劉曉柱，張遠林，曾爽，黎華，張松，黃名正

（貴州理工學(xué)院，貴州貴陽550003）

葡萄酒的發(fā)酵是一個復(fù)雜的多菌種參與的過程，酵母菌在其中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。根據(jù)酵母菌株酒精產(chǎn)能差異，將酵母菌分為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和非釀酒酵母（non-Saccharomyces yeast）兩大類[2]。釀酒酵母酒精代謝能力強，發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的乙醇[3]。非釀酒酵母主要在發(fā)酵前期發(fā)揮作用，其產(chǎn)生的甘油、酸類、酯類、醛類、高級醇等次級代謝物，決定著葡萄酒的復(fù)雜度和豐富性，最終影響葡萄酒的品質(zhì)，使得葡萄酒具有獨特的典型性[4]。因而，采用不同酵母菌株釀造的葡萄酒品質(zhì)具有差異性。然而，酵母菌的分布具有地域時空性，分析特定品種、特定地域的酵母菌株多樣性，對進一步開發(fā)利用酵母菌資源具有重要的意義[5]。

陽光玫瑰（Shine Muscat），鮮食葡萄的一種，為“安蕓津21號”與“白南”兩個品種的雜交后代，屬于歐美雜交品種，被稱為葡萄界的“愛馬仕”[6]。該品種果肉脆硬，糖度高達18%以上，玫瑰香味濃郁，無核，營養(yǎng)豐富以及獨特的風(fēng)味特點，深受廣大消費者的喜愛[7]。此外，該品種還具有抗病性較強，果實不易裂，耐貯運等優(yōu)點[8]。目前在我國西北地區(qū)[9]、華北地區(qū)[10]、中部地區(qū)[11]以及南部地區(qū)[12]均有廣泛種植。

目前國內(nèi)外，對葡萄酵母菌的研究主要集中在釀酒葡萄品種，對于鮮食葡萄酵母菌資源的研究和開發(fā)程度還比較低，更未見有對陽光玫瑰葡萄中酵母菌多樣性以及釀酒特性的研究報道。因此，本研究采用傳統(tǒng)的分離方法，并結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，對陽光玫瑰葡萄酵母菌資源多樣性進行分析。并從糖發(fā)酵性能、生長特性、糖耐受性、酒精耐受性、二氧化硫耐受性以及酸耐受性等方面分析酵母菌的釀酒特性，對生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)葡萄酒提供潛在優(yōu)質(zhì)酵母菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

陽光玫瑰葡萄：2018年9月采自貴州省開陽縣禾豐霖葡萄莊園。采集大小均一，無病害的葡萄樣品，帶至實驗室，進行酵母菌的分離。

1.1.2 試劑

賴氨酸固體培養(yǎng)基、酵母提取物蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）、WL 培養(yǎng)基（wallerstein laboratory nutrient agar，WL）、亞硫酸鉍、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉：貴州博奧瑞杰生物科技有限公司；對硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D glucopyranoside，p-NPG）：中國上海源葉生物公司；ZYMAFLORE X16（簡稱X16）釀酒酵母：法國LAFFORT公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器設(shè)備

紫外分光光度計（UH5300）：日本日立公司；pH儀（雷磁PHSJ-3F）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；倒置顯微鏡（CKX41）：日本OLYMPUS公司；體視顯微鏡（SZM）：中國寧波舜禹儀器有限公司；PCR儀（Biorad T100TM）：美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離

參考徐建坤等[13]、劉小珍等[14]方法進行陽光玫瑰葡萄酵母菌的分離。取2 g陽光玫瑰葡萄皮，裝于含100 mL已滅菌的YEPD液體培養(yǎng)基中，28℃，160 r/min搖床培養(yǎng)，富集培養(yǎng)48 h后取培養(yǎng)液，按照梯度稀釋法，進行梯度稀釋，稀釋液取 10-4、10-5、10-63個梯度，涂布在YPD固體培養(yǎng)基上，28℃，培養(yǎng)48 h。然后挑取每個平板上的單克隆，多次劃線于YPD固體培養(yǎng)基上，直至獲得純的單克隆為止。

1.3.2 菌株鑒定

挑取YPD培養(yǎng)基上分離的單克隆，繼續(xù)劃線于賴氨酸培養(yǎng)基上，28℃，培養(yǎng)72 h，根據(jù)賴氨酸培養(yǎng)基上菌落長勢特點，進行初步分類。

挑取YPD培養(yǎng)基上分離的單克隆，繼續(xù)劃線于WL固體培養(yǎng)基上，28℃，培養(yǎng)72 h，根據(jù)WL培養(yǎng)基上菌落的顏色、形態(tài)、光澤等表型，進一步進行分類采用體式顯微鏡進行菌落特征的拍照。

對WL培養(yǎng)基上分類的菌株，挑選出代表菌株，進行結(jié)晶紫染色，于光學(xué)顯微鏡下，觀察細胞形態(tài)，并拍照。

挑取WL培養(yǎng)基上代表菌株，YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，參考Holm C等方法[15]提取酵母菌DNA，并進行26S rDNA D1/D2區(qū)域的聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR反應(yīng)體系為：25 μL Taq PCR Master Mix（2×），2 μL 的 NL1 引物（10 μmol），2μL 的NL4 引物（10 μmol），DNA 100 ng，反應(yīng)總體積 50 μL。PCR結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液5 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳進行擴增產(chǎn)物的檢測。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST同源序列搜索比對。

1.3.3 菌株釀造學(xué)特性分析

1.3.3.1 生長曲線測定

將鑒定出的各類酵母代表性菌株以108cfu/mL接種至YPD液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)，每間隔4 h取樣一次，平行重復(fù)3次，在600 nm波長處分別測定菌液OD值。取樣時間40 h，共計取樣10次。根據(jù)每個時間點及測定的OD600nm值繪制菌株生長曲線。

1.3.3.2 糖發(fā)酵試驗

將各供試菌株分別以108cfu/mL接種于含終濃度為2%葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖的0.6%的酵母浸粉溶液中，酵母浸粉溶液置于含杜氏小管的試管中，28℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察此間杜氏小管頂部是否有氣泡。若有氣泡產(chǎn)生，記為“+”（陽性反應(yīng)），反之，則記為“-”（陰性反應(yīng)）。

1.3.3.3 生理耐受性測定

葡萄糖耐受性：將各供試菌株以108cfu/mL接種于含葡萄糖質(zhì)量濃度分別為 100、150、200、250、300 g/L 的YPD液體培養(yǎng)基中，平行重復(fù)3次，28℃、180r/min培養(yǎng)34 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在600nm波長處分別測定菌液OD值。

酒精耐受性：將各供試菌株以108cfu/mL接種于含酒精體積分數(shù)分別為3%、6%、9%、12%、15%的YPD液體培養(yǎng)基中，平行重復(fù)3次，28℃、180r/min培養(yǎng)34h。培養(yǎng)結(jié)束后，在600 nm波長處分別測定菌液OD值。

SO2耐受性：將各供試菌株以108cfu/mL接種于含SO2質(zhì)量濃度分別為 50、100、150、200、300 mg/L 的 YPD 液體培養(yǎng)基中，平行重復(fù)3次，28℃、180 r/min培養(yǎng)34 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在600 nm波長處分別測定菌液OD值。

酸耐性：將各供試菌株以108cfu/mL接種于含檸檬酸酸度分別為1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的YPD液體培養(yǎng)基中，平行重復(fù)3次，28℃、180 r/min培養(yǎng)34 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在600 nm波長處分別測定菌液OD值。

1.3.3.4 β-葡萄糖苷酶測定

采用對硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷（p-NPG）法分各供試菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力[16]。將各供試菌株以106cfu/mL接種于YPD培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min培養(yǎng)72 h，取發(fā)酵液于離心管中，4℃、8 000 r/min，離心10min，上清液作為粗酶液。取100μL粗酶液與200μL 35 mmol/L p-NPG混勻，40℃保溫30 min，加入2 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，平行重復(fù)3次，400 nm波長處測定OD。酶活力單位（U）定義為：50℃、pH 5.0條件下，1 min水解p-NPG產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚所需酶量。

1.3.3.5 硫化氫測定

取10 μL濃度為108cfu/mL的各供試菌株的菌液滴加至亞硫酸鉍培養(yǎng)基表面上的無菌濾紙片上，液體完全吸收后，28℃倒置培養(yǎng)5 d，觀察濾紙片變色情況。菌株產(chǎn)硫化氫能力由高到低，顯色情況分別為顯棕黑色、棕色、墨綠色、淡墨綠色及不顯色。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excell 2007對數(shù)據(jù)進行整理和作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準差表示。AdobePhotoshopCS輔助作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株的分離與鑒定

從YPD液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)液中，共分離到72株微生物菌株，編號為YM1～YM72，結(jié)合其在YPD培養(yǎng)基上的形態(tài)特征，初步鑒定46株為酵母菌。

46株酵母菌株劃線于賴氨酸培養(yǎng)基上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基本上不生長。繼續(xù)將這46株酵母菌株劃線于WL培養(yǎng)基上，其形態(tài)特征見表1和圖1。

表1 酵母菌在WL培養(yǎng)基上菌落形態(tài)Table 1 Morphology of yeasts on WL medium

圖1 各類型代表菌株在WL培養(yǎng)基上的菌落特征和顯微細胞特征Fig.1 Colony characteristics and microscopic cell characteristics of the representative strains from different types on WL medium

所有菌落形態(tài)幾乎為圓形或者橢圓形，菌落顏色多為白色，淡黃色或者綠色（圖1）。選取每一類別中典型菌株1例，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)特點，發(fā)現(xiàn)大部分細胞為檸檬狀、橢圓形或者圓形。

采用分子生物學(xué)方法繼續(xù)對46株酵母菌進行鑒定，結(jié)果表明第一類菌株屬于葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）；第二類酵母屬于盔形畢赤酵母（Pichia manshurica）；第三類屬于季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）；第四類屬于加利福尼亞假絲酵母（Candida californica）；第五類屬于茶葉籽酵母（Meyerozyma caribbica）；第六類屬于異常漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）；第七類屬于拜耳結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces bailii）；第八類屬于尖端假絲酵母（Candida apicola）；第九類屬于 Starmerella bacillaris；第十類屬于西文畢赤酵母（Pichia occidentalis）。

2.2 酵母菌株生長曲線

法測定各菌株的生長曲線。菌株的生長曲線如圖2所示。

由圖2可知，與商業(yè)化釀酒酵母X16相比，YM2、YM21、YM15在整個檢測生長周期內(nèi)，生長速度和菌體濃度均低于X16。YM68在整個生長周期內(nèi)，菌體變化趨勢與X16較為一致。YM3、YM13、YM18和YM50在對數(shù)生長期前，其菌體濃度均低于X16。釀酒酵母X16培養(yǎng)12 h即可達到對數(shù)生長期，YM21在12 h也可達到對數(shù)生長期，但菌體整體濃度要低于X16。YM3、YM18、YM62培養(yǎng)16 h方可達到對數(shù)生長期。

圖2 10株酵母菌生長曲線Fig.2 The growth curve of sugar of 10 yeasts

2.3 酵母菌株糖代謝能力

10株酵母菌糖發(fā)酵試驗見表2。

表2 10株酵母菌糖發(fā)酵試驗Table 2 Results of sugar fermentation tests of 10 yeasts

由表2結(jié)果可知，除了YM2不能利用半乳糖發(fā)酵外，其它所有酵母菌株均可以利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和半乳糖進行發(fā)酵。

2.4 酵母菌株生理耐受性

10株酵母菌糖耐受性結(jié)果見圖3。

圖3 10株酵母菌糖耐受性結(jié)果Fig.3 Results of sugar tolerance tests of 10 yeasts

所有酵母菌株糖耐受性均低于釀酒酵母X16，特別是菌株YM13、YM21和YM50糖耐受性較差。菌株YM62在250 g/L葡萄糖濃度范圍內(nèi)，菌株生長情況與X16較為一致。菌株YM13、YM15、YM68菌體濃度隨著葡萄糖濃度的增加，呈降低趨勢；相反，菌株YM2、YM18、YM21、YM39、YM62 菌體濃度隨著葡萄糖濃度的增加，出現(xiàn)先增加，后降低的趨勢。

10株酵母菌乙醇耐受性結(jié)果見圖4，10株酵母菌二氧化硫耐受性結(jié)果見圖5。

圖4 10株酵母菌乙醇耐受性結(jié)果Fig.4 Results of ethanol tolerance tests of 10 yeasts

由圖4可知，與釀酒酵母X16相比，絕大部分菌株乙醇耐受性較差，乙醇耐受性低于9%。菌株YM39在3%的乙醇濃度處理下，菌株生長較差，YM68可耐受9%的乙醇濃度。

由圖 5 可知，菌株 YM3、YM15、YM18、YM62、YM68對二氧化硫具有較好的耐受性，可耐受300 mg/L的二氧化硫。菌株YM13、YM39、YM50對二氧化硫耐受性相對較差。菌株YM39菌體濃度隨著二氧化硫濃度增加，呈現(xiàn)出增大的趨勢。

10株酵母菌酸耐受性結(jié)果見圖6。

絕大部分菌株對酸具有較好的耐受性，可耐受35 mg/L的檸檬酸處理，但菌株YM21酸耐受性較差。菌株YM39可耐受25 mg/L的檸檬酸處理。

圖5 10株酵母菌二氧化硫耐受性結(jié)果Fig.5 Results of sulfur dioxide tolerance tests of 10 yeasts

2.5 β-糖苷酶產(chǎn)生能力

采用p-NPG顯色法分析10株酵母菌β-糖苷酶產(chǎn)生能力，標(biāo)準曲線方程式為y=21.76x+0.015，R2=0.999，吸光值與對硝基苯酚濃度之間為線性關(guān)系。菌株產(chǎn)β-糖苷酶結(jié)果見表3。

菌株YM21、YM15主要為胞外產(chǎn)酶，胞內(nèi)酶活和細胞壁酶活較低；菌株YM2、YM13胞內(nèi)和胞外酶活都較高；菌株YM18細胞3個部位的產(chǎn)酶均較高；菌株YM68細胞壁的酶活最高。

2.6 硫化氫產(chǎn)生能力

分析10株酵母菌β-糖苷酶產(chǎn)生能力，結(jié)果見圖7。

菌株YM21、YM13濾紙片不顯色，不產(chǎn)硫化氫；菌株YM2、YM18、YM50濾紙片顯棕黑色，產(chǎn)硫化氫能力較強；菌株 YM3、YM15、YM62、YM68 濾紙片顯棕色，且顏色比對照組X16深，因此產(chǎn)硫化氫能力超過X16。

圖6 10株酵母菌酸耐受性結(jié)果Fig.6 Results of acid tolerance tests of 10 yeasts

表3 10株酵母菌β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生能力Table 3 Determination of β-glucosidase production of 10 yeasts mU/mL

3 結(jié)論

陽光玫瑰為日本農(nóng)業(yè)食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究機構(gòu)培育的一種歐美雜交種，其果皮黃綠色，具有濃郁的玫瑰香氣，含糖量也較高。自2006年前后由日本引入中國，并迅速在中國傳播開來。目前，幾乎涵蓋了中國全部省域。作為鮮食葡萄的一種，目前對其研究主要集中在栽培方面，其它方面的研究還幾乎一片空白。本研究，以西南地域的貴州省栽培陽光玫瑰為研究對象，分離并鑒定了其酵母菌群的結(jié)構(gòu)特征，進而分析了菌群的釀酒特性。結(jié)果表明，從陽光玫瑰上酵母菌種類較多，共分離鑒定到10大類，包含漢遜酵母屬（Hanseniaspora sp.）、畢赤酵母屬（Pichia sp.）、假絲酵母屬（Candida sp.）以及威克酵母屬（Wickerhamomyces sp.）等。

菌群釀造學(xué)特性分析結(jié)果表明，陽光玫瑰品種上存在著一些具有較好釀造特性的菌種，如產(chǎn)硫化氫較低的YM21、YM13，β-糖苷酶較高的YM18菌株以及生理耐受性較好的YM68菌株等。但還需從不同水平進行發(fā)酵試驗，以進一步評價其生產(chǎn)性能。本研究首次系統(tǒng)分析了陽光玫瑰酵母種群多樣性，并進一步分析了其釀造特性，為進一步開發(fā)利用陽光玫瑰野生酵母菌資源提供理論參考。