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生和poly（I：C）誘導(dǎo)的IFN-λ3的啟動(dòng)子活性，同時(shí)還能抑制轉(zhuǎn)錄因子IRF3和NF-κB的激活［11-12］（圖1）。作為RIGI/MDA5介導(dǎo)I型干擾素通路中的關(guān)鍵蛋白，TBK1受到N蛋白的靶向作用，從而阻斷了TBK1對(duì)IRF3的激活，造成下游IFN-β和ISGs表達(dá)受阻［40］。在抑制IFN-λ3表達(dá)的通路中，N蛋白被發(fā)現(xiàn)能夠阻止IPEC-J2細(xì)胞中NF-κB和IRF3的激活，因此N蛋白有可能通過抑制NF-κB和IRF3的激活破壞IFN-λ3對(duì)病毒的應(yīng)答［41］。同樣，在Zhang等［12］對(duì)PEDV蛋白抑制III型干擾素表達(dá)的篩選研究中，也發(fā)現(xiàn)N蛋白具有拮抗IFN-λ1活性的能力，但其具體機(jī)制尚未深入研究。

然而，與上述N蛋白抑制NF-κB激活的現(xiàn)象相反，Cao等［42］發(fā)現(xiàn)在IECs細(xì)胞中過表達(dá)PEDV的N蛋白能顯著激活NF-κB，且NF-κB的激活活性依賴于N蛋白的表達(dá)劑量和蛋白的中間序列，N蛋白對(duì)NF-κB的激活能力主要依靠宿主TLR2信號(hào)通路的參與（圖1）。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)TLR3和TLR9也參與了PEDV誘導(dǎo)的NF-κB激活，但其具體機(jī)制未見報(bào)道。此外，Xu等［43］也證實(shí)N蛋白能激活I(lǐng)ECs細(xì)胞中NF-κB并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、上調(diào)IL-8和Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)還能通過降解細(xì)胞周期素A阻礙腸道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)使其停滯在細(xì)胞周期的S期。這與E蛋白的作用相似，很可能N蛋白也是通過限制細(xì)胞凋亡，利于病毒在細(xì)胞中復(fù)制。另外發(fā)現(xiàn)，N蛋白可穿梭于胞質(zhì)和胞核之間，與核仁磷酸蛋白1（Nucleophosmin，NPM1）存在相互作用［44］。NPM1作為凋亡抑制蛋白，受caspase-3的靶向切割后會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在PEDV感染的過程中，NPM1表達(dá)上調(diào)且過表達(dá)能促進(jìn)PEDV的增殖，盡管N蛋白入核過程不依賴于NPM1的作用，但N蛋白的結(jié)合保護(hù)NPM1免受caspase-3的水解，利于細(xì)胞生存，促進(jìn)病原的增殖［44］。

2.3 輔助蛋白

ORF3作為PEDV唯一的輔助蛋白，大小約為25 kD，與病毒的毒力強(qiáng)弱和復(fù)制密切相關(guān)。對(duì)比野生、細(xì)胞培養(yǎng)株和弱毒疫苗株的ORF3序列發(fā)現(xiàn)，弱毒疫苗株和細(xì)胞培養(yǎng)株出現(xiàn)30-51核苷酸的缺失，因此常被用于強(qiáng)弱毒株診斷的依據(jù)［45］。ORF3主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，部分存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器，其可與S蛋白共定位于感染細(xì)胞中的核周間隙和囊泡狀結(jié)構(gòu)中，且二者存在相互作用調(diào)節(jié)病毒復(fù)制［46］。盡管通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)篩選到ORF3也具有抑制I型（IFN-β）和III型（IFN-λ1）干擾素啟動(dòng)子活性的能力［11-12］（圖1），但對(duì)其抑制IFN-β和IFN-λ1的具體機(jī)制及作用效果并未進(jìn)行深入研究。與結(jié)構(gòu)蛋白M和N相似，ORF3也表現(xiàn)出調(diào)控宿主細(xì)胞周期的能力。Ye等［47］利用構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)ORF3蛋白的Vero細(xì)胞證實(shí)，ORF3通過延長(zhǎng)細(xì)胞周期的S期和促進(jìn)囊泡形成的方式以利于病毒增殖。同時(shí)相比強(qiáng)毒株的PEDV，穩(wěn)定表達(dá)ORF3的Vero細(xì)胞更利于弱毒株的增殖。此外，ORF3還具有抑制PEDV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡功能，利用反向遺傳構(gòu)建的PEDV-ΔORF3感染細(xì)胞后，細(xì)胞活性顯著降低且活化的caspase-3升高，表明缺失ORF3的病毒促進(jìn)了細(xì)胞凋亡［48］。因此，ORF3在病毒感染過程中不僅可以通過抑制I型和III型干擾素的表達(dá)拮抗宿主天然免疫應(yīng)答，而且能夠直接調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡為病毒增殖創(chuàng)造細(xì)胞環(huán)境。

3 PEDV拮抗宿主免疫的其他方式

PEDV除了利用上述蛋白拮抗宿主免疫應(yīng)答外，還采用其他方式逃逸宿主的免疫反應(yīng)。絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路是機(jī)體調(diào)控胞內(nèi)外信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵，其通路中的關(guān)鍵元件包括胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（Extracellular signal-regulated kinases，EKR）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）和p38。研究發(fā)現(xiàn)，PEDV在感染過程中能激活MAPK通路中的EKR和p38促進(jìn)病毒復(fù)制，而被激活的EKR和p38并不能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞周期停滯和凋亡反應(yīng)［49］（圖1）。鑒于PEDV和ORF3蛋白均具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，因此，盡管PEDV能激活EKR和p38但不誘發(fā)細(xì)胞凋亡反應(yīng)，這是病毒調(diào)控宿主反應(yīng)的綜合結(jié)果，而PEDV是如何激活EKR和p38并促進(jìn)自身增殖有待進(jìn)一步探究。

除了RIG-I和MDA5受體及其信號(hào)通路受到PEDV調(diào)控外，TLRs家族中的TLR3、TLR4和TLR7-TLR9及其下游關(guān)鍵分子TRIF、MyD88和TRAF6在病毒感染仔豬早期時(shí)（4 dpi）表達(dá)受到抑制，進(jìn)而阻礙新生兒Fc受體（Neonatal Fc receptor，F(xiàn)cRn）表達(dá)及IgG的分泌［50］。同樣，在對(duì)比S基因變異毒株（S-INDEL strain）和非變異毒株（non-SINDEL strain）對(duì)仔豬免疫應(yīng)答的影響研究中發(fā)現(xiàn)，仔豬腸黏膜中TLR3、TLR4、TLR7-TLR9、TRIF、MyD88和TRAF6的表達(dá)也明顯受到抑制，且這些基因的表達(dá)在非變異毒株感染的仔豬中被下調(diào)的幅度最大，暗示S蛋白在抑制宿主TLRs信號(hào)通路中發(fā)揮作用［51］。HSP27是參與IFN-β及其下游ISGs表達(dá)的重要分子，通過激活NF-κB促進(jìn)細(xì)胞中IFN-β及其下游ISGs轉(zhuǎn)錄，具有抗病毒感染的作用。PEDV在Marc-145細(xì)胞中增殖過程表現(xiàn)出對(duì)HSP27的抑制功能，從而降低IFN-β及其下游ISGs的表達(dá)，逃避宿主抗病毒應(yīng)答［52］。

4 總結(jié)與展望

病毒與宿主之間的相互作用像是二者之間的一場(chǎng)“軍備競(jìng)賽”，病毒為了生存依賴于自身編碼的蛋白隱藏病原相關(guān)分子模式（PAMPs）逃避并直接阻礙宿主的免疫應(yīng)答。豬細(xì)胞中的TLRs和RLRs能夠識(shí)別PEDV在增殖過程中釋放的基因組RNA以及形成的核酸中間物并激活天然免疫抗病毒途徑，產(chǎn)生I型、III型干擾素和大量的ISGs。然而，PEDV編碼的10余種蛋白能夠通過兩種方式拮抗宿主干擾素應(yīng)答：（1）靶向作用于干擾素通路中的多個(gè)信號(hào)分子阻斷I型和III型干擾素產(chǎn)生，甚至直接抑制干擾素下游ISGs的生成；（2）借助于病毒蛋白的酶活性修飾RNA結(jié)構(gòu)，逃避宿主對(duì)其PAMPs的識(shí)別。此外，病毒還通過調(diào)控宿主細(xì)胞以延長(zhǎng)細(xì)胞周期或阻礙感染細(xì)胞的凋亡為自身增殖創(chuàng)造細(xì)胞環(huán)境，而隨著細(xì)胞中病毒粒子增加以及相關(guān)凋亡信號(hào)的累積，細(xì)胞不得不啟動(dòng)凋亡時(shí)，又為病毒的釋放和擴(kuò)散創(chuàng)造了條件。因此，PEDV不僅通過阻礙免疫應(yīng)答拮抗宿主的清除，還可調(diào)控宿主細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡反應(yīng)方便自身增殖。

盡管PEDV基因組結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，除了已知參與調(diào)控宿主免疫應(yīng)答的蛋白之外，其他非結(jié)構(gòu)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白以及基因組兩端UTR序列是否具有拮抗和調(diào)控宿主天然免疫應(yīng)答的潛力；nsp8和nsp14拮抗I型和III型干擾素應(yīng)答的具體機(jī)制是什么；它們對(duì)病毒的毒力有何影響；病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與天然免疫應(yīng)答以及凋亡抑制之間有何關(guān)系；PEDV感染引起宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和自噬的機(jī)制是什么。因此，從宿主免疫學(xué)的角度出發(fā)，探究病毒編碼蛋白對(duì)宿主的免疫調(diào)節(jié)作用有助于認(rèn)識(shí)病毒與宿主相互作用關(guān)系，同時(shí)對(duì)疫苗的創(chuàng)制和疾病防控具有重要的指導(dǎo)意義。