解衛(wèi)方 沈洪艷 郭志

(1.河北科技大學環(huán)境科學與工程學院 石家莊050018； 2.河北省藥用分子化學重點實驗室 石家莊 050018； 3.華北制藥集團先泰藥業(yè)有限公司 石家莊 052165)

0 引言

隨著近年來我國制藥行業(yè)不斷快速地發(fā)展，相對應的制藥行業(yè)廢水排放量也在一直增加，在世界各國工業(yè)廢水排放量中，我國的廢水排放量占比高于工業(yè)生產(chǎn)占有率，占比為6%，而且我國大量生產(chǎn)使用抗生素，是世界上最大的抗生素生產(chǎn)國[1]。相關研究表明，生產(chǎn)出1 t抗生素藥品就會產(chǎn)生150～200 m3的制藥廢水[2]?？股仡愃幤飞a(chǎn)廢水中殘存大量的有機溶劑、微量元素以及殺菌、抑菌等有毒物質，影響水中水生生物的正常代謝和一系列的生理功能[3]。

近年來國內(nèi)外研究者已在抗生素對水生生物的影響方面做了全面而深刻的研究，尤其是水生生態(tài)系統(tǒng)受抗生素影響的研究報道不斷增多。李偉民等[4]首先報道了氯代苯胺對斑馬魚的急性毒性；吳志剛等[5]基礎性地報道了青霉素廢水會對斑馬魚機體造成了一定的氧化損傷；因此，本論文所研究的毒理實驗有實際意義，并且可為后期阿莫西林制藥廢水的深度處理技術提供毒理學依據(jù)。

本實驗使用的廢水來自石家莊市開發(fā)區(qū)某制藥廠污水處理廠的進水(車間排放的廢水)，選用斑馬魚為受試生物，進行制藥廢水對斑馬魚的毒性實驗研究。本實驗重點研究了阿莫西林廢水對斑馬魚肌肉組織細胞中T-AOC、CAT活性的影響。

1 實驗方法

1.1 實驗設計

預實驗：隨機取6條斑馬魚放入5 L的魚缸中，根據(jù)查閱文獻的記載，初步設定廢水質量分數(shù)為20%、40%、60%、80%、100%，實驗結果表明，在實驗進行31 min時，在質量分數(shù)20%的暴露組實驗中觀察到斑馬魚開始死亡，在實驗進行36 min后，觀察到實驗所用的斑馬魚全部出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，根據(jù)上述實驗出現(xiàn)的現(xiàn)象，預實驗又增加了質量分數(shù)為0.5%、1%、5%、10%的暴露組。實驗進行96 h，最終得出24 h斑馬魚全部死亡的實驗所用阿莫西林制藥廢水的濃度和96 h內(nèi)斑馬魚未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象的阿莫西林制藥廢水濃度。

急性實驗：按照上述進行預實驗時所得出的實驗結論，選用質量分數(shù)分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的暴露組進行急性實驗，實驗設定5個暴露組和1個對照組，每組隨機同時取10條健康的斑馬魚放入實驗所用魚缸中，實驗共進行96 h，觀察斑馬魚所出現(xiàn)的癥狀及不同時間的死亡條數(shù)，最終得出斑馬魚的24 h半數(shù)致死濃度。

亞急性實驗：依據(jù)上述急性實驗所得出的實驗結論，亞急性實驗同樣分別設置對照組1組和暴露組5組，選用廢水體積分數(shù)分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，每個實驗組隨機、同時選14條健康外觀正常的斑馬魚放入實驗所用魚缸中，實驗總進行15 d，分別在實驗進行到第3、6、9、12、15 d時，隨機撈取2條斑馬魚，用消毒的醫(yī)用剪刀對實驗組中的斑馬魚進行解剖并取其肌肉組織部分，用生理鹽水進行浸泡，在放進冷卻的玻璃勻漿器中，在冷卻條件下研磨搗碎，再用離心機進行分離，取上清液再按照試劑盒使用方法對上清液進行配制，最后用紫外分光光度計對斑馬魚肌肉組織的T-AOC和CAT活性進行測定分析。

1.2 實驗廢水

阿莫西林廢水呈黃色，無刺鼻性氣味，取來后放在0～4 ℃的冰柜中儲存?zhèn)溆?。實驗前對水樣的常?guī)水質指標進行了測定，測定結果見表1。

表1 阿莫西林廢水水質測定結果 mg/L(pH值除外)

1.3 實驗設備、實驗生物、數(shù)據(jù)處理

實驗設備有酸度計(FE20)、UV2550紫外分光光度計、5 L魚缸、臺式冷凍高速離心機、曝氣泵；不同量程的設備有移液槍、分析天平、電熱恒溫水浴鍋、玻璃勻漿器、量筒、溫度計、溶解氧測定儀(JPBJ-608)、水質硬度計(YD300)等。

受試生物斑馬魚來源于河北醫(yī)科大學實驗室動物中心，體長為25±3 mm，體重0.20±0.05 g，實驗前馴養(yǎng)1周，斑馬魚的自然死亡率應小于5%。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果用平均值±標準偏差表現(xiàn)。采用Origin 8.0軟件進行空白組和暴露組的顯著性分析[6]。

2 結果與分析

2.1 阿莫西林制藥廢水水質指標測定

實驗前對廢水的COD、TOC、氨氮、pH值等常規(guī)指標進行了測定，測定結果及所用儀器見表1。

實驗結果表明，除氨氮外，阿莫西林廢水中COD、TOC均超標，與限定值對比，實驗結果分別為限定值的150倍和169倍，廢水pH值為4.46，為酸性溶液，實驗時需將溶液的pH值調(diào)至中性。

2.2 阿莫西林制藥廢水對斑馬魚T-AOC活性的影響

T-AOC在生物體內(nèi)的活性水平大小代表著生物機體的代謝退化與生命衰亡[7]。實驗結果見圖1。

圖1 實驗對斑馬魚T-AOC活性影響

第3天，質量分數(shù)0.1%、0.4%、0.5%的實驗組與對照組比較，未呈現(xiàn)出顯著性差異(p>0.05)，可能由于第3天實驗時間較短，明顯的中毒跡象還未在斑馬魚機體中表現(xiàn)出來；質量分數(shù)0.4%、0.5%的暴露組的脅迫已經(jīng)使得斑馬魚抗氧化防御系統(tǒng)受到了不可逆的變化，從而破壞了受試生物機體內(nèi)的抗氧化平衡狀態(tài)[8]。質量分數(shù)0.2%、0.3%暴露組與對照組相比，斑馬魚肌肉組織中的T-AOC活性呈現(xiàn)出了顯著性誘導的現(xiàn)象(0.01

第6天，質量分數(shù)0.1%、0.5%實驗組與對照組比較并未呈現(xiàn)出顯著性差異的現(xiàn)象(p>0.05)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能與第3天質量分數(shù)0.1%、0.5%暴露組對照組對比無顯著性差異原因相同，質量分數(shù)0.1%暴露組斑馬魚機體還未做出應激反應；質量分數(shù)0.5%暴露組已超過斑馬魚機體可承受的范圍；第6天，質量分數(shù)0.2%、0.3%、0.4%實驗組與對照組比較表現(xiàn)出了顯著性差異(0.01

第9天和第12天，實驗組與對照組比較并未呈現(xiàn)出顯著性差異的現(xiàn)象(p>0.05)，可能是機體內(nèi)總抗氧化能力在此時處于動態(tài)平衡，體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基能夠及時被抗氧化酶進行消除[10]。

第15天，質量分數(shù)0.3%暴露組同對照組相比呈現(xiàn)顯著性誘導(0.010.05)，可能由于暴露時間較長，斑馬魚的抗氧化平衡狀態(tài)已經(jīng)受到毀壞，抗氧化酶也已失去活性。

2.3 阿莫西林制藥廢水對斑馬魚CAT活性的影響

CAT可與谷胱甘肽過氧化物酶等一起清除機體內(nèi)H2O2，減緩自由基對生物體的氧化傷害[7]，因而其在生物體抗氧化防御系統(tǒng)中占有很重要位置[12]，實驗結果見圖2。

圖2 實驗對斑馬魚CAT活性影響

第3天和第6天，實驗組中CAT活性與對照組比較未呈現(xiàn)顯著差異(p>0.05)，可能在實驗初期(第3天、第6天)，污染物質脅迫還未使得斑馬魚機體出現(xiàn)中毒跡象。

第9天和第12天，質量分數(shù)0.1%試驗組與對照組比較，CAT活性未呈現(xiàn)顯著性變化，因為質量分數(shù)0.1%的廢水濃度較低，還未使斑馬魚產(chǎn)生應急反應；質量分數(shù)0.2%、0.3%、0.4%暴露組與對照組相比，CAT活性有所上升，斑馬魚體內(nèi)活性氧原本的平衡狀態(tài)被外源物質的進入所破壞，從而受刺激的機體會產(chǎn)生一些自主的氧化應激反應；產(chǎn)生應激反應就會消耗機體內(nèi)的CAT物質，進而加快斑馬魚體內(nèi)的過氧化氫分解，從而可以消除受試生物體內(nèi)的氧自由基，使機體免受過氧自由基的損傷[12]；質量分數(shù)0.5%實驗組與對照組比較，CAT活性未呈現(xiàn)顯著差異，可能由于外援物質的刺激清除了機體內(nèi)抗氧化自由基[13]，使機體抗氧化防御系統(tǒng)處于一個平衡狀態(tài)。

第15天，實驗組與對照組對比未呈現(xiàn)出來一些顯著性差異(p>0.05)，可能實驗第15天斑馬魚體內(nèi)CAT代謝H2O2能力達到飽和狀態(tài)，H2O2的積累量促使魚體細胞產(chǎn)生中毒現(xiàn)象，使得其清除活性氧的性能丟失[5]。

2.4 阿莫西林制藥廢水對斑馬魚T-AOC和CAT活性影響對比

斑馬魚暴露在阿莫西林廢水中T-AOC和CAT活性變化呈現(xiàn)“抑制—誘導—抑制”的變化趨勢；T-AOC、CAT活性在質量分數(shù)0.3%暴露組時達到最大；質量分數(shù)0.2%、0.3%、0.4%暴露組與對照組比較，T-AOC的活性呈現(xiàn)顯著性誘導(0.01

3 結論

阿莫西林廢水脅迫下斑馬魚肌肉組織內(nèi)T-AOC和CAT活性發(fā)生了變化，表明斑馬魚機體已經(jīng)對阿莫西林廢水的刺激做出了應激反應。

斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)可承受的最大質量分數(shù)為0.3%，超過0.3%斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)就會遭到影響。

斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)指標T-AOC和CAT活性之間成協(xié)同作用，且在受到相同質量分數(shù)的阿莫西林廢水脅迫時，與CAT活性與T-AOC的活性比較變化較為顯著，可以較好地反映斑馬魚在阿莫西林廢水中所遭到的氧化脅迫狀態(tài)。