不同痰標(biāo)本處理方法對結(jié)核分枝桿菌羅氏培養(yǎng)檢測結(jié)果的影響

廣東省惠州市結(jié)核病防治研究所（516001）駱妙卡 溫曉萍 葉小利

結(jié)核病是全世界普遍面對的健康問題，對于這一疾病，主要的病因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌感染，所以對于結(jié)核病，盡早檢出結(jié)核分枝桿菌對疾病的診斷有重要意義[1]。在結(jié)核分枝桿菌的具體檢測上，臨床中常常是采取細(xì)菌學(xué)檢查的方法，該方法一直以來都被作為臨床診斷結(jié)核病的“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]。在具體行結(jié)核分枝桿菌的檢查中，常選取痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測，在具體的檢測中，痰標(biāo)本處理方式的不同與檢測結(jié)果存在緊密的聯(lián)系。本研究中，探討了應(yīng)用不同的痰標(biāo)本處理手段對于結(jié)核分枝桿菌檢測結(jié)果的影響，旨在為結(jié)核病的診治提供有利參考，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月～2019年1月本院檢驗(yàn)中心接收的100份肺結(jié)核患者的痰液標(biāo)本為研究對象。標(biāo)本對應(yīng)的患者一般資料如下：男性56例，女性44例；年齡最小者32歲，年齡最大者62歲，平均年齡（48.5±2.4）歲。

1.2 方法

1.2.1 痰液標(biāo)本采集、處理 進(jìn)行痰液標(biāo)本的采集前，囑咐患者使用無菌的生理鹽水漱口，采用無菌棉拭子擦拭口腔以收集口腔內(nèi)側(cè)痰液。每一名患者均收集3份相同含量的標(biāo)本。

針對采集到的痰液標(biāo)本，6h內(nèi)進(jìn)行標(biāo)本的處理。3份痰液標(biāo)本的處理方法如下：①使用3%HCl進(jìn)行處理。在痰標(biāo)本中加入2～4倍量濃度為3%的HCl溶液，將痰標(biāo)本同HCl溶液進(jìn)行混勻并在室溫環(huán)境下放置15～20min。標(biāo)本的放置過程，可進(jìn)行3次左右的振蕩，讓痰液可完全得到液化。之后將試管置入到3000r/min的離心機(jī)中持續(xù)離心5min，取分離出的上層清液并采用4%的NaOH調(diào)節(jié)溶液的PH值在中性水平。②使用4%NaOH處理標(biāo)本。將4%的NaOH的溶液加到采集標(biāo)本中，加入量為標(biāo)本2～4倍，混勻后將試管放在室溫下20min，同樣離心并獲取上層清液，之后使用3%的HCl將溶液的PH調(diào)節(jié)到中性水平。③使用6%H2SO4處理標(biāo)本。采集到的痰標(biāo)本加入2～4倍量的6%H2SO4溶液，混合后置入室溫下20min，溶液經(jīng)離心后獲取上層清液，應(yīng)用4%的NaOH將溶液調(diào)節(jié)為中性水平。

1.2.2 羅氏培養(yǎng)基的制作與接種 選取6 0 0 m l 的豆浸液、2.4 g K H2P O4、0.24gMgSO4·7H2O、0.6g枸櫞酸鈉鹽、3.6g天門冬素、12ml甘油及30g馬鈴薯淀粉，將上述物質(zhì)混合加入燒杯中行加熱融化?；旌虾罄鋮s，將2%100ml的新鮮雞卵液、2%20ml孔雀綠加入其中，之后分裝溶液，每個試管均裝5ml的溶液，將其置入75℃～80℃的環(huán)境下，連續(xù)3d，以作備用。選取經(jīng)過上面處理的痰標(biāo)本，接種于斜面培養(yǎng)基上，注意將培養(yǎng)基接滿，每一份標(biāo)本均接種兩管，同一患者接6管。對各培養(yǎng)基均做相關(guān)的標(biāo)記，之后將培養(yǎng)基放在37℃的孵化箱中進(jìn)行培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)3～4周，并且在培養(yǎng)期間做好定期的監(jiān)測，可每隔3d觀察一次。標(biāo)本的觀察方法采取肉眼、抗酸染色、顯微鏡結(jié)合的方式。

1.3 觀察指標(biāo) ①評價3種方法處理的痰標(biāo)本檢測結(jié)核分枝桿菌的陽性情況。判定方法為：肉眼觀察培養(yǎng)基上無斜面菌落生長，涂片行抗酸染色后置于顯微鏡下觀察無抗酸菌為陰性；若肉眼觀察培養(yǎng)基上有菌落生長，涂片行抗酸染色后若在顯微鏡下看見抗酸菌落提示為陽性。②判斷3組標(biāo)本的污染率，具體的判定方法上，主要選取適宜標(biāo)本份數(shù)計(jì)量，同一標(biāo)本的2個接種管若均出現(xiàn)污染則確定為污染，如若只是單個接種管受到污染則不認(rèn)為是污染。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS20.0軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果分析，計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陽性率比較 對羅氏培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示在分枝桿菌檢測的陽性率上，使用3%HCl、6%H2SO4這兩組處理方法得出的陽性率無顯著差異（P＞0.05），使用4%NaOH方法處理的標(biāo)本陽性率為96.00%，同3%HCl陽性率84.00%、6%H2SO4陽性率83.00%對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 標(biāo)本污染率 對3組標(biāo)本的污染情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示采用3%HCl與6%H2SO4處理的痰標(biāo)本污染率分別為6.0 0%、7.0 0%，組間對比無顯著差異（P＞0.05），使用4%NaOH處理的標(biāo)本無污染情況，同其他兩種處理方法對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

對于結(jié)核病，采取結(jié)核分枝桿菌羅氏培養(yǎng)是臨床中常用的診斷方法[3]。在具體的檢測中，常采集患者的痰標(biāo)本進(jìn)行分枝桿菌羅氏培養(yǎng)[4]。然而雖然說羅氏培養(yǎng)檢測的方式可獲得顯著的檢測效果，但是這也是基于對痰標(biāo)本的科學(xué)處理上，因?yàn)槿魧μ禈?biāo)本處理不當(dāng)，常會引起較高的假陽性率與假陰性率，這讓部分患者錯過最佳的治療時機(jī)，進(jìn)而影響患者的預(yù)后。

在行結(jié)核桿菌羅氏培養(yǎng)檢測中，檢測操作中采集痰標(biāo)本是第一步，然后是對標(biāo)本進(jìn)行處理[5]。標(biāo)本的處理是非常關(guān)鍵的操作環(huán)節(jié)，其目的是對標(biāo)本中的分枝桿菌進(jìn)行分離，分離越好后續(xù)得出的陽性率也越佳。在處理的操作上，通常是采用酸性或堿性的溶液實(shí)現(xiàn)結(jié)核桿菌的分離，之后采取酸堿中和的方式獲取溶液，最后進(jìn)行菌種的培養(yǎng)，針對處理操作中溶液的選擇，目前尚無準(zhǔn)確的結(jié)論[6]?；诖?，本研究中就探討了使用3%HCl、6%H2SO4與4%NaOH這3種酸/堿溶液對痰標(biāo)本的處理效果，結(jié)果顯示在經(jīng)相關(guān)處理后，結(jié)合桿菌羅氏培養(yǎng)檢測結(jié)果顯示采取4%NaOH溶液處理的標(biāo)本陽性率明顯較其他兩種溶液處理得出的陽性率高，這一結(jié)果表明：采用4%NaOH的溶液對痰標(biāo)本進(jìn)行處理，可以在混合20min內(nèi)盡可能的將標(biāo)本中的結(jié)合桿菌分離出來，如此有助于標(biāo)本的后續(xù)分離培養(yǎng)，這樣可顯著提升結(jié)核分枝桿菌行羅氏培養(yǎng)檢測的陽性率[7]。此外研究結(jié)果還顯示，對三種經(jīng)不同方法處理的標(biāo)本污染率進(jìn)行對比，結(jié)果也顯示采用4%NaOH的溶液污染率明顯較3%HCl與6%H2SO4這兩種溶液處理的標(biāo)本污染率較低，這也提示使用4%NaOH溶液處理痰標(biāo)本不會對標(biāo)本的生物學(xué)活性產(chǎn)生影響，如此可顯著提高標(biāo)本質(zhì)量。

綜上所述，在結(jié)核病行結(jié)核分枝桿菌羅氏培養(yǎng)的操作中，對采集到的標(biāo)本使用4%NaOH的溶液進(jìn)行處理，可顯著提高檢測結(jié)果的陽性率，降低痰標(biāo)本污染率，提高結(jié)核病的診斷價值，因此值得在臨床中大力推廣應(yīng)用。