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      食鹽對傳統(tǒng)發(fā)酵肉成熟過程中微生物菌群、理化性質(zhì)及鹽溶性蛋白特性的影響

      2020-12-28 03:04湯興宇王浩東吳念黃佳卉黃豪田星李宗軍
      肉類研究 2020年10期

      湯興宇 王浩東 吳念 黃佳卉 黃豪 田星 李宗軍

      摘 要:以不同食鹽添加量(0%、1%、3%、5%、7%)發(fā)酵肉(戊糖片球菌∶木糖葡萄球菌=1∶1)為研究對象,測定發(fā)酵肉微生物菌群、pH值、水分含量、亞硝酸鹽殘留量,以及最終成熟發(fā)酵肉中食鹽、總氮、非蛋白氮及鹽溶性蛋白含量,研究食鹽添加量對發(fā)酵肉成熟過程中微生物菌群、理化性質(zhì)及鹽溶性蛋白特性的影響。結(jié)果表明:隨著食鹽添加量的增加,微生物菌群數(shù)量基本呈先上升后下降的趨勢;食鹽添加量3%的發(fā)酵肉,蛋白質(zhì)水解指數(shù)最高,鹽溶性蛋白含量最低,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶最為清晰。

      關(guān)鍵詞:發(fā)酵肉制品;食鹽添加量:微生物菌群;理化特性;鹽溶性蛋白

      Abstract: To investigate the effects of salt content on the microbial flora, physicochemical properties and salt-soluble protein characteristics of traditional fermented meat made with a mixed starter culture of Pediococcus pentosaceus and Staphylococcus xylose (1:1) during fermentation, microbial populations, pH value, water content, and nitrite residue of fermented meat samples with different initial salt contents (0%, 1%, 3%, 5% and 7%) were measured as a function of fermentation time, and the contents of salt, total nitrogen, non-protein nitrogen and salt-soluble protein in the final product were determined as well. It was found that microbial populations showed a trend of rise and then decline with the increase in salt content. Fermented meat with 3% salt content exhibited the highest proteolytic index, lowest salt-soluble protein content, and clearest bands in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).

      Keywords: fermented meat products; salt content; microbial flora; physicochemical properties; salt-soluble protein

      DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20200701-166

      中圖分類號:TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼:A 文章編號:1001-8123(2020)10-0001-07

      發(fā)酵肉制品是指在自然和人工控制條件下利用微生物發(fā)酵作用,產(chǎn)生具有特殊風(fēng)味、色澤和質(zhì)地且具有較長保存期的肉制品[1-2]。隨著現(xiàn)代人們生活質(zhì)量和水平的進一步提高,對于肉制品的營養(yǎng)要求越來越高,營養(yǎng)、健康和特殊風(fēng)味相結(jié)合也成為肉制品的主要研發(fā)方向[3]。而傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品加工過程中,發(fā)酵肉中的蛋白質(zhì)經(jīng)微生物作用分解為氨基酸,而氨基酸進一步分解形成大量的香味物質(zhì)和營養(yǎng)成分[4],從而促使發(fā)酵肉產(chǎn)品產(chǎn)生獨特的風(fēng)味和營養(yǎng)價值。因此,發(fā)酵肉制品能夠很好地滿足現(xiàn)代消費者對高檔優(yōu)質(zhì)肉制品特殊風(fēng)味和營養(yǎng)的需求[5-7]。

      食鹽(NaCl)是肉制品加工中不可或缺的腌制材料,不僅能賦予產(chǎn)品咸度,增加鮮度,而且對產(chǎn)品加工及品質(zhì)特性的形成具有重要貢獻。一方面,食鹽增強了肉制品的保水能力,從而促進理想凝膠質(zhì)地的形成;另一方面,食鹽可通過控制生化和酶促反應(yīng)來促進香氣和風(fēng)味的產(chǎn)生。此外,食鹽能夠降低水分活度,抑制微生物的生長繁殖[8]。事實上,肉類食品在人類飲食鈉消耗量中的占比約為20%~30%,尤其是發(fā)酵肉制品,其食鹽含量一般高于其他食品數(shù)倍,由于長時間發(fā)酵過程中水分遷移和蒸發(fā),食鹽含量可能達到5.0%~8.0%[9]。但是,過量攝入高鹽食品會增加高血壓、中風(fēng)和血管疾病的患病風(fēng)險[10],如何降低肉制品中的食鹽添加量已成為肉制品加工領(lǐng)域的研究熱點和全民健康的焦點之一。國內(nèi)外肉制品行業(yè)也在積極采取多種降鹽措施,但在工業(yè)化生產(chǎn)中降低肉制品中食鹽用量仍存在困難[11-13]。目前,國內(nèi)外研究主要集中于降低肉制品中鈉鹽的途徑,而從發(fā)酵成熟過程的角度出發(fā),針對食鹽對傳統(tǒng)發(fā)酵肉成熟過程中微生物菌群、理化性質(zhì)及蛋白特性變化影響的研究較少[14-16]。事實上,食鹽在發(fā)酵肉制品成熟過程中具有重要作用,添加量不同,食鹽對發(fā)酵肉成熟過程中微生物菌群和理化性質(zhì)的影響也不盡相同。

      本實驗以同一批次的新鮮優(yōu)質(zhì)豬里脊肉為原料,以戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)為發(fā)酵劑,研究不同食鹽添加量發(fā)酵肉在成熟過程中微生物菌群、理化性質(zhì)及鹽溶性蛋白特性的變化,為提高發(fā)酵肉制品安全性提供理論指導(dǎo)和數(shù)據(jù)支持。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      新鮮優(yōu)質(zhì)豬里脊肉 湖南偉鴻食品有限公司;52°白酒、食鹽、味精、白糖 長沙嘉而惠超市。

      戊糖片球菌由中國科學(xué)院微生物保藏中心提供;木糖葡萄球菌由本實驗室分離自傳統(tǒng)湘西臘肉。

      MRS培養(yǎng)基、平板計數(shù)培養(yǎng)基、MSA培養(yǎng)基、馬丁孟加拉紅-鏈霉菌瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性膽堿鹽培養(yǎng)基? ?廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

      三氯乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、乙酸鋅、氨水、醋酸鉛、硫酸鈉、氯化鈉、酚酞、鉻酸鉀、硝酸銀(均為分析純) 天津市化學(xué)試劑一廠。

      1.2 儀器與設(shè)備

      K9860全自動凱式定氮儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司;CP114分析天平 奧豪斯儀器有限公司;Testo 250 pH計、LabTech分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司;D2S2-LJ080高壓滅菌鍋 山東新醫(yī)療器械股份有限公司;101-3HB干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司;SKY-2102C搖床 上海浦東生物光學(xué)儀器廠;SW-CJ-IFD超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;KQ-100E超聲清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;LG10-24A高速臺式離心機 常州中捷實驗儀器制造有限公司;GZ-250-HSII恒溫恒濕箱 廣智科技設(shè)備有限公司;TG16-WS離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;XMTD-7000水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

      1.3 方法

      1.3.1 發(fā)酵劑和發(fā)酵肉的制備

      取適量已活化的戊糖片球菌和木糖葡萄球菌菌種分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基和MSA液體培養(yǎng)基中,37 ℃搖床培養(yǎng)24 h。

      選取新鮮的無脂豬里脊肉,以每塊質(zhì)量約(200±2) g按紋理進行切分,分別添加不同質(zhì)量分數(shù)(0%、1%、3%、5%、7%)食鹽,并與其他輔料(白酒2%、白糖1.5%、味精0.3%)充分混合,常溫腌制48 h后,按照每100 g原料肉,添加1 mL菌體濃度108 CFU/g的發(fā)酵劑菌液(戊糖片球菌∶木糖葡萄球菌=1∶1),同時加入0.008%亞硝酸鈉。工藝流程如圖1所示。

      1.3.2 樣品采集

      在發(fā)酵0、5、10、15 d時,分別對不同食鹽添加量發(fā)酵肉取樣,每次隨機取2 塊,每塊取3 個不同點,每次至少取50 g。取樣后,各樣本取一部分直接進行微生物指標(biāo)測定,剩余部分真空包裝后于-40 ℃冷凍保存,用于其他指標(biāo)測定。

      1.3.3 微生物指標(biāo)測定

      取不同發(fā)酵成熟階段肉樣置于無菌超凈工作臺中,切碎,取25 g肉樣置于含有225 mL無菌生理鹽水的三角瓶中,封口后于搖床中振蕩40 min,取1 mL上清液于含有9 mL無菌生理鹽水的試管中,對上清液進行梯度稀釋,分別稀釋至10-3、10-4、10-5,每個稀釋度做3 個平行。細菌菌落總數(shù)計數(shù)采用PCA平板計數(shù)培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)48 h;葡萄球菌計數(shù)采用MSA培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)72 h;乳酸菌計數(shù)采用MRS培養(yǎng)基(含100 mg/L放線菌酮),37 ℃培養(yǎng)48 h;腸桿菌計數(shù)采用結(jié)晶紫中性膽堿鹽培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h;酵母菌計數(shù)采用馬丁孟加拉紅-鏈霉菌瓊脂培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)72 h;每個實驗重復(fù)3 次,結(jié)果取平均值。

      1.3.4 理化指標(biāo)測定

      1.3.4.1 pH值

      參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》[17]中的玻璃電極法。

      1.3.4.2 水分含量

      參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》[18],采用直接干燥法進行測定。稱取4 g攪碎肉樣置于已烘干至恒質(zhì)量的稱量瓶中(前后2 次質(zhì)量差不超過2 mg即為恒質(zhì)量),105 ℃烘干至樣品恒質(zhì)量。每個樣品做3 次平行。

      1.3.4.3 亞硝酸鈉殘留量

      參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[19]的鹽酸萘乙二胺法。

      1.3.4.4 食鹽含量

      參照GB 5009.42—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食鹽指標(biāo)的測定》[20]中的間接滴定法。

      1.3.5 蛋白質(zhì)水解情況測定

      1.3.5.1 總氮(total nitrogen,TN)和非蛋白氮(non protein nitrogen,NPN)含量TN含量:參照張會麗等[21]的方法,稱取0.5 g肉樣,放入消化管內(nèi),加入10 mL濃硫酸(體積分數(shù)98%)和由0.2 g硫酸銅和3 g硫酸鉀組成的混合催化劑,在380 ℃條件下消化2 h,冷卻至室溫后用凱氏定氮儀進行測定。

      NPN含量:參照吳雪燕等[22]的方法,稱取(1.000±0.001)g肉樣,加入15 mL預(yù)冷的10 g/100 mL三氯乙酸溶液,5 000 r/min勻漿1 min,4 ℃放置過夜。將勻漿液以4 500 r/min離心5 min,棄去沉淀,上清液用定性濾紙過濾到消化管中,按照TN含量測定過程相同步驟進行消化,冷卻至室溫后,用凱氏定氮儀進行測定。

      1.3.5.2 蛋白質(zhì)水解指數(shù)

      按下式計算:

      1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析鹽溶性蛋白質(zhì)的提取:準(zhǔn)確稱?。?.000±0.001) g肉樣于50 mL離心管中,加入16 mL 0.2 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液(含0.6 mol/L NaCl和0.03 mol/L MgCl2),5 000 r/min勻漿2 min,每30 s暫停1 次防止過熱,4 ℃靜置18 h后,再于10 000 r/min條件下離心15 min,取上清液,即為鹽溶性蛋白質(zhì)溶液,立即使用或置于-40 ℃條件下冷凍備用。用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)量濃度。

      將上述鹽溶性蛋白質(zhì)提取液稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg/mL,等質(zhì)量等體積與上樣緩沖液混合,沸水浴5 min,10 000 r/min離心2 min,取上清液待測。按照試劑盒說明配制12%分離膠和5%濃縮膠,上樣量10 μL,120 V恒壓電泳20 min后,150 V恒壓電泳至終點。用考馬斯亮藍R250染色1 h,脫色至背景無色,掃描圖譜并分析條帶。

      1.4 數(shù)據(jù)處理

      所有指標(biāo)測定均重復(fù)進行3 次。用SPSS 25.0軟件采用方差分析進行顯著性差異分析,P<0.05表示差異顯著;用Excel軟件繪圖。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 發(fā)酵過程中不同食鹽添加量發(fā)酵肉的微生物指標(biāo)變化

      2.1.1 細菌菌落總數(shù)

      由圖2可知,發(fā)酵期間隨著發(fā)酵時間的延長,不同食鹽添加量發(fā)酵肉的細菌菌落總數(shù)均呈波動降低的趨勢,食鹽添加量0%~5%發(fā)酵肉的細菌菌落總數(shù)在發(fā)酵10 d時達到最高,食鹽添加量7%發(fā)酵肉在發(fā)酵15 d時達到最高。這可能是由于發(fā)酵前期微生物作用使蛋白質(zhì)降解,為細菌生長繁殖提供了充足營養(yǎng),而發(fā)酵后期水分含量降低,氯化鈉質(zhì)量濃度上升,營養(yǎng)物質(zhì)含量也減少,細菌生長速率受到抑制,細菌數(shù)量逐漸減少。此外,在腌制過程中加入食鹽也能夠有效抑制雜菌的生長,并加速發(fā)酵進程[23],因此,隨著腌制過程中食鹽添加量的增大,發(fā)酵肉中的細菌總數(shù)呈現(xiàn)一定波動性。

      2.1.2 葡萄球菌數(shù)

      由圖3可知,隨著發(fā)酵時間的延長,不同食鹽添加量發(fā)酵肉葡萄球菌數(shù)整體呈先升高后下降的趨勢,發(fā)酵5~15 d期間,食鹽添加量3%發(fā)酵肉的葡萄球菌數(shù)顯著低于其余4 組(P<0.05),其原因可能是與乳酸菌相比,3%的食鹽添加量對葡萄球菌的抑制作用更強,同時乳酸菌產(chǎn)生的乳酸降低pH值,使葡萄球菌數(shù)量進一步降低。

      2.1.3 腸桿菌數(shù)

      由圖4可知,不同食鹽添加量發(fā)酵肉的腸桿菌數(shù)隨著發(fā)酵時間的延長整體呈下降趨勢。整個發(fā)酵期間,食鹽添加量0%與1%發(fā)酵肉的腸桿菌數(shù)(除發(fā)酵5 d)差異不顯著,當(dāng)食鹽添加量增大至3%~7%時,發(fā)酵肉腸桿菌數(shù)量明顯降低,由此可見,高食鹽添加量對于發(fā)酵肉中大腸桿菌有明顯的抑制作用。

      2.1.4 乳酸菌數(shù)

      由圖5可知:腌制時加入的食鹽、發(fā)酵劑在一定程度上抑制乳酸菌的生長,隨著發(fā)酵時間的延長耐受性逐漸增強,乳酸菌數(shù)緩慢上升;發(fā)酵期間隨著食鹽添加量的增加乳酸菌數(shù)先增加后降低,但發(fā)酵15 d時食鹽添加量3%發(fā)酵肉中的乳酸菌數(shù)最低;發(fā)酵期間食鹽添加量1%發(fā)酵肉的乳酸菌數(shù)始終高于其他食鹽添加量的發(fā)酵肉,由此可知,1%的食鹽添加量較為適合乳酸菌的生長。發(fā)酵肉成熟過程中,乳酸菌一直處于優(yōu)勢地位,從而抑制腐敗菌和致病菌的生長[24]。

      2.1.5 酵母菌數(shù)

      酵母菌作為兼性好氧菌,能夠消耗發(fā)酵肉中的氧氣,并且產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶,使肉制品產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)[25]。由圖6可知,不同食鹽添加量發(fā)酵肉中的酵母菌數(shù)均在發(fā)酵前期(0~5 d)急劇增長,發(fā)酵后期(10~15 d)快速下降,但始終高于初始酵母菌數(shù)。酵母菌有較強的抗逆能力,可抵抗低水分活度,且耐酸、耐厭氧。

      2.2 發(fā)酵過程中不同食鹽添加量發(fā)酵肉理化指標(biāo)的變化

      2.2.1 水分含量和pH值

      由圖7可知:發(fā)酵初期(0~5 d),隨著食鹽添加量增加,發(fā)酵肉中的水分含量逐漸減少,這是由于食鹽不僅能增強滲透壓,并且隨食鹽添加量增加,Na+遷移速率增大,促使發(fā)酵肉脫水[25],而且還會導(dǎo)致蛋白質(zhì)持水力下降;發(fā)酵后期(10~15 d),由于高添加量的食鹽抑制了微生物生長,減緩了發(fā)酵肉中水分含量的下降。

      成熟過程中pH值的變化影響發(fā)酵肉中水解酶的活性,從而影響蛋白和脂質(zhì)水解進程,揮發(fā)性風(fēng)味成分的釋放,并影響最終發(fā)酵肉的品質(zhì)[26]。較低pH值會抑制肉中蛋白質(zhì)水解酶的活性,并改變最終產(chǎn)品的風(fēng)味。由圖8可知,發(fā)酵初期(0~5 d),3%食鹽添加量的發(fā)酵肉pH值最低,這可能是由于食鹽添加量適中,微生物大量繁殖分解肉中碳水化合物導(dǎo)致酸類物質(zhì)增多。而發(fā)酵后期,微生物分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的胺類物質(zhì)積累導(dǎo)致pH值升高。

      2.2.2 食鹽含量

      由圖9可知,隨著食鹽添加量的增加,發(fā)酵肉終產(chǎn)品中的食鹽含量逐漸增加,并且相比腌制時均略有上升。食鹽添加量3%和5%發(fā)酵肉終產(chǎn)品中的食鹽含量接近,可能是由于5%食鹽添加量的發(fā)酵肉中,部分Na+被細胞吸收,細胞發(fā)生脫水,但細胞膜仍具有生理活性,進一步提高食鹽添加量,肌肉細胞脫水死亡,細胞液外泄,使終產(chǎn)品中的食鹽含量增大。

      2.2.3 亞硝酸鹽殘留量

      本實驗發(fā)酵肉腌制時的亞硝酸鹽添加量為0.008%,由圖10可知,發(fā)酵0 d,亞硝酸鹽殘留量均低于80 mg/kg,這可能是腌制階段亞硝酸鹽與肉樣中的其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致含量降低[27]。發(fā)酵初期(0~5 d),食鹽添加量0%、1%和5%發(fā)酵肉中的亞硝酸鹽殘留量顯著降低(P<0.05),食鹽添加量7%發(fā)酵肉中的亞硝酸鹽殘留量顯著升高(P<0.05),這是因為在發(fā)酵初期,亞硝酸鹽主要起到發(fā)色和抑菌作用。發(fā)酵后期(10~15 d),亞硝酸鹽殘留量明顯降低。整個發(fā)酵期間,食鹽添加量3%發(fā)酵肉中的亞硝酸鹽殘留量變化不大。

      2.3 不同食鹽添加量發(fā)酵肉終產(chǎn)品的蛋白質(zhì)水解相關(guān)指標(biāo)變化

      蛋白質(zhì)水解是傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品加工過程中重要的生化反應(yīng),而蛋白質(zhì)水解指數(shù)可以反映蛋白質(zhì)的水解程度以及風(fēng)干過程中蛋白質(zhì)分解的宏觀進程[28]。由表1可知,隨著食鹽添加量的增加,發(fā)酵肉終產(chǎn)品中的TN含量逐漸降低,蛋白質(zhì)水解指數(shù)基本維持不變,其中3%~5%食鹽添加量的發(fā)酵肉蛋白質(zhì)水解程度最高。

      2.4 不同食鹽添加量發(fā)酵肉終產(chǎn)品的鹽溶性蛋白特性

      由圖11可知,隨著食鹽添加量的增加,發(fā)酵肉終產(chǎn)品中的鹽溶性蛋白含量呈先減少后增加再減少的趨勢。研究表明,蛋白質(zhì)溶出量與其鹽溶性存在函數(shù)關(guān)系,食鹽是影響鹽溶性蛋白提取的重要因素[29-30]。本研究中,食鹽添加量3%時鹽溶性蛋白流失最快,導(dǎo)致其終產(chǎn)品中的鹽溶性蛋白含量最少。

      由圖12可知,鹽溶性蛋白質(zhì)分子主要集中在20~66 kDa,添加食鹽后條帶顏色加深,食鹽添加量3%時條帶最為清晰,表明其所含目標(biāo)蛋白(結(jié)蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白以及輕鏈Ⅰ)最多。這可能是因為3%食鹽添加量較為適合發(fā)酵肉中微生物生長,此外,鹽溶性蛋白含量的減少與pH值變化有關(guān),酸堿環(huán)境的改變會導(dǎo)致鹽溶性蛋白聚集,蛋白變性成不溶性蛋白質(zhì),從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取液中溶出量減少。

      3 結(jié) 論

      發(fā)酵肉成熟過程中,隨著食鹽添加量的增加,發(fā)酵肉微生物菌群數(shù)基本呈先上升后下降的趨勢。食鹽添加量對發(fā)酵肉的pH值、亞硝酸鈉殘留量等指標(biāo)有重要影響,蛋白質(zhì)水解指數(shù)基本維持不變,其中3%食鹽添加量發(fā)酵肉的蛋白質(zhì)水解指數(shù)最高、鹽溶性蛋白含量最低、SDS-PAGE電泳條帶最為清晰。從健康方面考慮,3%食鹽添加量的發(fā)酵肉,其鹽含量適中,明顯低于市場銷售的5%~8%食鹽含量的高鹽發(fā)酵肉制品,這說明在保證發(fā)酵肉風(fēng)味和營養(yǎng)的同時,可以適當(dāng)控制和減少食鹽添加量,從而確定最佳的發(fā)酵肉制品加工配方。如何生產(chǎn)出高品質(zhì)、營養(yǎng)健康的功能性發(fā)酵肉制品將成為肉制品加工行業(yè)的新熱點。

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