焦 蓉 何鵬飛 王 戈 吳毅歆 王軍偉唐 萍 楊煥文 何月秋

(1云南農業(yè)大學,云南 昆明 650201;2微生物菌種篩選與應用國家地方聯(lián)合工程研究中心,云南 昆明 650201;3紅塔煙草(集團)有限責任公司,云南 玉溪 653100)

內生菌指整個生活史或某個階段生活于植物體內并對植物無不利影響的微生物的總稱,其與植物組成一個穩(wěn)定的自然生態(tài)系統(tǒng),對植物的生長發(fā)育和抗病抗逆等過程產(chǎn)生重要的影響[1-2]。內生菌在植物內的存活和定殖是其發(fā)揮防病和促生作用的前提條件[3-4]。目前用于檢測內生細菌在植物體內定殖的方法包括抗生素標記法、基因標記法、同位素示蹤法、DNA和RNA 探針法、免疫學方法等[5]。報告基因技術的發(fā)展為研究目標微生物與寄主間相互作用及其分布定殖規(guī)律創(chuàng)造了非常有利的條件[6]。綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)具有標記基因片段小,結構穩(wěn)定,操作簡單,無毒無害,激發(fā)熒光不需要外源底物和能量,在多種生物細胞中均可表達應用等優(yōu)點[7],是近年來應用最廣泛的標記分子之一。

由二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)引起的煙草白粉病是煙草生產(chǎn)過程中一種主要的葉部真菌病害,其分布范圍廣且發(fā)病快速,特別是在育苗期間的溫室大棚內,相對高溫高濕環(huán)境使白粉病菌在大棚內迅速擴展,對煙草生產(chǎn)構成了嚴重威脅,并在后期影響煙草的產(chǎn)量和品質[8]。目前生產(chǎn)上煙草白粉病防治主要以化學防治為主,化學防治雖能在一定程度上控制白粉病,但過多依賴化學藥劑會產(chǎn)生病原菌抗藥性、農藥殘留和環(huán)境污染等問題。而通過篩選新的生防因子來防控植物病害不但可以減輕病害,還能促進生態(tài)平衡,是目前植物病害防治研究的熱點[9-10]。解淀粉芽孢桿菌YN201728是一株分離自煙草種子的內生菌,前期研究證實此菌株能有效防控煙草黑脛病和促進植株生長,并對多種真菌病害有較強的拮抗活性[11]。為了充分利用生防菌防治煙草白粉病,本研究采用YN201728 菌液噴施煙草幼苗,以期進一步明確其防治效果與定殖量之間關系,為開發(fā)生物農藥產(chǎn)品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株:煙草內生解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN201728(以下簡稱YN28),由云南農業(yè)大學植物病蟲害生物防治實驗室自煙草種子中分離。其熒光標記菌株YN28-P43GFPmut3a(以下簡稱YN28-GFP)為自然轉化[12]所得的菌株。

供試煙草:供試煙草品種為云煙87,種子由云南省煙草農業(yè)科學研究院提供,煙苗在育苗基質中培育至4～5片真葉備用。

培養(yǎng)基:細菌培養(yǎng)采用LB 培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 YN28-GFP 標記菌在煙草組織及根際土壤的定殖能力測定

1.2.1.1 浸種對YN28-GFP 標記菌在煙草幼苗植株內定殖數(shù)量的影響 將煙草種子置于75%(v/v)酒精浸泡2 min 作表面消毒處理,無菌水漂洗3次以去除殘余酒精。隨后轉入熒光標記菌的細胞懸浮液(1.0×107CFU·mL-1)內浸種24 h,最后全部移入含有無菌濕潤濾紙的培養(yǎng)皿(9.0 cm)內,28℃光照培養(yǎng)箱黑暗萌發(fā)。待種子萌發(fā)后,將培養(yǎng)箱的光照條件改為16 h光培養(yǎng)和8 h 暗培養(yǎng)。

浸種處理15 d后,稱取0.1 g 煙草幼苗組織并置于5 mL 滅菌離心管中,用滅菌玻璃棒搗碎成勻漿狀,10倍梯度稀釋,取適合的梯度倍數(shù)稀釋液均勻涂布于含氯霉素(10 μg·mL-1)的LB 培養(yǎng)平板,37℃倒置黑暗培養(yǎng)24～36 h,隨后在WD-9403F型紫外分析儀(北京六一儀器廠)照射下統(tǒng)計平板上發(fā)綠色熒光的菌落數(shù),計算熒光菌在幼苗中的定殖量。試驗設3次重復。

1.2.1.2 澆灌對YN28-GFP 標記菌在煙草組織及根際土壤定殖數(shù)量的影響 將育苗基質中培育至4～5片真葉的煙草幼苗移栽至裝有自然土200 g/盆的盆缽(10 cm×10 cm×12 cm)中,1株/盆。移栽10 d后,向每株煙草根基部澆施10 mL YN28-GFP 標記菌的菌液(1.0×107CFU·mL-1),分別在澆施接種后的第1、第5、第10、第15、第25、第30、第40、第50天從煙草組織和根際土壤處取樣,每個處理取3個重復。具體取樣及后續(xù)稀釋涂布等細節(jié)參考何鵬飛[13]的方法。取樣后測定標記菌在煙草組織及根系周圍土壤中的定殖情況。

1.2.1.3 YN28-GFP 標記菌在煙草組織的定殖情況 在澆施熒光標記菌后的第5天取煙草組織并對其作表面消毒,無菌水沖洗組織表面3～4次,切取煙草種子、根、莖、葉等組織并用壓片法制片,以未澆施標記菌的煙草植株為對照,在激光共聚焦顯微鏡(Leica SP5Ⅱ,德國萊卡)下觀察YN28-GFP 標記菌株的定殖情況。激光共聚焦顯微鏡的激發(fā)波長設置為488～633 nm,在510～560 nm 波長處收集發(fā)射光以觀測YN28-GFP,在620～660 nm 波長處收集發(fā)射光以獲取熒光背景。

1.2.2 菌株對溫室煙草白粉病的防效測定 試驗在云南農業(yè)大學植物保護學院溫室中進行,煙草植株的育苗及移栽同1.2.1.2。

保護性試驗流程:向煙草葉片分別噴施野生型菌株和標記菌株發(fā)酵液(1.0×107CFU·mL-1),10 mL/株,噴施1次;分別以噴施等體積的無菌LB 培養(yǎng)基和50%嘧菌酯水分散粒劑10 000倍液為陰性對照和陽性對照,噴施前各藥劑加入0.1%(v/v)吐溫20。待上述各處理液在煙草葉面上干燥后,再向葉片抖落接種白粉病孢子,然后將煙草幼苗移入溫室,正常水分管理。在接種生防菌后的第3、第7、第14、第21和第30天分別按煙草病蟲害分級及調查標準[14]調查各處理白粉病發(fā)病情況,計算病情指數(shù)和相對防效;觀察新生葉片的發(fā)病情況,分析各處理對白粉病的持效期。每處理設3個重復,每個重復15株。

治療性試驗流程:先接種白粉病孢子,待煙草葉片初現(xiàn)白粉病斑,調查病情后,向煙草葉片分別噴施生防菌株及對照試劑,其他操作步驟同保護性試驗。

1.2.3 YN28-GFP 標記菌在煙草葉際和葉內的定殖能力測定 標記菌在煙草葉際的定殖能力:分別從1.2.2 保護性試驗和治療性試驗所噴施標記菌株處理的煙草幼苗中,在培養(yǎng)第3、第7、第14、第21和第30天時隨機采取煙草葉片,每個重復取1片煙葉(倒三葉),3次重復。葉片稱重后用無菌水沖洗5次(避開取樣時葉片留下的傷口),合并收集洗脫液,4 000 r·min-1離心20 min,保留沉淀,經(jīng)無菌水梯度稀釋后涂于含氯霉素平板上,37℃培養(yǎng)過夜后計數(shù)。根據(jù)每皿中的菌落數(shù)量,計算每克鮮葉片的葉際所含菌量。

標記菌在煙草葉內的定殖能力:取樣方法同上,煙草葉片表面徹底消毒后,研磨稀釋涂布于含氯霉素的LB 平板上,統(tǒng)計熒光菌的定殖量。根據(jù)標記菌的定殖量評估YN28 菌株在煙草葉片的定殖能力,并結合生防菌的相對防效分析拮抗菌的定殖能力與其防治效果的相關性。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)的方差統(tǒng)計分析,多重比較使用Duncan′s 新復極差法進行多組樣本間的差異顯著性檢驗,以P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 YN28-GFP 標記菌在煙草組織及根際土壤的定殖情況

2.1.1 YN28-GFP 標記菌在煙草幼苗中的定殖 從YN28-GFP 菌液處理的種子長出的煙草幼苗中回收到大量熒光菌落,菌落數(shù)達到2.18×106CFU·g-1,推測標記菌不但進入種子內部,而且在種子萌發(fā)生長過程中可繁殖。

2.1.2 YN28-GFP 標記菌在煙草根際土、根表土及組織中的定殖 由圖1可知,接種YN28-GFP 1 d后,在煙草根、莖、葉和根表土中回收到的YN28-GFP 標記菌菌落數(shù)分別為6.00×105、9.90×105、2.10×104和1.17×106CFU·g-1,且根、莖和根表土的定殖量達到最大值,說明該內生菌在煙草體內的移動速度很快;根際土中YN28-GFP 標記菌含量在接種前5 d 處于緩慢增長狀態(tài),在接種第5天時達到最大值,而葉中YN28-GFP標記菌含量在接種第10天才達到最大值。隨著接種時間的延長,YN28-GFP 標記菌株的定殖密度有所下降。從接種第15天開始,根際土和根表土中菌落數(shù)開始大幅度下降,接種第20天時莖和葉中的YN28-GFP標記菌含量也開始下降,而根中YN28-GFP 標記菌含量從接種第30天才開始以數(shù)量級形式大幅下降。接種第50天時,煙草根、莖和葉組織中僅分別回收到6.30×103、2.0 ×102、1.0×102CFU·g-1的菌落。根表土中YN28-GFP 標記菌的定殖量始終高于根際土,說明根系分泌物中的某些成分可能具有引誘細菌定殖和增殖的作用。

接種第5天,經(jīng)熒光菌處理的根表及木質部導管呈現(xiàn)出很強的綠色熒光(圖2-A),而對照煙草根系中未見熒光(圖2-B);在莖的橫切和縱切切片中,YN28-GFP 主要聚集在莖表皮、韌皮部和維管束組織等部位(圖2-C、E),在葉肉細胞間隙及表皮中也可觀察到熒光蹤跡(圖2-G);在煙草種子的表皮及種胚內同樣可以觀察到熒光菌(圖2-Ⅰ)。由此可見,標記菌YN28-GFP的定殖主要聚集在煙草的根表皮、木質部導管,莖表皮、韌皮部及維管束組織,葉表和葉肉細胞間隙以及種皮與胚等部位。

2.2 菌株定殖與煙草白粉病防效間的關系

2.2.1 拮抗菌株對溫室盆栽煙草白粉病的防治效果 保護性試驗結果顯示(表1),未提前噴施生防菌的陰性對照組在處理第3天開始發(fā)病,而菌液處理組(YN28、YN28-GFP)和陽性對照組均未發(fā)病;處理第7天時,野生型YN-28和標記菌株YN28-GFP 組的防效分別達到81.79%和78.51%,且兩者的防效與陽性對照組無顯著差異;處理14～21 d時,菌液處理組的防效開始下降,但其病情指數(shù)顯著低于陰性對照,處理第21天時,菌液處理組YN28和YN28-GFP的防效分別降至35.37%和38.69%,此時生防菌的防效已明顯低于藥劑處理的陽性對照;處理第30天時,菌液處理組煙草的病情指數(shù)與陰性對照組無顯著差異,說明菌液處理組基本失去防效,菌株YN28和YN28-GFP 對煙草白粉病的保護作用持效期約21 d。

治療性試驗結果顯示(表1),生防菌(YN28和YN28-GFP)處理對煙草白粉病有明顯的治療作用,野生型菌株YN28和標記菌株YN28-GFP處理14 d時對煙草白粉病的治療效果最好,防效分別達到76.97%和74.33%,且與陽性對照組無顯著差異;處理21 d后菌液處理組(YN28、YN28-GFP)的煙草白粉病防效開始降低,但病情指數(shù)仍顯著高于陰性對照;處理第30天時,菌液處理組的病情指數(shù)與陰性對照間均無顯著差異,失去了防效作用。

綜上所述,野生型菌株YN28和標記菌株YN28-GFP 在不同時間點對白粉病的防治效果均無顯著性差異,因而熒光標記對菌株的生防效果未產(chǎn)生明顯影響。

2.2.2 YN28-GFP 標記菌在煙草葉際和葉內的定殖能力與防效關系 通過組織分離培養(yǎng)法測定標記菌株YN28-GFP 在煙草葉際和葉內的定殖量。由圖3可知,無論是保護性試驗還是治療性試驗,處理14 d 內煙草葉際和葉內菌量均維持在105～106CFU·g-1,煙草葉際菌含量略高于葉內。隨著處理時間的延長,YN28-GFP 在煙草葉際和葉內的總定殖量逐漸降低,結合2.2.1 中YN28-GFP 標記菌對白粉病的防治效果可知,標記菌的防效也隨著處理時間的延長相應降低;處理第30天時,治療性試驗和保護性試驗結果均顯示,標記菌YN28-GFP 基本失去防效,其中,保護性試驗中煙草葉片標記菌YN28-GFP的定殖量僅有102～103CFU·g-1,推測拮抗菌在煙草葉片中的定殖能力與防效密切相關。

3 討論

本研究采用熒光標記菌株YN28-GFP 觀察其在根圍土壤中的定殖情況,發(fā)現(xiàn)不同時間點煙草根表土的標記菌含量始終高于根際土,這可能是由于煙草根系可分泌如糖類、有機酸及氨基酸等小分子物質,而這些成分既可作為細菌的營養(yǎng)源,又可改變土壤微環(huán)境而觸發(fā)微生物的趨化性,進而影響微生物的定殖狀態(tài)[15]。定殖后的內生菌并非處于靜止狀態(tài),而是在植物的不同部位相互轉移,YN28-GFP 發(fā)酵液澆灌煙草植株1 d后,就能在煙草的根、莖、葉等組織中檢測到標記菌,熒光標記主要聚集在煙草根表皮和木質部導管,莖表皮、韌皮部、維管束組織以及葉肉間隙等部位,與前人發(fā)現(xiàn)的芽孢桿菌在煙草上的定殖規(guī)律相似[16-18],表明菌株澆灌到煙草根系附近后,根系分泌物可以吸引菌株迅速向根表移動聚集,定殖于根的分生區(qū)、伸長區(qū)、成熟區(qū)以及主根和側根連接處等部位[4],利用植物的吸水動力,通過木質部導管的質外體轉移到植株的莖和葉等其他組織[19]。同時,研究認為細菌在植物根系及其他組織的定殖與細菌的趨化性、鞭毛運動、植物細胞壁降解、活性氧清除能力以及生物膜形成等因素密切相關[20]。浸種處理的煙草幼苗中標記菌定殖量也能達到106CFU·g-1,種子的種皮和胚中都能檢測到標記菌株,推測內生菌可能通過自然孔口直接進入種子。Coombs 等[21]用egfp基因標記的絲狀鏈霉菌檢測其在萌發(fā)小麥種子中的定殖情況,發(fā)現(xiàn)在小麥種子的胚、胚乳和胚根中就能觀察到內生菌的定殖,說明內生菌定殖種子內可能從植物的根、莖、葉、花等部位侵入后轉移到種子中,侵入也可能發(fā)生在植物發(fā)育的最早期階段,直接從皮孔等部位進入種子長期定殖[22],也可能在種子的不同世代垂直傳播[23]。

煙草白粉病是一種嚴重的真菌性氣傳病害,擴增迅速且極難防治和根除。本試驗研究了噴施生防菌YN28 對溫室盆栽煙草白粉病的防治效果,發(fā)現(xiàn)YN28-GFP 對煙草白粉病有較好的保護和治療效果,處理14 d時,保護性試驗和治療性試驗中YN28-GFP的防效分別達到66.96%和76.97%。彭志榮等[24]、劉郵洲等[25]研究發(fā)現(xiàn)生防菌對病原菌的保護效果好于治療效果,即提前接種拮抗菌株定殖能力強、防效好。本研究中治療性試驗的防效稍優(yōu)于保護性試驗,可能是治療性試驗中陰性對照起始病情指數(shù)偏高(21.73)的原因;處理30 d時,保護性試驗和治療性試驗中陽性對照的相對防效仍分別高達84.55%和77.88%,可能是因為本試驗設計的農藥濃度高于一般使用濃度。無論是保護性試驗還是治療性試驗,50%嘧菌酯水分散粒劑的持效期都顯著優(yōu)于生防菌(YN28、YN28-GFP)處理,而生防菌在無保護的條件下,在處理30 d時已基本失去防效。但生防菌研制成為制劑時,一般要加入不同保護功能的助劑,避免菌體數(shù)量過早衰減,從而延長其防效。在實際田間應用中YN28 制劑的持效時長還有待進一步深入研究。

定殖能力強弱直接關系到生防菌能否適應自然環(huán)境條件,能否發(fā)揮促生防病作用,能否被開發(fā)為生物農藥,是生防菌發(fā)揮生防能力最重要的因子之一[26]。內生菌YN28 在煙草體內具有良好的定殖能力,白粉病溫室盆栽試驗前21 d,標記菌在葉際和葉內定殖量達到105～106CFU·g-1,說明YN28 具有作為生防菌的基本特征。定殖是生防菌發(fā)揮防效的關鍵步驟,Chin-AWoeng 等[27]構建了綠針假單胞菌PCL1391 菌株運動基因的突變體,與野生型相比,定殖能力缺失的突變體菌株徹底失去了防治番茄猝倒病的能力。Cao 等[28]將枯草芽孢桿菌SQR9 制成生物有機肥可有效防控黃瓜枯萎病,GFP 標記菌可在黃瓜根的分化區(qū)和伸長區(qū)、根毛和側根連接處穩(wěn)定定殖,保護宿主免受病原體侵害。本研究發(fā)現(xiàn),隨著處理時間的延長,標記菌YN28-GFP 在煙草葉際和葉內的定殖量逐漸減少,白粉病的防治效果也逐漸降低,定殖量與生物防治效果呈密切正相關。為更好的發(fā)揮生防菌的防病作用,在實際應用中,可以將菌株制備成含生防菌的有機肥或土壤改良劑等制劑[29],保護好菌株的生存環(huán)境,同時可根據(jù)大田發(fā)病情況適當補施。

4 結論

本研究利用綠色熒光標記的內生菌開展定殖與防治白粉病研究,結果表明,標記菌YN28-GFP 在煙草根圍及幼苗中的定殖密度表現(xiàn)為根表土＞根際土＞根＞莖＞葉;激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,標記菌YN28-GFP主要聚集在煙草根表皮、木質部導管、莖表皮、韌皮部及維管束組織、葉片表面和葉肉細胞間隙以及種子的種皮與胚等部位。野生型YN28和標記菌株YN28-GFP 對煙草白粉病有較好的保護和治療效果,煙草葉片中內生菌的定殖量與其防效密切相關?？傊?內生菌YN28可在煙草體內有效定殖并在葉際及葉內維持一定濃度,為進一步利用該菌株開展煙草白粉病的防控提供了理論基礎。