二代測(cè)序在膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后遲發(fā)性感染關(guān)節(jié)液中病原菌檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值

趙玲 李浩然 郭巍 張韶輝 崔青

關(guān)節(jié)置換手術(shù)后人工關(guān)節(jié)發(fā)生感染是臨床常見并發(fā)癥，常見感染類型包括急性、遲發(fā)性、慢性[1]，其中遲發(fā)性感染發(fā)病緩慢，發(fā)病后病情多呈惡化趨勢(shì)。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)鑒定時(shí)間較長，若遇厭氧菌及難鑒定細(xì)菌，鑒定時(shí)間常延至7天甚至更久，并且可能存在假陰性結(jié)果。二代測(cè)序技術(shù)是隨著分子生物學(xué)發(fā)展、基于PCR而形成的一種病原菌診斷方法，敏感性高，檢測(cè)速度快[2]。近年來，二代測(cè)序逐漸用于感染性病原菌的識(shí)別與鑒定，在血液樣本微生物檢測(cè)中有較高應(yīng)用價(jià)值[3]。本研究利用二代測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)共同測(cè)定膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后遲發(fā)性感染病人關(guān)節(jié)液中的病原菌類型，探討二代測(cè)序在膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染中的應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

選取2014年2月～2019年3月我院收治的膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后合并感染病人41例，其中初次關(guān)節(jié)置換后感染7例，翻修術(shù)后感染34例。年齡37～71歲，平均年齡(58.47±3.51)歲，男20例，女21例。骨性關(guān)節(jié)炎26例，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎15例，骨水泥假體置換22例，非骨水泥假體置換19例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合肌肉與骨骼感染協(xié)會(huì)(muscularskeletal infection society，MSIS)的人工關(guān)節(jié)假體感染標(biāo)準(zhǔn)[4]；(2)初次膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)后及翻修術(shù)后感染；(3)人工關(guān)節(jié)處有疼痛、紅腫、局部發(fā)熱癥狀；(4)發(fā)生感染時(shí)間均在術(shù)后5個(gè)月～2年內(nèi)；(5)入院后停用抗生素2周再取樣進(jìn)行微生物培養(yǎng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)前合并全身性感染或?yàn)殚_放性骨折；關(guān)節(jié)液量不足以用于二代測(cè)序及實(shí)驗(yàn)室微生物培養(yǎng)；合并惡性腫瘤；合并全身免疫系統(tǒng)疾病及長期使用免疫抑制劑類藥物。本研究獲醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有病人及家屬對(duì)本研究內(nèi)容充分知曉，自愿簽署知情同意。

二、方法

1.檢測(cè)方法：對(duì)所有病人取樣，收集關(guān)節(jié)液。在膝關(guān)節(jié)的髕骨上方經(jīng)股四頭肌腱外側(cè)向內(nèi)穿刺進(jìn)關(guān)節(jié)囊，抽取3 ml關(guān)節(jié)液，分2部分注入2支無菌管中，一部分保存至-80℃冰箱中，一部分送至我院微生物實(shí)驗(yàn)室。所有標(biāo)本均在抽取后30分鐘內(nèi)接種完成。培養(yǎng)基選擇血平板、巧克力平板、需氧血培養(yǎng)瓶、厭氧血培養(yǎng)瓶。血培養(yǎng)瓶放置美國BD公司BACTECTM FX40全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)中。培養(yǎng)出的細(xì)菌均采用梅里埃VITEK 2 Compact微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

對(duì)保存于-80℃冰箱的關(guān)節(jié)液進(jìn)行細(xì)菌DNA提取。方法：解凍后使用加樣槍取200 μl標(biāo)本轉(zhuǎn)入新的無菌管中，采用DNeasy Blood& Tissue kit試劑盒進(jìn)行DNA提取，操作步驟參考試劑盒說明書。取略大于500 ng提取完成的模板DNA，進(jìn)行二代測(cè)序：首先進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為95℃ 2分鐘預(yù)變性，95℃ 5秒變性、60℃ 30秒退火、60℃ 30秒延伸，循環(huán)45次。再將擴(kuò)增得到的DNA分析進(jìn)行DNA文庫制備、emPCR平行擴(kuò)增、測(cè)序。測(cè)序所得結(jié)果中去除長度<50 bp的低質(zhì)量、低復(fù)雜度序列，得到高質(zhì)量的序列，同時(shí)消除人源基因組干擾。結(jié)果判讀：由計(jì)算機(jī)將測(cè)序得到的序列對(duì)比數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌序列，識(shí)別鑒定出各種細(xì)菌。采用USEARCH軟件中UPARSE算法對(duì)二代測(cè)序中每個(gè)樣本中檢出的細(xì)菌序列多樣性及豐度進(jìn)行分析：(1)對(duì)有效序列進(jìn)行聚類，將有97%序列相似度的序列歸為一個(gè)操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)；(2)使用USEARCH軟件及相應(yīng)數(shù)據(jù)庫，將每個(gè)OUT代表序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，計(jì)數(shù)每個(gè)樣本注釋到不同細(xì)菌分類水平上的序列數(shù)；(3)使用QIIME軟件計(jì)算樣本α多樣性，包括Chao1、ACE、Simpson、Shannon指數(shù)，Chao1與ACE指數(shù)主要體現(xiàn)樣本物種豐度信息，Simpson與Shannon主要體現(xiàn)物種多樣性信息，ACE及Chao1指數(shù)越大表示物種豐富度越高，Shannon指數(shù)越大表示物種多樣性越高，Simpson指數(shù)越趨近于0表示物種多樣性越高。

2.觀察指標(biāo)：兩種方法對(duì)41例病人關(guān)節(jié)液中細(xì)菌檢出情況；41例病人由二代測(cè)序測(cè)得的樣本α多樣性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后合并感染病人典型病例：女，63歲。雙膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎，右側(cè)膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后6個(gè)月發(fā)生感染。見圖1。

2.41例病人二代測(cè)序與細(xì)菌培養(yǎng)的細(xì)菌檢出率比較：在種水平上分析兩種方法最終檢出的細(xì)菌情況，細(xì)菌培養(yǎng)未檢出停乳鏈球菌，兩種方法均未檢出真菌。細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果中，有29例(70.73%，29/41)病人同時(shí)感染了2種細(xì)菌，1例病人檢出3種細(xì)菌(優(yōu)勢(shì)菌2種，另一種推測(cè)是由于樣本污染導(dǎo)致)；二代測(cè)序檢出同時(shí)感染2種細(xì)菌的病人為34例(82.93%，34/41)，且其中囊括細(xì)菌培養(yǎng)檢出的29例病人，另有1例病人檢出6種細(xì)菌。二代測(cè)序檢出的感染金黃色葡萄球菌病人13例(70.73%，13/41)明顯多于細(xì)菌培養(yǎng)5例(12.20%，5/41)(P<0.05)。見表1。

A.初次全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)前雙膝關(guān)節(jié)正位X線片示雙側(cè)膝關(guān)節(jié)間隙狹窄、骨質(zhì)增生、硬化；B.全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后雙膝關(guān)節(jié)正位x線片示假體位置良好；C.右側(cè)膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后6個(gè)月發(fā)生感染正位x線片，右脛骨平臺(tái)下骨質(zhì)溶解，脛骨側(cè)假體松動(dòng)。

表1 41例患者二代測(cè)序與細(xì)菌培養(yǎng)的細(xì)菌檢出情況(例，%)

3.41例病人由二代測(cè)序測(cè)得的樣本α多樣性：二代測(cè)序得到41例病人樣本中細(xì)菌ACE指數(shù)平均為(12 834.06±317.52)，Chao1指數(shù)平均為(8 025.37±351.08)，Simpson指數(shù)(0.53±0.01)(圖2)、Shannon指數(shù)(5.06±0.11)(圖3)。

圖2 Simpson指數(shù)

討論

雙脫氧法測(cè)序是利用某種DNA聚合酶延伸結(jié)合待定序列模板上的引物，一直結(jié)合到某種終止核苷酸為止[5]。21世紀(jì)分子生物學(xué)新型微生物鑒定方法已發(fā)展到第二代測(cè)序法，即高通量測(cè)序[6]。二代測(cè)序在一次測(cè)序后就能獲得所有病原菌的DNA序列，成本低，合成、延伸、測(cè)序步驟可同時(shí)進(jìn)行，縮短測(cè)序時(shí)間[7]。目前，應(yīng)用較廣的二代測(cè)序技術(shù)包括Roche/454 GS FLX、Illumina/Sol-exa GenomeAnalyzer、Single Molecule Sequencer等[8]，在癌癥分型、病毒鑒定領(lǐng)域逐步發(fā)揮優(yōu)勢(shì)[9-10]。二代測(cè)序還可以通過與抗生素耐藥基因數(shù)據(jù)庫和毒力因子數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，分析細(xì)菌的耐藥基因及細(xì)菌毒力[11]。二代測(cè)序成本相對(duì)較低，但目前測(cè)序設(shè)備的費(fèi)用仍較高，臨床有二代測(cè)序需求時(shí)，常委托第三方實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)序。

本研究中納入的遲發(fā)性感染病人是指在術(shù)后數(shù)月、數(shù)年后才出現(xiàn)感染癥狀的病人，此類病人一旦發(fā)病，病情進(jìn)展迅速[12]。遲發(fā)性感染多因術(shù)中創(chuàng)口污染或術(shù)后創(chuàng)口愈合不良，淺層創(chuàng)口逐漸侵入深部，在關(guān)節(jié)深部定植并累及其他部位。傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌培養(yǎng)在區(qū)分多種類型的細(xì)菌時(shí)不具有優(yōu)勢(shì)，這是因?yàn)橐粋€(gè)培養(yǎng)基營養(yǎng)有限，若一個(gè)病人的某種樣本中存在多種細(xì)菌，會(huì)發(fā)生爭(zhēng)奪營養(yǎng)情況，這不利于了解病人病原菌詳細(xì)分布類型。另外，多種細(xì)菌在同一培養(yǎng)基上生長時(shí)可能出現(xiàn)菌落混合生長的情況，此時(shí)需要進(jìn)行仔細(xì)分離純化，若遇細(xì)菌污染情況，分離純化結(jié)果不良，則需進(jìn)行二次取樣培養(yǎng)，大大延長細(xì)菌培養(yǎng)鑒定時(shí)間。如本院中對(duì)于血培養(yǎng)儀中細(xì)菌的檢測(cè)，需氧菌需3～5天才能得到結(jié)果，厭氧菌則需7天才能出結(jié)果。因此，通過二代測(cè)序方式對(duì)膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后遲發(fā)性感染的病人進(jìn)行詳細(xì)、全面的病原菌鑒定非常有必要。

本研究發(fā)現(xiàn)二代測(cè)序檢出的細(xì)菌種類囊括了傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)檢出的細(xì)菌種類，表明二代測(cè)序法在關(guān)節(jié)液細(xì)菌的鑒定中有重要臨床意義。傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)未檢出任何感染了停乳鏈球菌的病人，而二代測(cè)序檢出5例感染了停乳鏈球菌的病人。這表示二代測(cè)序可檢測(cè)并鑒定出傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)無法鑒定出的細(xì)菌類型。同時(shí)，二代測(cè)序鑒定出感染金黃色葡萄球菌的病人占70.73%，高于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)的12.20%。二代測(cè)序鑒定出感染表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、無乳鏈球菌、化膿性鏈球菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑氏不動(dòng)桿菌的病人比例雖然與細(xì)菌培養(yǎng)比較差異不明顯，但仍可以看出二代測(cè)序檢出的感染以上細(xì)菌病人比例高。表明二代測(cè)序在鑒定以上細(xì)菌時(shí)較細(xì)菌培養(yǎng)更敏感。兩種方法鑒定出感染大腸埃希菌的病人比例相同，且經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)是相同6例病人。表明對(duì)于大腸埃希菌，二代測(cè)序與細(xì)菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果具有一定一致性，不會(huì)產(chǎn)生較大偏倚。其原因可能是由于大腸埃希菌是常見的革蘭陰性致病菌，其生長環(huán)境對(duì)營養(yǎng)要求不苛刻、菌落易識(shí)別，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基上即可直接檢出。兩種方法均未檢出真菌，表示在本研究中41例病人不存在真菌感染，也提示膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后遲發(fā)性感染病人中真菌感染率低。本研究傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)最多在1例病人關(guān)節(jié)液樣本中檢出3種細(xì)菌，但從該病人的微生物平板內(nèi)細(xì)菌分布情況來看，其中有1種細(xì)菌可能是由于樣本污染造成的，因此檢出的致病菌仍為2種，而二代測(cè)序結(jié)果顯示最多在1例病人的關(guān)節(jié)液樣本中檢出6種細(xì)菌，其中占優(yōu)勢(shì)的致病菌有3種。由此可見，傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)的精準(zhǔn)性確實(shí)低于二代測(cè)序，且依賴人工的經(jīng)驗(yàn)。從二代測(cè)序后的細(xì)菌群落豐富度及多樣性分析，本研究中Simpson指數(shù)約為0.05，Shannon指數(shù)處于中等水平。雖然Simpson指數(shù)不明顯趨近0，但ACE及Chao1指數(shù)體現(xiàn)出較高水平，表明在41例病人關(guān)節(jié)中，采用二代測(cè)序可檢出較高物種豐度，對(duì)微生物多樣性檢出的水平還有待研究。

總體而言，在本研究納入的膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染的病人中，均可檢出致病菌，二代測(cè)序能檢出高物種豐度，在微生物多樣性方面，二代測(cè)序檢出的細(xì)菌多樣性也較多，既可囊括傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)檢出的細(xì)菌種類，又可檢出細(xì)菌培養(yǎng)無法檢出的細(xì)菌種類。朱逸敏等[13]研究表明，二代測(cè)序已成為病原學(xué)診斷的有效方式，與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方式比較具有快速、定量分析的優(yōu)點(diǎn)，但二代測(cè)序發(fā)展到現(xiàn)階段仍缺乏明確的公認(rèn)的判讀標(biāo)準(zhǔn)，后續(xù)仍需通過增大樣本量，通過與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)相比，進(jìn)一步驗(yàn)證二代測(cè)序的優(yōu)勢(shì)。