蔣 瓊， 武 波， 黃羅冬， 華燕飛， 申佩弘,2*

1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西微生物與酶工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530004；2.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004；3.廣西民族師范學(xué)院，廣西 崇左 532200

茴香酸(anisic acid)，化學(xué)名為4-甲氧基苯甲酸(4-Methoxybenzoic Acid)，是合成香料的主要原料，同時(shí)也是防腐、制藥等領(lǐng)域方面的重要原料，是胺碘酮、茴拉西坦等的醫(yī)藥中間體，因而被人們關(guān)注及合成應(yīng)用[1-3]，反式茴腦可被微生物代謝合成茴香酸及茴香醛。國內(nèi)外關(guān)于微生物利用反式茴腦合成茴香酸和茴香醛的研究報(bào)道并不多，已報(bào)道的能以反式茴腦為唯一碳源進(jìn)行生長代謝的菌株主要有：AspergillusnigerZJ-9[2]，Pseudomonassp.BT13[2]，PseudomonasputidaWGAF10[4]，Burkholderiasp. WGB31[5]，且關(guān)注的是優(yōu)化發(fā)酵條件提高反式茴腦的中間代謝產(chǎn)物茴香醛及茴香酸的產(chǎn)量。對反式茴腦代謝相關(guān)基因或途徑進(jìn)行研究的菌株主要有Arthrobactersp. TA13[6，7]和PseudomonasputidaJYR-1[8-11]。根據(jù)研究報(bào)道，Arthrobactersp. TA13代謝反式茴腦生成對-茴香醇是通過形成環(huán)氧化物或二醇的中間體而實(shí)現(xiàn)的，但由于其體內(nèi)缺乏脫甲氧基酶，因此不能斷裂苯環(huán)實(shí)現(xiàn)對茴腦的進(jìn)一步利用。HAN Dongfei等人[9-11]對PseudomonasputidaJYR-1反式茴腦代謝途徑進(jìn)行了研究，首次克隆出tao基因，并于大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)行異源性表達(dá)，推斷反式茴腦氧化酶(TAO)為黃素蛋白單氧化酶，可將反式茴腦催化氧化成對-甲氧基茴香醛，且反應(yīng)過程需NAD+和NADP+作為輔助因子。然而HAN Dongfei等人[9-11]對tao基因的功能研究是通過大腸桿菌的異源表達(dá)TAO酶來實(shí)現(xiàn)的，研究的范圍僅限于該基因，并不能真正了解該基因?qū)Ψ词杰钅X整個(gè)代謝途徑的影響，以及與其他相關(guān)基因的作用關(guān)系。本研究擬以Pseudomonassp. AT39為目的菌株，構(gòu)建tao基因的重組菌和pk18mob插入的突變菌及其互補(bǔ)菌，進(jìn)行TAO酶比活力測定及反式茴腦代謝產(chǎn)物生成量的檢測，以確定tao基因在Pseudomonassp.AT39反式茴腦代謝過程中的地位及作用，也為工業(yè)合成茴香酸奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用的菌株和質(zhì)粒：E.coliDH5α，菌株P(guān)seudomonassp.AT39為本實(shí)驗(yàn)室分離，克隆載體pMD18-T 購自TaKaRa 公司，質(zhì)粒pRK2013、pBBR1MCS-5[12]和pK18mob[13]均由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基和生長條件

大腸桿菌DH5α采用LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)。野生型Pseudomonassp. AT39菌株采用LM9培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基[14]，30 ℃培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過程根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康男枰贚M9培養(yǎng)基中加入不同濃度反式茴腦。實(shí)驗(yàn)過程抗生素使用濃度 (mg/mL)為：氨芐青霉素(Amp)50；卡那霉素(Km)40；羧芐青霉素(Cb)100。

1.3 酶、試劑和引物

2x Taq MasterMix(含染料)和細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Ex-Taq聚合酶和 T4-DNA ligase購自大連 TaKaRa公司；質(zhì)粒 DNA提取試劑盒、膠回收試以及PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自于西寶生物科技股份有限公司；限制性內(nèi)切酶及其緩沖液均購于Fermentas公司。實(shí)驗(yàn)所用引物列于表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的引物

1.4 方法

1.4.1Pseudomonassp. AT39重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

以連接在T-載體且測序結(jié)果正確的tao基因?yàn)槟０澹?以tao-F、tao-R為引物，PCR擴(kuò)增tao基因片段，并酶切后連接至以同樣酶切處理的pBBR1MCS-5質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建重組菌DH5α/tao-pBBR1MCS5。以野生型Pseudomonassp. AT39為受體菌，DH5α/tao-pBBR1MCS5為供體菌，DH5α/pRK2013為幫助菌進(jìn)行菌體量為1∶1∶1的三親本接合實(shí)驗(yàn)[15]，將重組質(zhì)粒tao-pBBR1MCS5導(dǎo)入Pseudomonassp. AT39中，并進(jìn)行質(zhì)粒的提取及酶切驗(yàn)證。

1.4.2P.putidaAT39菌株pk18mob插入突變體的構(gòu)建

同樣以tao-T重組質(zhì)粒為模板，Δtao-F、Δtao-R為引物(分別含EcoR I、XbaI酶切位點(diǎn))，PCR擴(kuò)增tao基因部分片段btao(約425 bp)，連接同樣酶切處理過的pK18mob質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建菌株DH5α/ btao-pK18mob。參照方法1.4.2中三親本接合實(shí)驗(yàn)操作，將自殺質(zhì)粒pk18mob插入Pseudomonassp.AT39基因組中，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.4.3互補(bǔ)菌株的構(gòu)建

參照方法1.4.2中的三親本接合實(shí)驗(yàn)操作將重組質(zhì)粒tao-pBBR1MCS5導(dǎo)入突變株AT39/btao中，挑選具有Cbr和Kmr雙抗性的重組子接種到液體種子培養(yǎng)基培養(yǎng)12～16 h，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR或酶切驗(yàn)證。

1.4.4菌株生長情況測定

按1%(v/v)的接種量將過夜培養(yǎng)的菌液接種到新鮮的液體種子培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣檢測OD600值，測定菌株的生長曲線。

1.4.5TAO酶活的測定

按1%(v/v)的接種量將過夜培養(yǎng)的菌液接種至LB培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)直至菌株的生長穩(wěn)定期。離心后，以50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)懸浮沉淀并超聲波破碎，所用振幅39%，總時(shí)間50 min(每隔5 s停頓5 s)。離心后的上清即為粗酶液。

酶活測定方法參考文獻(xiàn)[11,16]稍作修改。1 mL的反應(yīng)體系中含有50 mmol/磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)，20 mmol/L NADH，20 mmol/L FAD，100 mmol/L 反式茴腦，30 ℃，180 r/min振蕩反應(yīng)1 h，沸水浴10 min，以超純水為空白對照。對酶反應(yīng)液進(jìn)行萃取,用高效液相色譜法對底物反式茴腦的減少量進(jìn)行檢測且酶活力計(jì)算。

酶活定義：在30 ℃，pH 8.0條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol/L的反式茴腦所需酶量為1個(gè)酶活單位1 U，即1 U。

酶比活力(U/g)=A/(t×m)

注：A為樣品中反式茴腦減少的量(μmol)，t為反應(yīng)時(shí)間(min)，m為酶的質(zhì)量(g)。

1.4.6高效液相色譜法(HPLC)分析

按1%(v/v)的接種量將過夜培養(yǎng)的菌液接種到以1%(v/v)反式茴腦為唯一碳源的LM9培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)。待菌株OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，30 ℃，180 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)36 h。進(jìn)而對菌液進(jìn)行萃取以及高效液相色譜的測定，具體實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)處理方法參考文獻(xiàn)[4,14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pseudomonas sp. AT39重組表達(dá)菌株、突變菌株及互補(bǔ)菌株的構(gòu)建

利用兩端分別含有XhoI和EcoR I酶切位點(diǎn)的引物tao-F和tao-R擴(kuò)增tao基因，雙酶切純化后與同樣處理的pBBR1MCS-5質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，通過含有Gmr抗性的X-gal和IPTG培養(yǎng)基進(jìn)行篩選重組轉(zhuǎn)化子。并使用限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoR I進(jìn)行酶切驗(yàn)證(圖1)。以野生菌P.putidaAT39為受體菌，DH5α/tao-pB-BR1MCS5為供體菌，DH5α/pRK2013為幫助菌進(jìn)行三親本接合實(shí)驗(yàn)，將重組子質(zhì)粒導(dǎo)入野生菌中，構(gòu)建重組菌AT39/tao-pBBR1MCS5。

M: 1 000 b ladder DNA; 1: tao-pBBR1MCS5質(zhì)粒; 2: tao-pBBR1MCS5質(zhì)粒的Xho I 和EcoR I酶切圖1 重組質(zhì)粒tao-pBBR1MCS5 的Xho I和EcoR I酶切驗(yàn)證

以野生菌Pseudomonassp.AT39為受體菌，DH5α/tao-pBBR1MCS5為供體菌，DH5α/pRK2013為幫助菌進(jìn)行三親本接合實(shí)驗(yàn)，將重組子質(zhì)粒tao-pBBR1MCS5導(dǎo)入野生菌中，構(gòu)建重組菌AT39/tao-pBBR1MCS5。

按實(shí)驗(yàn)操作，得到轉(zhuǎn)化子DH5α/btao-pK18mob，提取重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證(圖2)。參照方法1.4.1三親本實(shí)驗(yàn)操作，將自殺質(zhì)粒pK18mob插入到野生型AT39菌株基因組中，提取基因組DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

同樣參照1.4.1三親本實(shí)驗(yàn)操作，將重組質(zhì)粒tao-pBBR1MCS5導(dǎo)入突變菌AT39/btao中，構(gòu)建互補(bǔ)菌HAT39/btao。提取互補(bǔ)菌重組質(zhì)粒tao-pBBR1MCS5并進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

2.2 菌株生長情況分析

對菌株AT39、AT39/pBBR1MCS5、AT39/btao、AT39/tao-pBBR1MCS5、HAT39/btao的生長曲線進(jìn)行測定。結(jié)果表明，在種子培養(yǎng)基中，突變菌、重組菌以及突變互補(bǔ)菌到達(dá)穩(wěn)定生長期的時(shí)間與野生菌的相差不大，與野生菌間的差值約為2 h。

2.3 酶活力測定

測定并計(jì)算菌株AT39、 AT39/btao、AT39/pBBR1MCS5、AT39/tao-pBBR1MC S5、HAT39/btao中TAO酶的比活力。結(jié)果如表2所示。

表2 各菌株中酶比活力的測定

根據(jù)表2中數(shù)據(jù)顯示，重組菌AT39/pBBR1MCS5 的TAO酶比活力同比野生菌AT39并未有顯著性差異。而重組菌AT39/tao-pBBR1MCS5比野生菌AT39酶比活力增加了35.23%，表明tao基因在lac啟動子作用下表達(dá)量增加，對反式茴腦的代謝作用增強(qiáng)，是反式茴腦代謝途徑中一個(gè)關(guān)鍵基因。突變菌AT39/btao比野生菌AT39酶比活力下降了19.67%，其互補(bǔ)菌HAT39/btao比野生菌AT39酶活力增加了26.79%，而相對于突變菌AT39/btao，酶比活力增加了57.83%。

2.4 茴香酸產(chǎn)量分析

利用高效液相色譜法對Pseudomonassp. AT39野生型、重組型及突變型菌株發(fā)酵液中茴香酸進(jìn)行檢測，如圖3所示。

圖3顯示野生菌AT39和空質(zhì)粒重組菌AT39/pBBR1MCS5代謝反式茴腦36 h后茴香酸產(chǎn)量分別是0.706 g/L和0.695 g/L，茴香酸摩爾生成率分別為6.87%和6.77%，茴香腦的摩爾利用率分別為78.73%和88.48%。數(shù)據(jù)顯示兩者之間并未有顯著性差異，表明轉(zhuǎn)入的空質(zhì)粒pBBR1MCS5對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大。與此同時(shí)，重組菌AT39/tao-pBBR1MCS5代謝生成的茴香酸的量達(dá)到3.55 g/L，茴香酸摩爾生成率為34.56%，茴香腦摩爾利用率為86.42%。與已報(bào)道的P.putidaWGAF10[4]發(fā)酵條件優(yōu)化后產(chǎn)茴香酸的量相比增加了45.5%。茴香酸摩爾生成率同比野生菌AT39增加了約4倍，比P.putidaWGAF10增加了42.22%。茴香腦的摩爾利用率同比野生菌AT39并未有顯著差異，而同比P.putidaWGAF10增加了46.18%。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出突變株AT39/btao反式茴腦代謝過程中茴香酸生成量為0.028 g/L，比野生菌AT39茴香酸產(chǎn)量下降了96.10%。且其互補(bǔ)菌HAT39/btao代謝過程茴香酸產(chǎn)量為0.843 g/L，比野生菌AT39增加了19.4%，說明對突變菌的回補(bǔ)效果較好。

本次實(shí)驗(yàn)中所用質(zhì)粒為pBBR1MCS-5，所用的啟動子為低水平表達(dá)的lac啟動子，雖然相對野生型茴香酸的產(chǎn)量及茴香酸摩爾生成率均得到很大程度的提高，但為了后期能更好地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，可基于本次研究結(jié)果進(jìn)行質(zhì)粒強(qiáng)啟動子的構(gòu)建，使tao基因進(jìn)行高水平表達(dá)從而獲得更高產(chǎn)量的茴香酸。

3 結(jié)論

本研究對Pseudomonassp. AT39的tao基因進(jìn)行了突變和表達(dá)，以研究該基因在菌株中對茴腦代謝及合成茴香酸的功能，發(fā)現(xiàn)tao基因的過量表達(dá)可以增加重組菌AT39/tao-pBBR1MCS5的酶活力，并提高茴香酸的轉(zhuǎn)化能力。確定了tao基因是Pseudomonassp. AT39利用反式茴腦代謝生產(chǎn)茴香酸的重要基因。