尚 雪, 羅 陽

(1. 遼寧省金秋醫(yī)院 口腔科, 遼寧 沈陽, 110000; 2. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院, 遼寧 沈陽, 110000)

牙周炎是臨床上常見的一種以牙周膜結(jié)締組織破壞和牙槽骨吸收為特征的慢性炎癥，常由宿主免疫反應(yīng)和微生物感染引起。牙周炎的發(fā)生、發(fā)展與多種因素密切相關(guān)，包括年齡、性別和是否吸煙[1-2]。Qandil R[3]研究發(fā)現(xiàn)，吸煙是增加牙周探診深度的獨立危險因素，會影響牙周血液循環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致齦下微生物菌群發(fā)生改變，齦溝液中多種細(xì)胞因子增加，最終造成牙周纖維結(jié)締組織破壞[4-6]。肝細(xì)胞生長因子(HGF)主要由間充質(zhì)細(xì)胞合成，并在炎癥反應(yīng)中由單核細(xì)胞大量表達(dá)。Kakimoto 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，牙齦組織中的炎性細(xì)胞HGF表達(dá)量高，并認(rèn)為在牙周袋的形成以及牙槽骨吸收的病理發(fā)展過程中HGF起到重要的調(diào)控作用。但關(guān)于HGF與慢性牙周炎炎癥程度的關(guān)系目前研究尚少。吸煙是牙周疾病產(chǎn)生及發(fā)展的主要誘發(fā)因素之一，研究[8-9]認(rèn)為其可能會引起牙周局部的小血管收縮，進(jìn)而影響體液和細(xì)胞免疫誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。本研究觀察HGF在輕中重度慢性牙周炎牙齦組織中的表達(dá)水平以及與吸煙的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年8月—2019年8月遼寧省金秋醫(yī)院口腔內(nèi)科就診的慢性牙周炎患者110例作為慢性牙周炎組，其中輕中度者75例為輕中度慢性牙周炎組，平均年齡(46.24±6.29) 歲，重度35例為重度慢性牙周炎組，平均年齡(48.24±6.11) 歲; 不吸煙者55例，平均年齡(45.32±5.62) 歲，吸煙者55例，平均年齡(48.38±6.03) 歲。同時選取因第三磨牙阻生而拔除且牙周組織健康者110例作為對照組，其中不吸煙者84例，平均年齡(27.98±3.21) 歲; 吸煙者26例，平均年齡(24.67±4.32) 歲。所有吸煙者的吸煙年限為2～32年。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 近3個月內(nèi)無牙周病治療史及抗生素用藥史且無感染及其他全身性疾病; ② 牙周健康者的牙周組織無炎癥; ③ 慢性牙周炎組患者納入標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)按美國牙周病協(xié)會(APP) 1999年制定的牙周炎分類標(biāo)準(zhǔn)[14], 并根據(jù)附著喪失(CAL) 將牙周炎分為輕中度(CAL≤3～5 mm)、重度(CAL>5 mm); ④ 所有參與患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 實驗標(biāo)本制備: 術(shù)前告知所有研究對象手術(shù)的具體取樣情況并簽署知情同意書。慢性牙周炎組于牙周翻瓣術(shù)中切取其牙齦組織; 對照組在拔除阻生牙時切取其健康牙齦組織。牙齦組織取到后立即進(jìn)行磷酸緩沖鹽溶液(PBS) 沖洗3次，放入無酶EP管中，并置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測HGF mRNA表達(dá)水平: 將牙齦組織樣本在液氮冷凍下充分研磨，加Trizol 裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，按照Trizol試劑盒說明書方法提取總RNA; 經(jīng)紫外分光光度計檢測確定其OD260/280在1.8～2.0后，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。然后以cDNA為模板, β-actin為內(nèi)參抗體，用7500 RT-PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？偡磻?yīng)體系20.0 μL, 分別為SyB 10.0 μL、RoX 0.4 μL、cDNA 2.0 μL, 上、下游引物(10.0 μmol/L)各0.8 μL, 雙蒸水(ddH2O) 6.0 μL。反應(yīng)條件: 95 ℃, 30 s; 95 ℃, 5 s; 60 ℃, 34 s (40個循環(huán))+讀板，每個樣本設(shè)置3個平行孔。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)各樣本目的基因和內(nèi)參基因的反應(yīng)CT值，采用2-△△CT法計算各樣本中HGF mRNA的相對表達(dá)量。各引物序列如下: HGF上游引物, 5′-TAAGAAGAGCACTGAGAGGTGGAA -3′, 下游引物: 5′-AATATCAGAGAGGTGGAA-3′, 產(chǎn)物長度180 bp。β-actin上游引物: 5′ -GAGCTACGAGCTGCCTGA CG-3′, 下游引物: 5′ -GTAGTTTCGTGGATGCCACAG -3′, 產(chǎn)物長度120 bp。所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用方差分析及LSD檢驗對各組吸煙者和不吸煙者的HGF mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較。檢驗水準(zhǔn)為α= 0.05。

2 結(jié) 果

2.1 2組牙齦組織中HGF mRNA表達(dá)水平比較

RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，慢性牙周炎組牙齦組織中HGF mRNA的表達(dá)水平為(2.17±0.09), 顯著高于對照組的(1.04±0.07) (P<0.05)。

2.2 輕中重度慢性牙周炎患者牙齦組織中

HGF mRNA表達(dá)水平比較

輕中度、重度慢性牙周炎組牙齦組織中HGF mRNA的表達(dá)水平分別(1.71±0.08)、(3.00±0.09), 均顯著高于對照組的(1.04±0.07)(P<0.05); 且重度慢性牙周炎組牙齦組織中HGF mRNA的表達(dá)水平顯著高于輕中度慢性牙周炎組(P<0.05)。

2.3 吸煙對慢性牙周炎組及對照組牙齦組織中

HGF mRNA表達(dá)水平的影響

對照組和慢性牙周炎組中，牙齦組織中HGF mRNA的平均表達(dá)水平為吸煙者高于不吸煙者，其中以慢性牙周炎組中吸煙者的HGF mRNA表達(dá)水平最高，其表達(dá)水平由高到低依次為: 慢性牙周炎組吸煙者(3.03±0.15)>慢性牙周炎組不吸煙者(2.36±0.17)>對照組吸煙者(1.18±0.01)>對照組不吸煙者(1.00±0.07); 對照組吸煙者與對照組不吸煙者HGF mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 其他各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) 。

3 討 論

HGF最早是從鼠的部分肝臟血清中分離出來的，之后又在鼠的血小板、肝細(xì)胞和人的血液中提取出來，是一種具有生物活性的生長因子。研究[15-18]發(fā)現(xiàn)，其在眼部組織中可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，刺激眼內(nèi)多種其它細(xì)胞的生長和移行。在肌腱成纖維細(xì)胞中HGF依賴AMPK信號通路抑制肌纖維母細(xì)胞分化。研究[19]顯示, HGF在牙周炎患者的牙齦組織和牙周膜中存在過量表達(dá)。經(jīng)牙周基礎(chǔ)治療后，患者齦溝液中HGF水平可明顯下降。

本研究通過RT-PCR技術(shù)對慢性牙周炎組和健康牙齦組織中HGF mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎組中HGF mRNA的表達(dá)量明顯顯著高于健康牙齦組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明HGF在慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用。在重度慢性牙周炎患者中，牙齦組織中HGF mRNA的表達(dá)水平顯著高于輕中度患者(P<0.05), 表明隨著牙周炎癥的加重，其牙齦組織中HGF mRNA的表達(dá)水平也相應(yīng)升高。本研究還發(fā)現(xiàn)，無論是對照組還是慢性牙周炎組，其牙齦組織中HGF mRNA的表達(dá)水平均為吸煙者高于不吸煙者，且以慢性牙周炎組吸煙者HGF mRNA的表達(dá)水平最高。該結(jié)果證實吸煙可導(dǎo)致牙齦組織中HGF mRNA的表達(dá)水平升高，并可能會加重牙周炎癥。

綜上所述, HGF mRNA在慢性牙周炎患者牙齦組織中高表達(dá)，且與慢性牙周炎患者嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且吸煙患者中HGF的mRNA表達(dá)水平也高于非吸煙患者，提示吸煙可能通過上調(diào)HGF來誘發(fā)慢性牙周炎以及參與調(diào)控其疾病的進(jìn)展過程，可作為標(biāo)志物來診斷疾病。