石玉花，李瑞萍，陳小蕓，楊 艷，郭鈺珍

0 引言

異甘草素(Isoliquiritigenin，ISL)，又名2,2,4-三羥基查耳酮，是從豆科植物甘草、脹果甘草以及光果甘草根莖中提取的黃酮類化合物，其分子式為C15H12O4。近年來，關于異甘草素的藥理作用研究成為熱點，研究發(fā)現(xiàn)，異甘草素在抗腫瘤、抗炎、抗過敏、抗病毒、治療心律失常以及保肝等方面有重要作用。

國內(nèi)外眾多研究顯示，異甘草素對神經(jīng)膠質瘤[1-5]、口腔癌[6-8]、肺癌[9-13]、乳腺癌[14-19]、肝癌[20]、胃癌[21-22]、胰腺癌[23]、結直腸癌[24-26]、腎癌[27]、膀胱癌[28]、前列腺癌[29]以及女性常見的卵巢癌[30-33]、子宮內(nèi)膜癌[34]和宮頸癌[35-36]等均表現(xiàn)出良好的抗癌活性，其抗癌機制為多類型的，可以從癌細胞的形成、增殖、遷移以及誘導凋亡等多個方面發(fā)揮抗癌作用，本文就異甘草素的抗腫瘤作用及可能的機制研究進展進行綜述，為異甘草素的深入研究和抗腫瘤新藥的開發(fā)提供依據(jù)。

1 阻滯細胞分裂周期，誘導細胞凋亡

Hsia等[7]在研究ISL對人口腔鱗狀細胞癌(OSCC)的抗癌作用時，發(fā)現(xiàn)ISL可誘導OSCC細胞周期G2/M期阻滯、細胞凋亡和DNA損傷。DNA修復相關的毛細血管擴張共濟失調突變基因(ATM)和磷酸化ATM也被下調，認為ATM被ISL激活的caspase分解，從而抑制OSCC細胞中的DNA修復，引起OSCC 的凋亡。陳利軍等[37]探討ISL對人食管鱗癌細胞系EC9706和 KYSE450的影響及其作用機制時，發(fā)現(xiàn)ISL抑制食管鱗癌細胞EC9706與KYSE450的增殖與其劑量呈正比例關系，ISL還可將此兩種細胞周期阻滯在G2/M 期，誘導其發(fā)生凋亡，并且顯著下調細胞中 IGF-1R表達，抑制下游PI3K/AKT和 RAS/MAPK信號通路的激活，從而發(fā)揮抗食管癌活性。Zhou等[12]的研究結果表明，含有ISL的活性提取物可上調組織中p53、p21、促凋亡成員Bax、Bid蛋白的表達和下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，并通過增加啟動子caspase-8和caspase-9的酶活性來激活效應子caspase-3和caspase-7，導致內(nèi)在細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)激活，從而引起非小細胞肺癌A549細胞凋亡。

Si等[28]發(fā)現(xiàn)，ISL在體外誘導人膀胱癌T24細胞凋亡的機制可能與細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)活性升高、線粒體膜電位下調和caspase-3/caspase-9介導的線粒體凋亡信號通路激活有關。Zhang等[29]研究ISL在人前列腺癌PC-3和22RV1細胞中的抗癌功效和相關機制時，發(fā)現(xiàn)ISL可在體外引起G2/M細胞周期停滯，并抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。其使用微陣列轉錄分析來鑒定前列腺癌PC-3細胞上的ISL調節(jié)基因。經(jīng)過ISL處理后，參與細胞周期、DNA損傷和凋亡信號通路的多個基因發(fā)生了顯著變化。分子研究顯示，G2/M阻滯與細胞周期蛋白B1、細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)和磷酸化CDK1(Thr14，Tyr15和Thr161)的減少有關，同時與14-3-3sigma的表達增加和DNA損傷誘導的45α(GADD45A)增加有關。此外，研究者用較高濃度ISL處理誘導細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)其主要與增強凋亡調節(jié)因子(Bax/Bcl-2)的比例有關。結果表明，ISL調節(jié)細胞周期蛋白B1與CDK1使得細胞于G2/M期停滯，并增強凋亡因子誘導癌細胞的凋亡。Chen等[31]研究ISL對人卵巢癌的抗腫瘤作用時，通過流式細胞術分析，表明ISL誘導卵巢癌OVCAR5細胞G2/M期阻滯。Wu等[34]研究表明，ISL處理人子宮內(nèi)膜癌細胞系(Ishikawa，HEC-1A和RL95-2細胞)后，可誘導癌細胞停滯于G1或G2/M期，從而抑制癌細胞增殖、誘導細胞凋亡。Hirchaud等[35]研究ISL對人類宮頸癌細胞Ca Ski、SiHa、HeLa和C-33A的抗增殖和凋亡活性時，發(fā)現(xiàn)ISL可以降低癌細胞活力、誘導G2/M期細胞積聚和4種癌細胞發(fā)生凋亡的形態(tài)改變。在Ca Ski細胞中，ISL導致HPV16 E6、Bcl-2表達下調，而p53、p21和Bax表達增強，Bid觸發(fā)線粒體膜電位消散，使其釋放細胞色素C至細胞質后激活半胱天冬酶級聯(lián)反應，裂解caspase-9、caspase-3、caspase-8和PARP，引起宮頸癌細胞的凋亡。以上發(fā)現(xiàn)拓寬了對ISL介導的細胞凋亡分子基礎的理解。

2 誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬

Wang等[15]研究表明，ISL可增強阿霉素耐藥的人乳腺癌MCF-7/ADR細胞的化療敏感性，并誘導細胞發(fā)生自噬。Jin等[26]研究ISL在結直腸癌(CRC)細胞中的抗癌機制時，發(fā)現(xiàn) ISL可誘導人HCT-116細胞凋亡并引起p62/SQSTM1 mRNA和蛋白的表達，p62/SQSTM1是與自噬相關的最常見的標志物。結果表明，ISL誘導p62/SQSTM1上調從而減弱CRC細胞中胱天蛋白酶-8活化而影響ISL介導的癌細胞凋亡。張棟棟等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，ISL對人卵巢癌SKOV3細胞具有明顯的抑制增殖和誘導凋亡的作用，其抗體外腫瘤機制可能與激活線粒體凋亡通路及自噬通路相關。Yushan等[38]在探索ISL對鼠肉瘤S180細胞的作用機制時，發(fā)現(xiàn)ISL不能直接體外抑制S180的生長，但是可抑制體內(nèi)S180腫瘤細胞的體積。NK細胞中的TNF-α被siRNA敲除時，ISL對S180腫瘤沒有抑制作用。通過FCM檢測發(fā)現(xiàn)，ISL可增強NK細胞中TNF-α的表達，自噬相關蛋白LC3-II、Beclin-1、ATG-7在與ISL處理的NK細胞共培養(yǎng)的S180細胞中升高。當TNF-α被siRNA敲低時，ISL不能在S180腫瘤中誘導自噬。在骨肉瘤患者的NK細胞中，通過ELISA檢測，TNF-α與GSK-3β呈負相關，ISL可以抑制GSK-3β的表達，并進一步增加NK細胞中p65和c-Rel的表達，但當細胞中的GSK-3β被siRNA敲除時，ISL并不影響p65和c-Rel的表達。這是因為ISL可以直接抑制GSK-3β，然后激活NF-κB通路，增強NK細胞中TNF-α的表達，從而誘導肉瘤自噬。Yang等[39]研究發(fā)現(xiàn)，ISL也可誘導嗜鉻細胞瘤細胞(PC-12細胞)發(fā)生自噬，達到治療嗜鉻細胞瘤的作用。Yang等[40]研究發(fā)現(xiàn)，ISL可誘導自噬引起人表皮黑色素細胞退化，從而治療黑色素瘤，其作用與PI3K/AKT/mTOR信號通路有關。

3 抑制腫瘤細胞的轉移

Dang等[2]研究發(fā)現(xiàn)，ISL可能通過下調基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達來抑制細胞神經(jīng)膠質瘤干細胞遷移和侵襲，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。Hu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，ISL可以抑制口腔鱗狀細胞癌干細胞(OSCC-CSCs)侵襲、轉移和生長為集落的能力，并且能夠增強化療藥物對口腔鱗狀細胞癌的敏感性。Chen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，ISL介導的肺癌細胞轉移抑制作用是由細胞骨架重組和黏著斑組裝受損引起的，是因為ISL代謝產(chǎn)物干擾了Src激酶。Wang等[17]研究ISL對巨噬細胞M2表型極化的調控作用時，發(fā)現(xiàn)ISL可以逆轉M2表型巨噬細胞的極化，并通過提高 miR155表達和抑制 STAT3/6 信號通路活化，從而影響精氨酸酶 1(Arg-1)，誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和血紅素加氧酶 1(HO-1)的表達，達到抑制M2巨噬細胞對乳腺癌細胞轉移的促進作用。

4 抑制腫瘤細胞的發(fā)生

乳腺癌干細胞(CSCs)是乳腺腫瘤發(fā)生的根源。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，ISL可以減少CSCs群，抑制體內(nèi)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。其通過全局基因表達譜測定法鑒定了WIF1為ISL治療的主要應答基因，可引起β-連環(huán)蛋白信號傳導的下調和乳腺CSCs中的G0/G1期阻滯。并用甲基化分析進一步揭示了ISL通過促進其啟動子的去甲基化來增強WIF1基因表達，這與DNMT1甲基轉移酶的抑制密切相關，分子對接分析顯示，ISL可以穩(wěn)定地進入DNMT1的催化結構域。以上研究證明，ISL可以作為膳食補充劑用于抑制乳腺癌的發(fā)生。劉方康等[22]研究表明，ISL通過誘導分化和抑制增殖對人神經(jīng)膠質細胞瘤干細胞(GSCs)具有抗腫瘤作用。Zhao等[25]認為，M2巨噬細胞極化與結直腸癌的發(fā)展有關，他們以氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的結腸炎相關腫瘤發(fā)生的小鼠為模型，發(fā)現(xiàn)通過ISL下調PGE2和IL-6信號傳導限制了M2巨噬細胞的極化，有效抑制了結腸炎相關的腫瘤發(fā)生。

5 引起腫瘤細胞凋亡作用

有研究認為，ROS可通過外在細胞死亡受體和內(nèi)在線粒體細胞死亡途徑引起細胞凋亡[41]，因此，ROS形成增加和隨后誘導細胞凋亡是一種治療癌癥的新方法[42]。Hou等[8]在研究ISL抑制舌鱗癌細胞Tca8113的增殖實驗中，用熒光顯微鏡檢測細胞內(nèi)ROS時發(fā)現(xiàn)ROS降低。說明ISL抑制Tca8113的增殖、黏附、轉移以及促進其凋亡的作用可能與抗氧化有關。而Kim等[27,41]的研究認為，ISL通過使細胞產(chǎn)生ROS誘導腎癌Caki細胞和嗜鉻細胞瘤細胞(PC-12細胞)凋亡，其機制分別可能與誘導p53的產(chǎn)生、抑制STAT3信號通路和引起線粒體-細胞色素C-caspase蛋白酶內(nèi)在機制的激活有關。閻新燕等[43]的研究中，ISL能夠抑制人黑色素瘤A375細胞的惡性增殖，最終誘導細胞凋亡，推測其作用機制可能是ISL通過引起活性氧升高、線粒體膜電勢下降，從而影響 A375 細胞的糖酵解途徑而導致細胞凋亡。所以在ISL是減低細胞中活性氧還是增加細胞中活性氧的產(chǎn)生從而引起腫瘤細胞的凋亡這一機制上需要進一步的研究。

6 多種機制的抗腫瘤作用

Tian等[9]在探究ISL抑制肺癌A549細胞增殖和遷移的分子機制時，發(fā)現(xiàn)ISL顯著下調A549細胞中E-鈣黏蛋白的表達，并上調N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達。流式細胞術分析顯示。ISL處理A549細胞后凋亡顯著增加，促凋亡蛋白Bcl-2相關X蛋白和活性caspase-3的表達增加，抗凋亡蛋白表達降低。ISL處理的細胞中，磷酸化AKT和雷帕霉素靶點蛋白表達水平降低，細胞增殖蛋白P70和細胞周期蛋白D1的表達顯著降低。由此得出ISL對A549細胞的增殖和遷移具有顯著的抑制作用，并且可誘導肺癌細胞的凋亡。該機制可能涉及A549細胞中的PI3K/AKT信號傳導途徑，其可能是治療肺癌的潛在治療靶標。Zhang等[21]研究了ISL對MKN28胃癌細胞的作用和潛在機制，發(fā)現(xiàn)ISL可能通過抑制磷酸肌醇3激酶/AKT/mTOR(PI3K-AKT-mTOR)信號通路，影響MKN28細胞的凋亡、自噬、增殖、遷移和侵襲。Li等[30]觀察到ISL對卵巢癌SKOV3和OVCAR3細胞的遷移、侵襲有明顯的抑制作用，并可誘導這兩種細胞的凋亡。實驗發(fā)現(xiàn)，ISL處理增加了SKOV3和OVCAR3細胞中Bax/Bcl-2的比率，表明線粒體凋亡途徑被觸發(fā)。他們還觀察到用ISL處理細胞后，Akt和mTOR的磷酸化形式減少，GSK3β的表達增加，而P70/S6K減少。ISL還通過降低Ishikawa和ES-2細胞中p-Akt、p-mTOR、P70/S6K和細胞周期蛋白D1的表達水平來抑制PI3K/Akt/mTOR途徑。這些結果表明，ISL通過PI3K/Akt/mTOR途徑抑制卵巢癌細胞SKOV3和OVCAR3的增殖和侵襲，并誘導SKOV3和OVCAR3細胞的凋亡。Chen等[44]的研究也發(fā)現(xiàn)，ISL可能通過抑制PI3K/Akt信號通路，延緩骨肉瘤U2OS細胞的增殖并促進細胞凋亡。

7 其他途徑抗腫瘤作用

現(xiàn)有的理論認為，非小細胞肺癌(NSCLC)的發(fā)生與多種遺傳改變相關，包括表皮生長因子受體(EGFR)的突變。Jung等[11]在體外測定激酶結果，發(fā)現(xiàn)ISL可以抑制野生型和雙突變體(L858R/T790M)EGFR的催化活性。ISL還降低了NSCLC細胞中Akt和ERK1/2的磷酸化，并減弱了Akt1和ERK2的激酶活性。ISL通過與EGFR及其下游信號激酶Akt1和細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)1/2相互作用抑制其催化活性，從而抑制并誘導EGFR敏感性或EGFR耐藥性肺癌細胞的凋亡。Peng等[14]認為，ISL通過降低miR-374a表達來抑制異常Akt信號傳導并增加PTEN表達的途徑誘導細胞凋亡負向調節(jié)乳腺癌的生長。Zheng等[18]通過流式細胞術和酶裂解檢測法發(fā)現(xiàn)，ISL在MDA-MB-231和BT-549人乳腺癌細胞中誘導失巢凋亡，可能是通過抑制環(huán)氧合酶2(COX-2)和細胞色素P450(CYP)4A信號傳導并降低乳腺癌細胞中前列腺素E2(PGE2)、20-羥基二十碳四烯酸(20-HETE)和磷酸-Akt[Thr(308)]的分泌來發(fā)揮抗癌作用的。Li等[20]和Zhao等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，ISL可逆性抑制DNA拓撲異構酶(Top I)的活性，降低腫瘤細胞的解旋率，在誘導肝癌細胞和U87膠質瘤細胞凋亡中起重要作用。目前的研究認為，腸道菌群的失調與結腸炎相關的結直腸癌(CAC)有關，中藥逐漸被用于調整腸道微生物群。Wu等[24]的研究中，使用氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸鈉(AOM/DSS)誘導CAC小鼠模型(CACM)，評估ISL對CAC發(fā)育和腸道微生物群的影響。組織病理學分析表明，ISL降低了體內(nèi)腫瘤發(fā)生率。與對照小鼠(CK)中的微生物群相比，CAC小鼠發(fā)育期間，腸道中擬桿菌的水平降低，而厚壁菌門的水平增加。筆者認為，ISL逆轉了菌群的不平衡，改變了腸道微生物群的家族成分。用高劑量ISL處理小鼠后，腸道中螺旋桿菌科的數(shù)量增加，而毛螺菌科和理研菌科的數(shù)量下降。在菌群屬的水平上，ISL減少了機會致病菌(埃希氏菌和腸球菌)的水平，而增加了益生菌的水平，特別是產(chǎn)丁酸鹽的菌群(丁酸梭菌、梭菌和瘤胃球菌)。因此，認為ISL保護小鼠免受AOM/DSS誘導的CAC，并且ISL和腸道微生物群具有協(xié)同的抗癌作用。

8 小結

本文基于已有的研究，綜述了異甘草素抗腫瘤的作用及可能的機制，作用涉及腫瘤的發(fā)生、轉移、凋亡各個過程，但都未完全明確，需要在這些可能的機制基礎上進一步研究，得到更多有效的抗腫瘤靶點并明確ISL抗腫瘤的機制，且其天然、安全、經(jīng)濟易得，其能否應用于腫瘤的輔助治療，需要我們更多的探索。