高東曉，劉 丹，郭 強(qiáng)，羅 瑛*，劉 靜*

(1.昆明理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 衰老與腫瘤分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 云南 昆明 650500； 2.云南省第一人民醫(yī)院消化疾病內(nèi)科學(xué)研究所， 云南 昆明 650011)

生物鐘(biological clock)普遍存在于生物體內(nèi)，并影響著生物的生理、生化和行為活動(dòng)等。生物鐘的紊亂會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期、凋亡、免疫功能等異常，而這些與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)基[1]。本文結(jié)合新近國內(nèi)外關(guān)于生物鐘的研究，就生物鐘對(duì)腫瘤發(fā)生的重要性和在腫瘤治療中的應(yīng)用作一介紹。

1 生物鐘概述

機(jī)體的生理、代謝和行為活動(dòng)等都遵從一定的晝夜變化規(guī)律，而這種變化是由生物鐘調(diào)控的。生物鐘受多種因素的影響，如光照、進(jìn)食時(shí)間等。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的生物鐘包括：中樞生物鐘(俗稱母鐘)和外周生物鐘(俗稱子鐘)兩大類，中樞生物鐘通過調(diào)節(jié)機(jī)體的睡眠/覺醒、進(jìn)食時(shí)間等調(diào)控外周生物鐘。中樞生物鐘位于下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)，主要由3個(gè)必需元件組成：中央振蕩器、能感知外界的時(shí)間并隨其變化而重新設(shè)置時(shí)鐘能力的輸入通路、與振蕩器相關(guān)的輸出通路[2]。

生物節(jié)律的維持主要受生物鐘基因的調(diào)控。目前發(fā)現(xiàn)的主要生物鐘基因有：周期蛋白(period，PER)家族(包括PER1、PER2、PER3)、隱花色素(cryptochrome，CRY)家族(包括CRY1、CRY2)、晝夜節(jié)律運(yùn)動(dòng)輸出周期故障(circadian locomotor output cycles kaput，CLOCK)、 腦和肌肉組織芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類似蛋白1(brain and muscle ARNT-like protein 1，BMAL1)、酪氨酸激酶1ε(casein kinase 1ε，CK1ε)、永恒蛋白(timeless，TIM)、神經(jīng)元PAS域蛋白2(neuronal PAS domain protein 2，NPAS2)和視黃酸受體相關(guān)的孤兒受體α(retinoic acid receptor-related orphan receptorα，RORα)等。核心時(shí)鐘基因主要包括編碼激活因子CLOCK和BMAL1，以及編碼抑制因子PER1、PER2、CRY1和CRY2[3]。生物鐘基因通過調(diào)控鐘控基因(clock control genes，CCGs)來調(diào)節(jié)下游事件，進(jìn)而參與細(xì)胞凋亡、代謝、內(nèi)分泌信號(hào)和免疫等多種生理活動(dòng)[4-5]。生物鐘調(diào)控的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋回路，其中一個(gè)反饋回路為：細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子BMAL1與CLOCK(或NPAS2)結(jié)合形成異二聚體BMAL1/CLOCK(或BMAL1/NPAS2)結(jié)合到靶基因的增強(qiáng)子E-box (enhancer box)區(qū)域，導(dǎo)致這些基因被激活，如：PER1/2/3和CRY1/2 等，之后PERs和CRYs在細(xì)胞質(zhì)中富集，并進(jìn)行一系列的翻譯后修飾，當(dāng)積累達(dá)到臨界值時(shí)，就會(huì)進(jìn)入核內(nèi)抑制BMAL1/CLOCK(或BMAL1/NPAS2)二聚體的活性，從而抑制自身基因的轉(zhuǎn)錄[6]。另一個(gè)反饋回路為：REV-ERB(REV-ERB/ROR response element)是BMAL1的負(fù)調(diào)控因子，ROR是正調(diào)節(jié)因子[7](圖1)。不同反饋回路之間的相互作用使生物鐘的調(diào)控出現(xiàn)近似24 h的周期，隨后通過輸出系統(tǒng)調(diào)節(jié)效應(yīng)器形成晝夜節(jié)律。

圖1 哺乳動(dòng)物生物鐘的轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋回路Fig 1 Transcriptional/translational feedback loop of the mammalian circadian clock

生物鐘基因調(diào)控紊亂可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境失調(diào)，其后果與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，包括內(nèi)分泌紊亂、代謝綜合征和腫瘤等。

2 生物鐘與腫瘤的相關(guān)性

腫瘤的主要特征是細(xì)胞周期紊亂、持續(xù)地增殖等。由于生物鐘基因參與細(xì)胞增殖、凋亡等的調(diào)控，因此，生物鐘與腫瘤密切相關(guān)。

2.1 生物鐘基因參與細(xì)胞周期的調(diào)控

細(xì)胞受到多種刺激后，是增殖、分裂還是死亡，這些過程皆與生物鐘的調(diào)節(jié)有關(guān)[8]。如果生物鐘基因表達(dá)出現(xiàn)紊亂，可使與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)增加，凋亡基因表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致多種與細(xì)胞增殖、異常死亡等相關(guān)疾病的發(fā)生。在MTCL小鼠的胸腺細(xì)胞中，PER1、PER2的下調(diào)可導(dǎo)致cyclin E、cyclin D1、cyclin C、COX1蛋白表達(dá)的增加[9]。因此，生物鐘基因下調(diào)促進(jìn)腫瘤的生長，這可能與cyclin E、cyclin D1和COX1表達(dá)的增加有著密切的聯(lián)系。

另外，乳腺上皮細(xì)胞中的生物鐘基因改變導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，這是由細(xì)胞異常分裂引起的，可能與乳腺癌的形成有關(guān)[1]。有趣的是，在乳腺癌體外實(shí)驗(yàn)中，誘導(dǎo)PERs基因的過表達(dá)可引起細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞增殖和凋亡[10]。但是CRYs基因的缺乏可導(dǎo)致WEE-1和cyclin D1表達(dá)的紊亂，因此CRYs可能發(fā)揮了類似于PERs的作用[10]。綜上，生物鐘可能通過細(xì)胞周期抑制腫瘤的發(fā)生。

2.2 生物鐘基因的節(jié)律性表達(dá)與腫瘤的關(guān)系

生物體內(nèi)大部分基因的表達(dá)都遵循一定的節(jié)律，如：大鼠鼻黏膜中PER1、PER2、CLOCK、BMAL1和P53都是節(jié)律性表達(dá)的[11]。小鼠體內(nèi)至少在一種組織中有高達(dá)43%的蛋白編碼基因呈晝夜節(jié)律性表達(dá)[12]。另外，在大多數(shù)器官中，晝夜節(jié)律基因的表達(dá)通常以雙峰的形式在黃昏或黎明之前的數(shù)小時(shí)內(nèi)達(dá)到峰值[12]。事實(shí)上，大多數(shù)基因表達(dá)的調(diào)控階段，從轉(zhuǎn)錄、剪接、終止、多腺苷酸化、核輸出、microRNA調(diào)控、翻譯到RNA降解都具有節(jié)律性。

生物鐘基因呈現(xiàn)出節(jié)律性表達(dá)，且能夠調(diào)控腫瘤的生長。但是，當(dāng)生物鐘基因表達(dá)發(fā)生改變時(shí)，腫瘤生長節(jié)律的周期及振幅都會(huì)受到影響。如：PER2的下調(diào)會(huì)加速腫瘤的生長，且腫瘤生長節(jié)律的時(shí)間點(diǎn)發(fā)生了改變；PER1、PER2的下調(diào)，腫瘤生長節(jié)律的振幅也發(fā)生了改變[9]；PER2敲除后乳腺癌細(xì)胞增殖的節(jié)律延遲了4 h[6]。因此，腫瘤在不同時(shí)間點(diǎn)具有不同的生長速度，造就了其在不同時(shí)間點(diǎn)大小的不同，提示對(duì)腫瘤測(cè)量時(shí)，選取不同的時(shí)間點(diǎn)可能會(huì)造成誤差。

2.3 生物鐘基因轉(zhuǎn)錄修飾與腫瘤的關(guān)系

基因的突變與其功能及表達(dá)密切相關(guān)，而哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組的節(jié)律性是通過有節(jié)奏地招募染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵修飾物來實(shí)現(xiàn)[13]，例如甲基化。但是生物鐘基因PER的突變并不會(huì)使其蛋白表達(dá)下調(diào)。在腫瘤細(xì)胞中PER基因表達(dá)的下調(diào)往往表現(xiàn)為啟動(dòng)子的甲基化。人類的癌往往是由于生物鐘基因甲基化過度引起的[13]，如：結(jié)直腸癌患者血液中PER1和PER2經(jīng)常甲基化[14]。但是在急性T淋巴母細(xì)胞中的PER2啟動(dòng)子區(qū)觀察到低甲基化水平[15]。因此腫瘤細(xì)胞中生物鐘基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)會(huì)因個(gè)體而有所差異。另外，不同腫瘤細(xì)胞系特定生物鐘基因啟動(dòng)子位點(diǎn)呈現(xiàn)不同的甲基化頻率[13]。有趣的是，DNA甲基化也是存在節(jié)律性的[13]，核心生物鐘基因的異?？赡軙?huì)影響DNA甲基化。

2.4 生物鐘基因PERs參與P53通路調(diào)控腫瘤的發(fā)生

野生型小鼠胸腺細(xì)胞在γ射線照射后以P53途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是在γ射線照射后的mPERm/m小鼠卻出現(xiàn)誘導(dǎo)凋亡不足的現(xiàn)象。那么mPERm/m小鼠誘導(dǎo)的凋亡是否依賴于P53途徑？內(nèi)源性凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的兩大途徑之一，線粒體接受凋亡信號(hào)后，向細(xì)胞質(zhì)中釋放的細(xì)胞色素c(Cyt c)與APAF-1和caspase-9結(jié)合形成凋亡復(fù)合體，進(jìn)一步激活下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。γ射線照射后，野生型小鼠線粒體中的Cyt c低于mPERm/m小鼠，但細(xì)胞質(zhì)中的Cyt c高于mPERm/m小鼠。因此，猜測(cè)mPERm/m誘導(dǎo)的凋亡不足是由于線粒體中Cyt c釋放不足引起的[16]。由于P53競爭性地與PER2結(jié)合，可能會(huì)阻止MDM2介導(dǎo)的P53泛素化和蛋白酶體降解[17]。因此，mPERm/m所引起的凋亡不足可能是抑制了P53調(diào)節(jié)的線粒體信號(hào)通路。

另外，mPER2-/-小鼠表現(xiàn)出細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)，如cyclin A和MDM2。因?yàn)镸DM2參與了P53的負(fù)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，而生物鐘基因又會(huì)直接影響P53的表達(dá)[18]，推測(cè)PER2可能通過P53參與腫瘤抑制。C-myc作為PER2下游的鐘控基因，在mPERm/m小鼠中表達(dá)增加[16]。因此，ER2也可能通過c-myc途徑參與腫瘤的抑制(圖2)。

圖2 PERs與腫瘤的發(fā)生Fig 2 PERs and tumorigenesis

3 討論與展望

晝夜節(jié)律的紊亂促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，探究晝夜節(jié)律機(jī)制可能對(duì)腫瘤的治療和干預(yù)提供有用的價(jià)值。有統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)美國市場上大多數(shù)暢銷藥的靶標(biāo)都會(huì)受到生物鐘的調(diào)節(jié)[12]。由于生物鐘基因表達(dá)的節(jié)律性，使得在用生物鐘靶向藥物時(shí)的最佳給藥時(shí)間被認(rèn)為可以最大限度的發(fā)揮抗腫瘤作用和最小的毒副作用。例如，mTOR的表達(dá)是有節(jié)律的，在mTOR表達(dá)的高峰期給予抗癌藥物mTOR抑制劑-依維莫司(everolimus)可以提高小鼠的存活率[19]；鴉膽子油(bruceae fructus oil)抗腫瘤的作用也是有時(shí)間節(jié)律性，晚上22∶00給藥，抗腫瘤作用最佳，不良反應(yīng)較少，能明顯改善小鼠的生活質(zhì)量[20]。

不管是通過藥物，還是技術(shù)手段調(diào)控生物鐘基因的表達(dá)，如果簡單地改變生物鐘基因的蛋白表達(dá)水平，可能并不會(huì)達(dá)到預(yù)期的效果，畢竟生物鐘是多種基因參與調(diào)控的整體系統(tǒng)，只改變其中一個(gè)或幾個(gè)基因的表達(dá)可能會(huì)造成整個(gè)生物鐘調(diào)控系統(tǒng)的紊亂。但是，如果生物鐘基因蛋白發(fā)揮生物節(jié)律功能和抑制腫瘤功能位于不同的結(jié)構(gòu)域上，那么或許可以在不影響生物鐘基因的蛋白生物節(jié)律的前提下，增加其抑制腫瘤的功能[9]。

生物鐘的重要性已為人熟知，但是仍有很多重要的問題并未得到解決。例如：PER蛋白是如何調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的？中樞生物鐘是如何調(diào)控外周生物鐘的？在眾多未知問題面前，目前的研究仍顯得不夠深入，因此，關(guān)于生物鐘的研究還有更廣闊的天地。