食品微生物檢測(cè)技術(shù)PCR的應(yīng)用

陳禮福 （江蘇旅游職業(yè)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225127）

技術(shù)發(fā)展是確保食品微生物檢測(cè)質(zhì)量和效率的基本條件，在傳統(tǒng)的食品檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用中，需要做好前期準(zhǔn)備工作，某些檢測(cè)還要求做好前期的病原體培養(yǎng)，不僅需要占用大量的時(shí)間，而且在檢測(cè)過(guò)程中受到外界影響因素較為明顯，檢測(cè)準(zhǔn)確率較低。由于PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中具有良好的效果，使其近些年來(lái)得以廣泛推廣，為我國(guó)食品安全管理起到了積極的促進(jìn)作用。

1. PCR技術(shù)概述

1.1 PCR技術(shù)的概念

在分子生物學(xué)研究中，PCR（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)是指基于DNA聚合酶所具有的作用，將雙鏈DNA進(jìn)一步分解為單鏈，在堿基互補(bǔ)配對(duì)原則的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)單鏈DNA分子的復(fù)制與拷貝[1]。由于DNA所具有的保留復(fù)制特性，在各種不同的溫度環(huán)境下，都能夠借助酶的輔助作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的復(fù)性和變性控制，進(jìn)而達(dá)到體外復(fù)制基因的目的。將PCR技術(shù)應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)中，能夠在確保檢測(cè)質(zhì)量的情形下，盡量提升檢測(cè)速度，具有較好的應(yīng)用效果。

1.2 常見(jiàn)PCR技術(shù)分類

由于PCR技術(shù)應(yīng)用模式的不同，通常將其分為常規(guī)PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù)、RT-PCR技術(shù)及熒光PCR技術(shù)等幾種類型[2]。常規(guī)PCR技術(shù)所需要使用的樣本數(shù)量較少，技術(shù)應(yīng)用簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性強(qiáng)，常被應(yīng)用于單核細(xì)胞增多癥等方面的檢測(cè)中，通常情形在在12-24h內(nèi)可以完成全部檢測(cè)流程。多重PCR技術(shù)及時(shí)基于不同PCR技術(shù)類別具有互補(bǔ)性而實(shí)現(xiàn)的，其分離速度較快、檢測(cè)準(zhǔn)確率較高，但是對(duì)技術(shù)應(yīng)用水平和設(shè)備等具有較高的要求，因此在目前的應(yīng)用范圍還受到一定限制。RT-PCR技術(shù)是在提取微生物中RNA并進(jìn)行模板構(gòu)建的基礎(chǔ)上，與PCR技術(shù)相結(jié)合的新型檢測(cè)技術(shù),在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，能夠有效分辨生物特征，提升現(xiàn)有生物技術(shù)檢測(cè)的限制，提升檢測(cè)準(zhǔn)確率。熒光PCR技術(shù)是對(duì)熒光分子進(jìn)行染色處理，依據(jù)微生物的特異性對(duì)基因標(biāo)靶進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的方法，這種方法能夠在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原體的檢測(cè)。

1.3 PCR技術(shù)應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)

P C R 技術(shù)在應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)時(shí)所具有的優(yōu)勢(shì)是相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)而言的，在實(shí)際應(yīng)用中，主要具有如下幾個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)。首先是在應(yīng)用中具有應(yīng)用便捷的特征。傳統(tǒng)的食品微生物檢測(cè)技術(shù)整體效果較差、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，工作效率低下，PCR技術(shù)的應(yīng)用，能夠縮減檢測(cè)程序，避免這些方面的缺陷。其次是在實(shí)際應(yīng)用中，能夠在幾小時(shí)或者一天之內(nèi)就能夠獲取檢測(cè)結(jié)果，提升食品安全現(xiàn)場(chǎng)管理工作的整體效率。PCR技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)而言，自動(dòng)化水平更高，能夠更加精準(zhǔn)的檢測(cè)出食品中的微生物含量，確保食品安全管理水平不斷提升[3]。

1.4 食品微生物檢測(cè)的概念

在我國(guó)現(xiàn)有的食品管理體系中，食品微生物檢測(cè)的概念主要包括兩個(gè)方面：即食品污染程度指示菌檢測(cè)和食品致病菌檢測(cè)[4]。其具體工作流程是在對(duì)檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行取樣處理后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件檢驗(yàn)所取樣品中的細(xì)菌菌落數(shù)，或者檢測(cè)在對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)中要求的微生物限量值。在某些檢測(cè)中，還需要對(duì)可能的致病菌進(jìn)行測(cè)定。這兩個(gè)方面的檢測(cè)是需要同時(shí)進(jìn)行的，只有在所有關(guān)鍵指標(biāo)都達(dá)到要求的情形下，才能確保食品安全達(dá)到要求。

2.PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的具體應(yīng)用

2.1 在乳制品沙門(mén)菌檢測(cè)中的應(yīng)用

乳制品質(zhì)量控制是食品安全管理的重要方面，在乳制品生產(chǎn)中，飼料、土壤、奶牛自身及糞便等含有不同類型的病原微生物，在控制技術(shù)應(yīng)用不當(dāng)?shù)那樾蜗拢陀锌赡軙?huì)造成乳制品感染病原微生物。傳統(tǒng)的檢測(cè)方式中，對(duì)于對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)后，采用生化反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，不僅檢測(cè)速度較慢，而且整體準(zhǔn)確率較低?；赑CR技術(shù)對(duì)乳制品進(jìn)行沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)特定目的片段的擴(kuò)增，通常情形下，invA、fliC、sdfL特異基因是檢測(cè)的重點(diǎn)內(nèi)容。但是在檢測(cè)時(shí)，不同的引物之間具有較為明顯的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，因此對(duì)引物濃度控制具有較高的要求，以此才能保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，需要通過(guò)Mg2+對(duì)Taq DNA聚合酶進(jìn)行催化，從而確保其活化性能得到提升，實(shí)現(xiàn)片段擴(kuò)增的目的[5]。同時(shí)在進(jìn)行沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，糖原、礦物質(zhì)及異丙醇、氯化鉀等物質(zhì)，會(huì)對(duì)PCR檢測(cè)技術(shù)產(chǎn)生相應(yīng)的抑制作用，因此還應(yīng)當(dāng)考慮這方面影響因素，采用合理的計(jì)算來(lái)確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 在生鮮食品中食源性病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

生鮮食品是指未進(jìn)行加工或者僅進(jìn)行初步加工就能夠直接食用的食品，常見(jiàn)的有水產(chǎn)品、肉制品及水果蔬菜類等。由于這類產(chǎn)品的生產(chǎn)加工保鮮技術(shù)較為落后，因此在銷售和食用過(guò)程中的腐爛度較高，容易出現(xiàn)浪費(fèi)甚至是危害人體安全的問(wèn)題。采用多重P C R 技術(shù)對(duì)生鮮食品進(jìn)行檢測(cè)，能夠改變傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)中存在的檢驗(yàn)速度慢，檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，檢測(cè)內(nèi)容較為單一等多方面問(wèn)題。由于多重P C R 技術(shù)具有對(duì)多種病原微生物都具有較高的明暗性和特異性，并且在檢驗(yàn)非活菌時(shí)具有良好的檢測(cè)效果，因此能夠防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。但是在實(shí)際應(yīng)用中，需要對(duì)食品成分進(jìn)行對(duì)應(yīng)的處理，避免由于微生物檢測(cè)含量過(guò)少或者成分復(fù)雜等因素造成檢測(cè)結(jié)果失真[6]。

2.3 在大腸桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用

大腸桿菌是具有毒性的微生物類型，并且這些毒性具有較高的一致性，傳統(tǒng)的檢測(cè)方式主要是以血清微生物法進(jìn)行檢測(cè)，在準(zhǔn)確率方面存在一定的缺陷。PCR技術(shù)在微生物檢測(cè)應(yīng)用中，主要是對(duì)大腸桿菌的DNA雙鏈進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)免疫磁分離技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合，能夠提升大腸桿菌的檢測(cè)準(zhǔn)確率，并且進(jìn)行更加深入的分析。大腸桿菌是食品微生物中具有較強(qiáng)致病性的微生物，對(duì)人體的危害性較大，提升其檢測(cè)準(zhǔn)確率對(duì)于確保食品安全具有重要意義[7]。

2.4 在啤酒微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

啤酒是人們?nèi)粘Ｉ钪休^為常見(jiàn)的飲品類型，由于行業(yè)發(fā)展的影響，不同企業(yè)在生產(chǎn)質(zhì)量控制方面的影響存在較大差異。就基本生產(chǎn)工藝而言，啤酒都是基于發(fā)酵工藝生產(chǎn)而來(lái)的，在發(fā)酵過(guò)程中離不開(kāi)乳酸桿菌的作用，同時(shí)還需要用異微A酸的抑制作用。但是在二者之間會(huì)存在不同程度的相互抑制作用。在這種情形下，對(duì)啤酒中的微生物檢測(cè)就會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)不夠準(zhǔn)確的問(wèn)題。相關(guān)技術(shù)人員在研究horA基因順序的基礎(chǔ)上合成特異性引物，并采用PCR技術(shù)和電泳技術(shù)相結(jié)合的方式進(jìn)行檢測(cè)[8]，以此有效提升了啤酒微生物檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

3.PRC技術(shù)應(yīng)用前景分析

PCR技術(shù)作為食品微生物檢測(cè)的重要技術(shù)之一，已經(jīng)取得了良好的應(yīng)用效果，為推動(dòng)我國(guó)食品安全管理起到了積極的促進(jìn)作用。為未來(lái)發(fā)展中，PCR技術(shù)的應(yīng)用會(huì)朝著三個(gè)主要方面發(fā)展：首先是對(duì)DNA和RNA模板的純度方面，具有更高的要求，這是確保PRC技術(shù)應(yīng)用準(zhǔn)確率提升的重要前提。其次是在PRC技術(shù)應(yīng)用中，還存在檢測(cè)靈敏度不足而出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，更好的解決這方面的問(wèn)題，是提升檢測(cè)準(zhǔn)確率和技術(shù)應(yīng)用水平的重要保障。再次是在未來(lái)技術(shù)應(yīng)用過(guò)程中，與數(shù)據(jù)分析和處理技術(shù)的結(jié)合程度將會(huì)更加密切。隨著二者結(jié)合的不斷深入，具有高度自動(dòng)化水平的數(shù)字PRC技術(shù)技術(shù)將會(huì)得以快速發(fā)展，從而在食品微生物檢測(cè)中發(fā)揮更大的作用[9]。

4.結(jié)束語(yǔ)

近些年來(lái)，雖然相關(guān)部門(mén)在食品安全管理方面的投入力度不斷增大，但是群體性的食品安全事件仍時(shí)有發(fā)生，在這種情形下，依托現(xiàn)代技術(shù)提升食品微生物的檢測(cè)準(zhǔn)確性和檢測(cè)效率，能夠更加快速的判定問(wèn)題產(chǎn)生的根源，為提升事件解決的效率奠定良好的基礎(chǔ)。在這種情形下，做好PCR技術(shù)等方面的研究，具有重要的社會(huì)意義。