李霞 杜娟 楊曉夢 普曉英 楊加珍 曾亞文

摘要：對云南省高抗性淀粉特種稻品系及功米系列品種進(jìn)行SSHla基因已報(bào)道剪接位點(diǎn)SNP檢測，結(jié)果顯示，云南省高抗性淀粉材料未出現(xiàn)已報(bào)道的剪接位點(diǎn)SNP突變。進(jìn)一步對云南高抗性淀粉特種稻SSllla基因的序列進(jìn)行遺傳變異分析，共發(fā)現(xiàn)SNP遺傳變異位點(diǎn)59個(gè)，插入缺失變異位點(diǎn)6個(gè)。其中，分布于基因編碼區(qū)域的SNP位點(diǎn)18個(gè)，非同義變異12個(gè)。分析這些非同義變異位點(diǎn)在6份高抗性淀粉特種稻材料與云南省地方對照品種的差異，結(jié)果顯示6份高抗性淀粉特種稻材料與對照品種的差異，主要為秈粳稻之間的差異，只有功米2號(hào)存在SNP特異性變異。

關(guān)鍵詞：SSIlla基因;抗性淀粉;水稻;遺傳變異

中圖分類號(hào)：S511

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（ 2020） 20-0035-04

D01：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.20.008

隨著飲食習(xí)慣和生活方式的改變，Ⅱ一型糖尿病的發(fā)病人數(shù)逐年增加[1]。研究表明，合理增加抗性淀粉的攝取量，可有效控制體重，具有潛在預(yù)防慢性病的功效[2，3]。水稻是全球1/3以上人口的主食，水稻品種間血糖指數(shù)GI值變幅為48-93，是開發(fā)預(yù)防糖尿病及降低餐后血糖主食的重要來源[4，5]。目前，國內(nèi)已培育出一些高抗性淀粉含量水稻品種，如云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的功米3號(hào)[6]，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院的降糖稻1號(hào)[7]，浙江大學(xué)培育的突變體RSlll[8]。雖然高抗性淀粉水稻已有一定規(guī)模的應(yīng)用，但對其遺傳機(jī)制的研究卻較少。有研究表明，SSIlla基因剪接位點(diǎn)的SNP突變可以導(dǎo)致水稻子?？剐缘矸酆康纳遊9]。同時(shí)，SSllla基因在不同水稻材料基因組中較其他淀粉合成相關(guān)基因表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，是淀粉合成酶類中最多樣化的基因[10]。因此，本研究對云南省高抗性淀粉特種稻品種功米系列及2份高抗性淀粉品系進(jìn)行SSllla基因的同源克隆，并對其基因序列進(jìn)行比較分析，以期通過上述檢測，明確SSllla基因在云南省高抗性淀粉特種稻的遺傳變異，為下一步云南省高抗性淀粉特種稻的育種工作提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所功能食品作物團(tuán)隊(duì)選育高抗性淀粉水稻功米系列品種及品系，共計(jì)6份（抗性淀粉含量>3%），分別為功米2號(hào)、功米3號(hào)、功米4號(hào)、功米5號(hào)、17SM36、17SM37，對照為云南粳稻品種合系35、秈稻品種滇屯502，二者為抗性淀粉含量偏低材料。

1.2方法

1.2.1 DNA提取選取各材料的幼嫩葉片，利用天根生化科技（北京）有限公司植物基因組提取試劑盒（DP320）提取試驗(yàn)材料的基因組DNA，具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。提取后的DNA樣品置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 利用參考基因組SSllla基因序列設(shè)計(jì)特異引物（表1）。以8份材料的基因組DNA為模板，高保真酶I-5TM 2x High-FidelityMaster Mix（TPOOI，北京擎科生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?8℃預(yù)變性2 min;98℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，25℃保存。在1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳產(chǎn)物檢測，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.3 目的片段回收及克隆利用DNA凝膠回收試劑盒（CE0101-50型）對目的片段進(jìn)行回收，將回收片段連接到pClone007載體上（007VS型），轉(zhuǎn)化感受態(tài)TreliefrM 5a Chemically Competent Cell（ TSC01型），進(jìn)行陽性克隆篩選并進(jìn)行PCR鑒定。以上試劑均購于北京擎科生物技術(shù)有限公司，試驗(yàn)操作均按照上述試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4

SSllla序列分析對鑒定的陽性克隆送樣測序，每個(gè)樣品送3個(gè)陽性克隆，測序由北京擎科生物技術(shù)有限公司實(shí)施。序列分析利用DNAstar軟件完成。Blast分析通過NCBI（ http：//www. ncbi.nlm. nih.gov/）在線進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 已報(bào)道SSHla基因剪接位點(diǎn)SNP突變檢測

利用已報(bào)道的CAPS標(biāo)記，對云南省高抗性淀粉特種稻進(jìn)行SSllla基因第六外顯子剪接位點(diǎn)SNP突變檢測。通過MluCl內(nèi)切酶對合系35、功米2號(hào)、功米3號(hào)、功米4號(hào)、功米5號(hào)、17SM36、17SM37、滇屯502進(jìn)行酶切反應(yīng)檢測。結(jié)果如圖1所示，6份高抗性淀粉特種稻材料不能被MluCl內(nèi)切酶切開，說明這6份材料并未發(fā)生相應(yīng)的SNP變異，也未產(chǎn)生新的MluCl酶切位點(diǎn)。

2.2 SSIHa基因在高抗性淀粉特種稻的遺傳變異

結(jié)合參考基因組序列信息，通過對6份云南省高抗性淀粉特種稻材料及對照品種的SSllla基因序列的遺傳變異分析，共計(jì)發(fā)現(xiàn)了66個(gè)變異位點(diǎn)，其中SNP變異位點(diǎn)59個(gè)，41個(gè)位于內(nèi)含子及基因上游區(qū)域，18個(gè)SNP突變位點(diǎn)位于外顯子區(qū)域（表2）。同時(shí)，位于外顯子區(qū)域的SNP位點(diǎn)中有同義突變6個(gè)，非同義突變12個(gè)。除了上述的SNP的變異外，還發(fā)現(xiàn)了6個(gè)插入/缺失突變，1個(gè)在基因上游序列出現(xiàn)，其他均位于內(nèi)含子區(qū)域（表2）。

2.3 SSHla基因在高抗性淀粉特種稻與對照品種的差異分析

通過對6份云南省高抗性淀粉特種稻材料及對照品種的SSllla基因全長序列與參考基因組序列的遺傳變異分析，共計(jì)發(fā)現(xiàn)12個(gè)非同義突變位于外顯子區(qū)域。由于編碼區(qū)的非同義突變可能會(huì)引起蛋白質(zhì)功能的改變，因此重點(diǎn)分析了上述12個(gè)SNP變異位點(diǎn)在2個(gè)對照品種與高抗性淀粉特種稻之間的差異。結(jié)果（表3）顯示，功米3號(hào)及17SM36與對照秈稻品種滇屯502基因型在這12個(gè)SNP位點(diǎn)上表現(xiàn)出了完全相同的基因型。功米4號(hào)、功米5號(hào)及17SM37基因型與粳稻品種合系35在這12個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)出很高的相似性，只在5353483、5353812、5355663、5357570這4個(gè)位點(diǎn)上與滇屯502有一致的基因型，推測這些差異可能來源于秈粳雜交的結(jié)果。功米2號(hào)在5353162、5353784、5353826位點(diǎn)上表現(xiàn)出與2個(gè)對照品種不同的基因型差異。同時(shí)，6份高抗性淀粉特種稻材料在5353319、5353685、5354337、5354415這4個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)出了秈粳稻之間的差異。

3 討論

隨著中國大健康產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展及人民生活水平的提高，人們的營養(yǎng)保健意識(shí)不斷增強(qiáng)。抗性淀粉作為安全健康的新型功能性食品，越來越受到消費(fèi)者的青睞。水稻作為中國人口的主糧，開展高抗性稻米的基礎(chǔ)研究和種質(zhì)資源的選育意義重大[11]。目前，已克隆的水稻子粒中影響抗性淀粉含量的基因包括SSllla和SEB[9，12]，二者都屬于淀粉合成酶基因。本研究對云南省抗性淀粉含量較高的功能稻米品種及品系SSfffa基因的序列分析顯示，功米3號(hào)、功米4號(hào)、功米5號(hào)及17SM36品系與對照品種SSllla基因序列基本一致，編碼區(qū)域的12個(gè)非同義突變也只在秈粳稻之間存在差異，基本確定上述5份高抗性淀粉材料的抗性淀粉升高與SSllla基因的變異無關(guān)。功米2號(hào)在5353162、5353784、5353826位點(diǎn)上表現(xiàn)出與其他7份材料不同的基因型差異。由于其他5份高抗性淀粉材料的基因型完全一致，并且以上3個(gè)位點(diǎn)與2個(gè)對照表現(xiàn)出相同的基因型，因此推測這些位點(diǎn)可能并不影響抗性淀粉的含量。此外，由于功米2號(hào)是其中惟一的有色米材料，以上3個(gè)差異也可能與其特殊的種皮顏色有關(guān)?；谝陨辖Y(jié)果推測，云南省高抗性淀粉特種稻抗性淀粉含量的升高，可能與SSllla基因的遺傳變異沒有直接的相關(guān)性。研究表明，作物抗性淀粉含量與直鏈淀粉的比例呈正相關(guān)[13.14]，而GBSSI編碼的Wx蛋白質(zhì)對水稻直鏈淀粉含量有積極影響[15]。由此說明，除了淀粉合成基因SSllla和SEB對抗性淀粉含量有影響外，其他淀粉合成基因也可能影響抗性淀粉含量。目前，參與淀粉合成的酶類主要有6大類，分為可溶性淀粉合成酶（Soluble starch syn-thase）、淀粉分支酶（Starch branching enzyme）、淀粉脫支酶（ Debranching enzyme）、顆粒結(jié)合淀粉合酶（ Granulebound starch synthase）、ADP葡萄糖焦磷酸化酶（ AGPase）和質(zhì)體淀粉磷酸化酶（Pho）[16.17]。已有報(bào)道顯示，淀粉合成相關(guān)酶類的遺傳變異對水稻淀粉的物理特性有不同程度的影響[18]，因此，后續(xù)試驗(yàn)將對云南省高抗性淀粉特種稻在其他淀粉酶合成基因的遺傳變異進(jìn)行深入分析，探究其與云南省高抗性淀粉特種稻之間的關(guān)系，以期為云南省高抗性淀粉特種稻形成的遺傳基礎(chǔ)研究提供線索。

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作者簡介：李霞（1981-），女，河南獲嘉人，助理研究員，博士，主要從事功能作物分子育種研究，（電話）15398480628（電子信箱）lixia_napus@163.com;通信作者，曾亞文，男，二級(jí)研究員，博士，主要從事功能作物育種研究，（電子信箱）zengyw1967@ 126.com，