王健宏， 徐兆坤， 李 武*

(1.寧夏大學(xué) 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)引起的可致死的慢性傳染病，是全球傳染病引起死亡的主要原因之一[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織的調(diào)查結(jié)果顯示，2018年全球新發(fā)結(jié)核病640萬例，死亡人數(shù)近150萬[2]。我國是TB的高負擔(dān)國家之一，TB發(fā)病人數(shù)約占全球發(fā)病總?cè)藬?shù)的14.3%，高居全球第2位。近年來，雖然我國在TB的防控領(lǐng)域取得了一定的成效，但由于多重耐藥菌株的不斷出現(xiàn)給TB的防控帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)。肺臟是宿主進行氣體交換的器官也是Mtb 感染的主要靶器官。由于其生理作用，肺臟表面的肺泡上皮細胞在進行氣體交換的同時難免長時間暴露于環(huán)境，導(dǎo)致肺泡上皮細胞極易接觸空氣中的有害物質(zhì)，包括空氣中的毒素物質(zhì)以及病原體。當(dāng)Mtb 感染宿主時首先遇到上皮細胞。肺泡上皮細胞能合成和分泌細胞因子、炎癥介質(zhì)和肺表面活性物質(zhì)等，其在抗Mtb感染中也發(fā)揮著重要的作用[3-4]。研究表明，Mtb被Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)識別后，能促進腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白介素-12(Interleukin-12, IL-12)的釋放，并誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生NO，進而協(xié)助細胞清除胞內(nèi)的Mtb[5-7]。因此，深入研究肺泡上皮細胞在Mtb 感染過程中與Mtb 的相互作用，對闡明宿主抗結(jié)核免疫的分子機制以及Mtb 逃逸宿主殺傷的免疫逃逸機制具有重要意義?？菇Y(jié)核病疫苗卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)在長期傳代過程中丟失了很多基因閱讀框和一些重要的毒力因子，如10 kDa培養(yǎng)濾液蛋白(Culture filtrate protein 10, CFP10)和6 kDa早期分泌性抗原靶蛋白(Early secretary antigenic target-6 kDa, ESAT6)[8]。

CFP10是由ESX-1分泌系統(tǒng)分泌，由RV3874基因編碼的[9]，它與ESAT6蛋白一樣，免疫原性較強并且都為T細胞抗原，CFP10和ESAT6的缺失被認為是BCG減毒的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，從牛分枝桿菌中將編碼CFP10和ESAT6的基因刪除，會導(dǎo)致細菌毒力下降[10]。缺失了CFP10的海分枝桿菌突變體在細胞內(nèi)的生長速度和在細胞間的傳播速度大大降低，并且對巨噬細胞的細胞毒性也大大下降[8]。因此CFP10在Mtb 感染宿主的過程中發(fā)揮著重要作用。本研究擬通過構(gòu)建CFP10重組腺病毒表達載體并轉(zhuǎn)染人A549細胞系，檢測CFP10是否對A549細胞炎性因子的表達產(chǎn)生影響。這將為揭示CFP10在結(jié)核病發(fā)病過程的作用，闡明結(jié)核分枝桿菌的致病機制及為新型抗結(jié)核疫苗的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系與質(zhì)粒 HEK 293A細胞、腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-AdV4和骨架質(zhì)粒pGP-Ad-Pac Vector購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；人肺泡Ⅱ型上皮細胞(A549)購自中科院上海細胞研究所。

1.1.2 主要試劑 SDS-PAGE相關(guān)試劑(30% Acr-Bis、10% SDS、Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液)購自Solarbio公司；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、PmeⅠ購自NEB公司；T4-DNA連接試劑盒購自Promega公司；病毒包裝用轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine LTX&PLUS購自Life Technologies公司；RNA提取試劑盒購自天根公司；熒光定量PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司；TNF-α和IL-8 ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；DEME高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自中國北京全式金公司；ECL發(fā)光劑購自美國賽默飛公司；anti-CFP10抗體購自Abcam公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 CO2恒溫培養(yǎng)箱(316108-5121，Thermo)；PCR儀(T100，BIO-RAD)；超速離心機(CP100WX/CR22N，HITACHI)；電泳系統(tǒng)(PowerPac系列，BIO-RAD)；實時熒光定量PCR儀(7500，ABI)；自動化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(5200，Tanon)；超低溫冰箱(SANYO)；多功能酶標儀(EnSpire，BIO-RAD)；倒置熒光顯微鏡(IX83，OLYMPUS)；核酸濃度測定儀(8000，NanoDrop)。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成CFP10基因PCR擴增引物參考文獻[11]，細胞因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α定量PCR擴增引物序列如表1所示，引物合成由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.2 重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-AdV4-CFP10的構(gòu)建與鑒定CFP10基因PCR擴增產(chǎn)物與腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-AdV4同時用BamHⅠ和PmeⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物切膠回收后用T4-DNA連接酶進行連接，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-AdV4-CFP10，并進行PCR、雙酶切和測序鑒定。

1.2.3 HEK 293A細胞培養(yǎng)及腺病毒包裝擴增 HEK 293A細胞培養(yǎng)至融合度達到60%～70%時，將線性化的重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-AdV4-CFP10和骨架質(zhì)粒pGP-Ad-Pac Vector共轉(zhuǎn)染至293A細胞中進行病毒包裝。待細胞生長至100%融合度時進行轉(zhuǎn)接，直至出現(xiàn)明顯的細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)，此時收集細胞并反復(fù)凍融后收集病毒顆粒，將其命名為AdV4-CFP10。

1.2.4 重組腺病毒AdV4-CFP10的鑒定 采用Western blot法對重組病毒AdV4-CFP10進行鑒定。取少量病毒顆粒轉(zhuǎn)染至HEK 293A細胞中，24 h后，使用凱基全蛋白提取試劑盒提取全蛋白，SDS-PAGE電泳后蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜中，用含5%脫脂奶粉的PBS封閉液封閉2 h，加入anti-CFP10一抗(1∶5 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。次日，室溫平衡15 min，用含3% Tween-20的TBS漂洗液漂洗3次，加入二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h后再次用漂洗液漂洗1次，ECL試劑顯色，圖像采集儀上成像。

1.2.5 重組腺病毒AdV4-CFP10的大量擴增及滴度測定 大量擴增重組腺病毒AdV4-CFP10后，采用CsCl密度梯度離心法對重組腺病毒進行純化，采用微量全細胞病變法檢測病毒滴度。

1.2.6 細胞培養(yǎng)及感染 A549細胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。細胞貼壁后，使用重組腺病毒AdV4-CFP10感染A549細胞，24 h后，取細胞培養(yǎng)上清用于細胞因子的ELISA檢測，收集細胞并提取RNA用于細胞因子的熒光定量PCR分析。

1.2.7 實時熒光定量PCR 根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書提取A549細胞的總RNA，再進行反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s；58 ℃ 30 s。共設(shè)置40 個循環(huán)，采用2-△△t法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.8 Western blot A549 細胞以1×106個/mL 接種于6 孔板中處理24 h，使用凱基全蛋白提取試劑盒提取蛋白，對蛋白定量后進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后進行Western blot檢測，測定CFP10蛋白表達水平。

1.2.9 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中炎性因子的含量 采用欣博盛生物科技有限公司ELISA試劑盒對細胞培養(yǎng)上清中的TNF-α和IL-8 含量進行測定，相關(guān)操作按照試劑盒說明書進行。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-AdV4-CFP10的鑒定

重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-AdV4-CFP10構(gòu)建完成后，首先利用PCR技術(shù)對其進行鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果顯示在303 bp處出現(xiàn)特異性擴增條帶, 且位置大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。此外還對重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-AdV4-CFP10進行雙酶切鑒定，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和PmeⅠ雙酶切后，得到了4 500和303 bp的2個條帶(圖2)，且與理論值大小一致。

2.2 腺病毒的包裝、擴增及滴度測定

重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-AdV4-CFP10和腺病毒骨架質(zhì)粒pGP-Ad-Pac Vector經(jīng)PacⅠ酶切線性化后共轉(zhuǎn)染至HEK 293A細胞中進行病毒包裝，4 d后經(jīng)熒光顯微鏡觀察到少量的表達綠色熒光蛋白的細胞，9 d后在熒光顯微鏡下觀察到明顯的細胞病變效應(yīng)(圖3)。此時，收集細胞，經(jīng)過反復(fù)凍融裂解后離心，并收集上清中的病毒顆粒，至此重組腺病毒AdV4-CFP10包裝成功。病毒在HEK 293A中大量擴增后，CsCl密度梯度離心法進行病毒的純化，病毒純化后進行滴度測定。經(jīng)測定，所獲病毒滴度為9×108pfc/mL。

圖1 重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-AdV4-CFP10的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of the recombinant adenovirus shuttle plasmid pShuttle-AdV4-CFP10M：DNA Marker；1：陰性對照；2：CFP10 PCR擴增產(chǎn)物M：DNA Marker；1：Negative control；2：PCR products of CFP10

圖2 重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-AdV4-CFP10雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the recombinant adenovirus shuttle plasmid pShuttle-AdV4-CFP10 digested by restriction endonuclease BamHⅠand PmeⅠ1：陰性對照；2：pShuttle-AdV4-CFP10酶切產(chǎn)物；M：DNA Marker1：Negative control；2：Digestion products of；M：DNA Marker

圖3 重組腺病毒AdV4-CFP10在HEK 293A細胞中的包裝 Fig.3 Package of recombinant adenovirus AdV4-CFP10 in HEK 293A cells A、C：HEK 293T細胞；B、D：病毒包裝中的細胞病變效應(yīng)A，C：HEK293 cells 4 days；B，D：Cytopathic effects (CPE) of HEK 293A cells

2.3 重組腺病毒AdV4-CFP10感染A549細胞后CFP10基因的表達

為了驗證重組腺病毒AdV4-CFP10中CFP10基因是否能在人肺泡II型上皮細胞A549中表達，在mRNA和蛋白水平上進行了檢測。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，重組腺病毒AdV4-CFP10在A549細胞中轉(zhuǎn)錄水平的表達量顯著高于對照組(圖4A)。Western blot結(jié)果表明，在約10 kDa 位置處出現(xiàn)CFP10特異性抗體識別條帶，表明重組腺病毒AdV4-CFP10中CFP10基因可正常表達，且能被相應(yīng)的特異性抗體所識別，具有反應(yīng)原性。結(jié)果如圖4B 所示。

圖4 重組腺病毒AdV4-CFP10中CFP10在mRNA和蛋白水平上的表達 Fig.4 The expression levels of mRNA and protein of CFP10 in AdV4-CFP10 in A549 cells A：CFP10 mRNA水平檢測結(jié)果；B：CFP10蛋白表達水平檢測結(jié)果；M：蛋白Marker；1：AdV4-CFP10；2：AdV4-NC；***P<0.01 A：The expression level of CFP10 mRNA in A549 cells,B：The expression level of CFP10 protein in A549 cells,M：protein Marker,1：AdV4-CFP10,2：AdV4-NC,***P<0.01

2.4 重組腺病毒AdV4-CFP10感染A549細胞后對下游細胞炎性因子表達的影響

細胞炎性因子的表達是機體免疫系統(tǒng)啟動的重要事件之一。為了探究重組腺病毒AdV4-CFP10是否對A549細胞炎性因子的分泌產(chǎn)生影響，分別使用RT-PCR和ELISA技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上檢測了相關(guān)炎性因子的表達水平。RT-PCR結(jié)果顯示，與空病毒AdV4-NC組相比，AdV4-CFP10感染A549細胞24 h后，IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α在mRNA水平上表達量顯著增加(圖5)。又對其中的兩種細胞因子IL-8和TNF-α用ELISA技術(shù)在蛋白水平上進行了檢測，結(jié)果顯示，其和轉(zhuǎn)錄水平趨勢一致，細胞培養(yǎng)上清中的IL-8和TNF-α顯著高于空病毒對照組(圖6)。這些結(jié)果說明，重組腺病毒AdV4-CFP10感染A549細胞后，CFP10的表達對A549細胞炎性因子的表達具有重要的影響。

圖5 重組腺病毒AdV4-CFP10對A549細胞IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA表達的影響 Fig.5 The effect of AdV4-CFP10 on the mRNA expression levels of IL-1α, IL-6, IL-8 and TNF-α in A549 cell**P<0.01，下圖同**P<0.01，the same follow

圖6 重組腺病毒AdV4-CFP10對A549細胞IL-8和TNF-α分泌的影響 Fig.6 The effect of AdV4-CFP10 on the secretion of IL-8 and TNF-α in A549 cells

3 討 論

近年來，盡管在結(jié)核病的防治領(lǐng)域取得了一定的成效，但到目前為止，能作為結(jié)核病防治的疫苗僅有卡介苗，其免疫效果并不是很理想，這主要與其在長期傳代培養(yǎng)過程中丟失了一些優(yōu)勢抗原如CFP10和ESAT6等有關(guān)。CFP家族的成員，除了CFP10外，還有CFP25、CFP20.5和CFP3等[12]。其中，CFP10是一種重要的Mtb分泌蛋白，它能有效地刺激T細胞使其增殖分化，也可增強機體對Mtb的免疫保護效果[13]。因此，CFP10在抗結(jié)核疫苗研制領(lǐng)域備受關(guān)注。重組腺病毒因其基因結(jié)構(gòu)與功能的研究較為清楚，且能夠感染多數(shù)宿主細胞并能較好表達所需目的蛋白，因此被廣泛應(yīng)用于基因工程疫苗的開發(fā)、體外基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及體內(nèi)基因治療等領(lǐng)域[14]。肺泡上皮細胞和巨噬細胞同樣也是Mtb侵襲的靶細胞，除了作為物理屏障外，它們還具有重要的免疫功能。肺泡上皮細胞可以通過模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)感知Mtb的存在，從而調(diào)節(jié)氣道表面液體的組成，進而提高機體的抗感染能力[3]。此外，PRR的活化會導(dǎo)致炎性細胞因子的產(chǎn)生和T細胞的激活，促進IFN-γ和TNF-α等細胞因子的分泌[15]。

細胞免疫在抗Mtb感染免疫中發(fā)揮著重要的作用，Mtb的感染會產(chǎn)生大量的細胞因子，這些細胞因子的產(chǎn)生對宿主抗Mtb細胞免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要的作用[16]。本研究檢測了重組腺病毒AdV4-CFP10感染A549細胞后是否對炎性因子表達水平有影響。發(fā)現(xiàn)CFP10的表達使得下游相關(guān)炎性因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α等分泌水平上調(diào)。有文獻報道用重組蛋白CFP10免疫小鼠，結(jié)果顯示與對照組相比，重組蛋白處理后小鼠炎性因子均顯著升高[17]，因此本研究結(jié)果與其相符。TNF-α能增加巨噬細胞的吞噬能力并增強巨噬細胞對Mtb的殺傷力，特別是在與IFN-γ協(xié)同作用時[18]。TNF-α還能夠誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡從而協(xié)助機體清除Mtb[19]。白介素對宿主清除Mtb也發(fā)揮著極其重要的作用[20-21]。

本研究成功構(gòu)建了含有結(jié)核分枝桿菌CFP10基因重組腺病毒AdV4-CFP10，并檢測了CFP10對A549細胞炎性因子的影響，結(jié)果表明CFP10能有效的對A549細胞下游相關(guān)炎性因子的轉(zhuǎn)錄和分泌產(chǎn)生影響。本研究將為揭示CFP10在結(jié)核病發(fā)病過程的作用、闡明Mtb的致病機制及為新型抗結(jié)核疫苗的開發(fā)提供參考。