劉芷兮，陳 燕，肖洪濤，2△

(1.四川省腫瘤醫(yī)院·研究所、四川省癌癥防治中心，臨床藥學部；電子科技大學醫(yī)學院，四川 成都 610041；2.個體化藥物治療四川省重點實驗室，四川 成都 610041)

I型神經(jīng)纖維瘤病 (neurofibromatosis type 1)是常染色體顯性遺傳病，每3000個新生兒中就有1個患兒，其致病基因位于常染色體17q11.2。它是由腫瘤抑制基因NF1突變引起的，NF1基因在17q11.2處有一個大基因座(350 kbp)，它包含61個外顯子，其中含有4個交替拼接的外顯子，轉(zhuǎn)錄后大小為12 kbp信使RNA(mRNA)，其中包含8454個核苷酸的開放閱讀框[1]。該基因編碼ras信號通路的負調(diào)節(jié)因子，突變主要影響神經(jīng)嵴衍生組織類型(如雪旺細胞和黑素細胞)[2]。外顯率為100%，其中的大部分患者，為散發(fā)式病例，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，且涉及多個系統(tǒng)[3]?；加蠳F1的兒童和成人出現(xiàn)包括良性和惡性腫瘤在內(nèi)的疾病，包括認知缺陷、癲癇發(fā)作、生長異常、周圍神經(jīng)病變和以咖啡色斑點和輔助雀斑的形式出現(xiàn)的異常色素沉著。神經(jīng)系統(tǒng)也會出現(xiàn)并發(fā)癥，如不受控制的偏頭痛等[4]。

1982年，神經(jīng)纖維瘤病被分為7類[5]，NF1也稱馮雷克豪森氏病，占神經(jīng)纖維瘤病的85%以上也是本文主要的研究對象。NF2為聽神經(jīng)鞘瘤病，與NF2基因失活有關(guān)，有顱內(nèi)腫瘤，一般表現(xiàn)為頭暈，耳鳴，視力下降，癥狀存在時間可數(shù)月至數(shù)年不等。NF3為混合型神經(jīng)纖維瘤病，具有NF1與NF2兩種表征。NF4為變異型神經(jīng)纖維瘤病。NF5為節(jié)段型神經(jīng)纖維瘤病(segmental neurofibromatosis，SNF)。NF6是僅有牛奶咖啡斑型神經(jīng)纖維瘤病，NF7為遲發(fā)型神經(jīng)纖維瘤病，發(fā)病在30歲以后[6]。

闡明NF1基因突變的類型，對于涉及相關(guān)疾病的基礎(chǔ)和臨床研究具有重要的意義，本文主要聚焦NF1的突變及相關(guān)表型，NF1基因突變無規(guī)則無序，總結(jié)NF1突變包括以下多種類型：染色體畸變、多個外顯子缺失、大插入、終止突變(無義突變)、氨基酸替代、內(nèi)含子突變及3’ 端非翻譯區(qū)突變等，新發(fā)突變高，且無明顯熱點突變。其中體細胞傾向于缺失，而生殖細胞傾向于點突變。

1 突變類型

1.1 錯義突變錯義突變通常是指編碼某一種的氨基酸的密碼子由于錯誤的堿基互補配造成氨基酸的改變，致使蛋白質(zhì)喪失原有的功能與結(jié)構(gòu)。柳州市婦幼保健院日前，對一例先證者為Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病的患兒進行基因突變鑒定與家系研究。該患兒女，8歲，生后即有神經(jīng)纖維瘤典型體征，軀干與四肢牛奶咖啡斑，2歲超聲顯示，左眼眶周腫塊等。使用高通量測序與sanger測序發(fā)現(xiàn)該患兒NF1基因c.1013 A>G雜合變異，該變異導(dǎo)致第338號氨基酸由天冬氨酸變?yōu)楦拾彼?(Asp變?yōu)镚ly)，為錯義突變，患兒生物學父母該位點未見異常，分析為散發(fā)的錯義突變[3]。

1.2 無義突變無義突變通常是指因為DNA的突變提前出現(xiàn)終止密碼子導(dǎo)致，使多肽鏈合成中斷，形成一段無意義的蛋白。重慶醫(yī)科大學17年報道了一例NF1無義突變的病例?；純号?先證者)，11歲。軀干及四肢見散在牛奶咖啡斑、腋窩雀斑及皮膚神經(jīng)纖維瘤。患兒家族中有類似疾病史，臨床診斷為Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病(NF1)?；驕y序明確突變位點為NF1基因c.2351 g>A，該突變是第一次在NF1基因中報道。先證者母親幼兒時也有Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤體征，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)患兒母親與患兒攜帶相同突變。國際人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)還未檢索到該突變[7]。

湖南航天醫(yī)院皮膚科報告1例I型神經(jīng)纖維瘤家系并進行基因突變的檢測。先證者男，5歲，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，先證者NF1基因的第2 620位堿基出現(xiàn)A/T雜合突變(c.2620 A >T)，致874位密碼子由原來編碼賴氨酸(Lys) 的AAG突變?yōu)門AG，形成提前終止密碼子，故造成蛋白截斷。而先證者的父親、祖母中也存在相同的突變，在(HGMD)中也尚未見此突變報告[8]。

1.3 基因大片段缺失與剪切突變北京協(xié)和醫(yī)院在2016年分析了8例Ⅰ神經(jīng)纖維瘤的病例，8例患兒就有7種突變的形式。其中兩例為NF1基因全部缺失，一例為基因的剪切突變c.3975-2delA(成熟RNA中含有內(nèi)含子或缺失外顯子序列的一類突變。)一例無義突變c.3721 C>T，p.R 1241 X。另外5名患者分別為四種突變則為c.49744977delCTAT，p.Y1659 TfsX17、c.39873988delAG，p.S1329fsX4、c.1511delC，p.P504QfsX22和c.6388delC，p.L2130fsX3[9]。

1.4 移碼突變(缺失突變)2014年，中國麻風皮膚病雜志刊登了NF1基因突變突變檢測的一篇文章，該兩名患者均有NF1典型體征，出生時軀干和四肢有咖啡牛奶斑，隨著年齡增長不斷擴大，但兩者聽力視力智力均正常。文章就這兩名患者進行sanger測序，其中一位患者測序結(jié)果為27號外顯子存在c.3691delA移碼突變(p.R1207DfsX8)[10]。安徽醫(yī)科大學陳濱的碩士學位論文中報道了一位NF1基因無義突變的患者(c.3443-3444delCA)，20號外顯子第3443-3444位置的兩個堿基缺失，導(dǎo)致后續(xù)終止密碼TGA提前出現(xiàn)，形成截短蛋白[11]。移碼突變是指在DNA片段中丟失或插入一個或幾個堿基，可以不是三的倍數(shù)，引起遺傳信息的改變。

2 NF1缺失類型分類

根據(jù)Dorschner等的相關(guān)研究[12]，總的來說可將NF1的缺失類型分為4大類(第1，2，3和非典型缺失)。1型缺失占所有大型NF1缺失的70～80%[13]，大多數(shù)1型NF1缺失是因為卵母細胞在減數(shù)分裂過程中，染色體間非等位基因同源重組(NAHR)造成的。NF1基因中的NAHR是由NF1-repa和NF1-repc所介導(dǎo)的低拷貝重復(fù)序列引起的。在這些低拷貝重復(fù)中，檢測到兩個NAHR熱點內(nèi)重復(fù)的斷點(recurrent breakpoints)，稱為同源重組位點1和2[14]。2型NF1缺失通常是由有絲分裂過程中的NAHR引起的，因此與體細胞位點缺失有關(guān)[15]。與1型NF1缺失相比，2型缺失與13個蛋白質(zhì)編碼基因的半合子性相關(guān)。至少10%的大型NF1缺失屬于2型，也許還遠遠不止[16]。3型NF1缺失非常罕見，這些1.0 MB的缺失僅發(fā)生在所有NF1總?cè)笔Щ颊咧械?%～4%，并且是由NF1-repb和NF1-repc之間的NAHR介導(dǎo)引起的，導(dǎo)致總共9個蛋白質(zhì)編碼基因的半合子性。非典型的NF1缺失并不表現(xiàn)出重復(fù)的斷點，并且就其大小和位于缺失區(qū)域內(nèi)的基因數(shù)量是非常不同的。非典型NF1缺失不僅在其長度上是高度異質(zhì)，而且就其潛在的突變機制而言，可能涉及異常DNA雙鏈斷裂修復(fù)或復(fù)制以及反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的機制[17]。

3 基因型與表型關(guān)系

迄今為止，僅鑒定了NF1中的少數(shù)的基因與表型的關(guān)系。其中之一是NF1基因第17外顯子中的三堿基對的缺失(c.2970-2972 delAAT)導(dǎo)致單個氨基酸(p.Met992del)的丟失，這種基因的改變與相對輕微的NF1表型相關(guān)，其特征是出現(xiàn)咖啡色斑(CALS)和皮褶雀斑，無外部可見的皮膚叢狀神經(jīng)纖維瘤[18]。另外NF1中與基因-表型相關(guān)的是密碼子p.Arg1809的錯義突變，具有該特異性NF1突變的個體表現(xiàn)出CALS(可能有雀斑，可能無)和Lisch結(jié)節(jié)，但沒有外部可見的叢狀神經(jīng)纖維瘤或皮膚神經(jīng)纖維瘤[19]。然而，密碼子p.arg1809的錯義突變似乎非常罕見，因為在7000名已識別突變的NF1患者隊列中，只有1.2%的患者觀察到錯義突變。在同一組患者中，同一種氨基酸缺失(p.Met992del)的發(fā)生率為0.8%[20]。

4 NF1高表型變異性原因

為了解釋NF1的高表型變異性，科學家們給出了三類不同因素的作用。第一個因素是發(fā)生在NF1胚胎發(fā)育中或者更早(如父母體內(nèi)配子發(fā)生)的突變性質(zhì)。NF1中一個非常小的部分突變都與患者特定的體征有關(guān)，所以這表明，突變的性質(zhì)并不是關(guān)鍵的決定因素[21]。第二個因素描述了一些特定已知的神經(jīng)纖維瘤修飾物的存在，包括但不局限于遺傳因子、性激素和腫瘤微環(huán)境[22]。第三個因素發(fā)生在細胞生長過程中的某一特定時間，與NF1基因的失活密切相關(guān)。NF1疾病患者只在他們身體的一小部分表現(xiàn)出來，最可能的解釋是體細胞嵌合體，第一個NF1突變發(fā)生在胚泡和成神經(jīng)細胞階段之間的胚胎發(fā)育后期，這樣一些細胞就可以存活下來，并保持NF1的野生型[23]。

5 NF1基因突變分析

NF1基因的突變率比大多數(shù)其他遺傳疾病基因高10倍左右[24]。目前，在人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)中，已有超過2600種不同的NF1遺傳突變點。被報道為是造成NF1疾病的原因，從跨越數(shù)個堿基大基因組的缺失到改變編碼氨基酸或剪接位點功能的單堿基對替換，其突變大小各不相同[25]。雖然NF1突變譜明確定義為錯義/無義(27.7%)，剪接(16.3%)，微缺失(26.9%)，微插入(11.1%)，總?cè)笔?> 20 bp；13.3%)，總插入(> 20 bp；2.0%)，復(fù)雜重排(0.6%)等，但沒有證據(jù)表明NF1內(nèi)有任何局部的突變簇[26]。大多數(shù)(> 80%)的NF1突變后蛋白失活，基本會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的完全缺失。由于基因大小和結(jié)構(gòu)較大，以及突變范圍跨度大，患者中NF1突變的鑒定仍然很困難[27]。一直以來，使用互補組合方法鑒定了95%患者的基因突變位點，方法包括蛋白質(zhì)截斷實驗，熒光原位雜交，異源雙鏈DNA，Southern印跡雜交和細胞遺傳學分析等[28]。一般初步的報告是通過測序檢測NF1患者的樣本，然后基于DNA的測序為臨床診斷測試提供結(jié)論(見阿拉巴馬大學伯明翰醫(yī)學基因組實驗室的網(wǎng)站)。因此，NF1突變分析有助于在臨床中診斷不確定的NF1的病例[29]。

6 討論

NF1基因突變類型及表型的闡明，可為下一步的研究奠定基礎(chǔ)，伴隨著新的基因治療手段和方法的出現(xiàn)，對于由NF1突變導(dǎo)致的疾病，采取基因治療方法治療該類疾病提供支撐和依據(jù)。