二甲雙胍激活A(yù)MPK抑制特發(fā)性肺纖維化的研究進(jìn)展

何遠(yuǎn)芬，閔香玉，謝婷婷，楊信容，趙勇

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州遵義563000

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種原因不明的，以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂最終導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化為特征的疾病，患者預(yù)后極差。目前，針對(duì)IPF的治療藥物較少，僅有的抗纖維化藥物還存在治療效果有限且不能延長(zhǎng)患者壽命的缺點(diǎn)[1-3]。肺移植是唯一可延長(zhǎng)IPF患者預(yù)期壽命的治療手段，但存在供體肺稀缺、術(shù)后并發(fā)癥多等不足[4]。因此，尋找安全有效且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的治療藥物對(duì)IPF至關(guān)重要。磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(AMPK)是一種重要的能量代謝激酶，能夠調(diào)控機(jī)體的能量代謝。有研究發(fā)現(xiàn)，IPF患者體內(nèi)AMPK表達(dá)下調(diào)。因此，上調(diào)AMPK表達(dá)可能對(duì)IPF治療具有積極作用。二甲雙胍是國(guó)內(nèi)外各大糖尿病指南推薦的2型糖尿病首選治療藥物，不僅能降低血糖，還能預(yù)防和減少糖尿病并發(fā)癥[5]。已有研究證實(shí)，二甲雙胍的降糖作用與AMPK信號(hào)途徑激活有關(guān)[6]。MANNING等[7]研究報(bào)道，在肺纖維化小鼠模型中，二甲雙胍可通過(guò)激活A(yù)MPK降低多種促纖維化蛋白表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)肺纖維化。二甲雙胍可能是目前發(fā)現(xiàn)的，唯一能夠逆轉(zhuǎn)肺纖維化的藥物。但由于目前還沒(méi)有動(dòng)物模型能夠完全擬合人類IPF的病理變化，二甲雙胍在IPF臨床治療中的應(yīng)用仍任重而道遠(yuǎn)。本文結(jié)合文獻(xiàn)就二甲雙胍激活A(yù)MPK抑制IPF的研究進(jìn)展作一綜述。

1 IPF概述

IPF是一種原因不明的慢性進(jìn)行性纖維化性間質(zhì)性肺炎，臨床特征是呼吸困難和肺功能逐漸惡化。IPF通常發(fā)生于中老年人，每年發(fā)病率為4/10萬(wàn)～11/10萬(wàn)，全世界已超過(guò)500萬(wàn)例，其中位生存期僅3～5年[1-3]。糖皮質(zhì)激素、硫唑嘌呤和N-乙酰半胱氨酸可用于治療IPF，但并不能增加患者預(yù)期壽命，5年生存率仍低于50%。除此之外，長(zhǎng)期使用皮質(zhì)類固醇或類固醇激素還可引起多種不良反應(yīng)，導(dǎo)致IPF患者病死率升高。尼達(dá)尼布和吡非尼酮雖然能阻止肺纖維化進(jìn)程，但其價(jià)格昂貴、不良反應(yīng)多且不能逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的肺纖維化。迄今為止，關(guān)于IPF的研究并不少見(jiàn)，但其確切病因和發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。持續(xù)性嚴(yán)重感染、放化療、環(huán)境暴露或不明原因所致的肺泡上皮細(xì)胞損傷，刺激各種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)肺組織并促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和多種纖維化相關(guān)因子分泌增加，肺成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖并異常分化，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白過(guò)度沉積、代謝紊亂、線粒體功能障礙、自噬異常，繼而肺組織重塑和纖維化瘢痕形成并代替正常肺泡組織，肺功能呈進(jìn)行性下降，最終因呼吸衰竭而死亡[3，8-9]。

2 二甲雙胍激活A(yù)MPK抑制IPF的機(jī)制

AMPK是由α、β、γ三種亞基組成的異源三聚體蛋白復(fù)合物，存在于所有真核細(xì)胞中。AMPK作為公認(rèn)的細(xì)胞內(nèi)能量感受器和代謝調(diào)節(jié)劑，不僅可控制合成代謝向分解代謝轉(zhuǎn)化，還能參與調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程，如自噬調(diào)節(jié)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激等。AMPK能夠刺激糖酵解、脂肪酸β氧化等能量生產(chǎn)途徑，抑制脂肪酸生物合成、膽固醇生物合成和糖異生等能量利用途徑。除此之外，AMPK激活還具有抗組織重塑功能。AMPK活性降低與肝、肺、腎等組織纖維化密切相關(guān)[3，10]。AMPK可在缺氧、葡萄糖缺乏等特定條件下被激活，其活性與細(xì)胞內(nèi)AMP水平呈正相關(guān)關(guān)系。二甲雙胍是國(guó)內(nèi)外各大糖尿病指南推薦的2型糖尿病首選治療藥物，能夠通過(guò)抑制呼吸電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ，從而抑制線粒體氧化磷酸化，減少ATP生成并增加細(xì)胞質(zhì)內(nèi)AMP和ADP，進(jìn)而提高AMP/ATP間接激活A(yù)MPK。二甲雙胍在IPF中的保護(hù)作用已有報(bào)道，其機(jī)制可能是通過(guò)激活A(yù)MPK實(shí)現(xiàn)的。目前認(rèn)為，二甲雙胍激活A(yù)MPK可能通過(guò)以下途徑抑制IPF進(jìn)展：阻斷核因子κB(NF-κB)通路，抑制炎癥反應(yīng)；下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)表達(dá)，抑制肺纖維化；抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表達(dá)，激活自噬[11-13]。

2.1 阻斷NF-κB通路，抑制炎癥反應(yīng) NF-κB是炎癥反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子，在免疫應(yīng)答中起重要作用。NF-κB由Rel(c-Rel)、p65(RelA)、RelB、p50、p52五個(gè)亞基組成，其中p65是其主要亞基。二甲雙胍能夠阻斷NF-κB通路，抑制下游炎癥因子IL-1、IL-6、IL-8表達(dá)。二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK抑制IκB激酶活性，抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的NF-κB核易位，從而減弱了IκBα的磷酸化，抑制了IκBα降解。AMPK激活后，通過(guò)其下游介質(zhì)沉默交配型信息調(diào)控2同源物1、叉頭盒蛋白O家族、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α和p53，間接抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制炎癥因子表達(dá)[13]。此外，內(nèi)源性分子或微生物激活NF-κB可增加NLRP3炎癥小體表達(dá)。NLRP3炎癥小體是一種由NOD樣受體蛋白3、連接蛋白ASC和半胱天冬氨酸酶原1前體組成的多蛋白復(fù)合物。激活NLRP3炎癥小體可導(dǎo)致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1成熟及IL-1β、IL-8加工[14]。簡(jiǎn)悅[15]研究表明，二甲雙胍能夠通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/NF-κB炎癥通路，改善肺纖維化大鼠肺部炎癥，對(duì)肺纖維化具有抑制作用。NF-κB在肺纖維化疾病的炎癥反應(yīng)中具有重要作用，能夠引起一系列炎癥反應(yīng)。而AMPK激活劑二甲雙胍可通過(guò)上調(diào)AMPK活性，抑制NF-κB表達(dá)，從而抑制炎癥因子釋放，在肺纖維化疾病的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抑制作用。

2.2 下調(diào)TGF-β表達(dá)，抑制肺纖維化 TGF-β是已知最主要的促纖維化生成因子，在細(xì)胞或組織中廣泛表達(dá)。TGF-β與潛在的TGF-β結(jié)合蛋白形成復(fù)合體，以復(fù)合體形式被釋放出來(lái)，從而發(fā)揮一系列生物學(xué)功能。在IPF發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，TGF-β起著至關(guān)重要的作用。TGF-β能夠通過(guò)抑制上皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞異常修復(fù)和結(jié)構(gòu)重塑介導(dǎo)肺纖維化[16]。TGF-β與靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，以Smad依賴性和非依賴性方式調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，從而在炎癥細(xì)胞的活化、EMT和ECM生成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在Smad家族中，Smad3充當(dāng)致病性介質(zhì)，而Smad2和Smad7作為保護(hù)性介質(zhì)。TGF-β誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原蛋白產(chǎn)生并伴隨著Smad3激活，誘導(dǎo)Smad3易位至細(xì)胞核，其作為轉(zhuǎn)錄激活因子上調(diào)上皮細(xì)胞中下游靶因子結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)Ⅰ型膠原蛋白生成。Smad3敲低則可抑制TGF-β對(duì)Smad3磷酸化和Ⅰ型膠原蛋白生成，降低CTGF表達(dá)[17]。在IPF動(dòng)物模型和IPF患者肺組織中均發(fā)現(xiàn)TGF-β表達(dá)上調(diào)。肺泡上皮細(xì)胞受損時(shí)，活性氧簇分泌增多，基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)下調(diào)，Ⅳ型膠原蛋白降解，肺泡上皮細(xì)胞凋亡并阻礙正常上皮再生，活化的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)入成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子，誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞分化，導(dǎo)致包括纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原蛋白在內(nèi)的ECM蛋白過(guò)度沉積，這一系列事件是由TGF-β通過(guò)經(jīng)典的Smad2/3途徑或非經(jīng)典的絲裂原活化蛋白激酶和磷酸肌醇3激酶途徑引起的[11]。在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型(BIPF)大鼠中，纖維化相關(guān)因子表達(dá)增加，二甲雙胍可通過(guò)抑制TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制肺泡EMT，上調(diào)肺組織上皮型標(biāo)志物鈣黏蛋白、緊密連接蛋白1表達(dá),下調(diào)α平滑肌肌動(dòng)蛋白、波形蛋白、膠原蛋白表達(dá)和Smad2/3磷酸化水平[18]。AMPK激活可通過(guò)TGF-β抑制肌成纖維細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞死亡[3]。二甲雙胍激活A(yù)MPK通過(guò)抑制Smad3驅(qū)動(dòng)的CTGF表達(dá)，降低TGF-β誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原蛋白生成。TGF-β還可通過(guò)經(jīng)典的Smad通路和非經(jīng)典的Smad通路參與肺泡上皮細(xì)胞異常增殖和肺組織結(jié)構(gòu)重塑，這也與AMPK活性受到抑制有關(guān)。二甲雙胍作為AMPK的激活劑可能通過(guò)上調(diào)AMPK活性，下調(diào)TGF-β表達(dá)，從而產(chǎn)生抗肺纖維化作用。

2.3 抑制mTOR表達(dá)，激活自噬 AMPK活性喪失會(huì)通過(guò)自噬不足、ECM累積和線粒體功能障礙，促進(jìn)成纖維細(xì)胞持續(xù)活化[3]。AMPK/mTOR是主要的自噬通路，AMPK激活可通過(guò)直接磷酸化ULK1促進(jìn)自噬，也可通過(guò)抑制mTOR激活自噬。自噬開(kāi)始于吞噬體的分離膜吞噬細(xì)胞組分，受ULK1復(fù)合物、Beclin1復(fù)合物的激活控制；接著是吞噬體膜的延伸和融合形成自噬體，需要ATG5、ATG12和微管相關(guān)蛋白Ⅰ輕鏈3(LC3)結(jié)合蛋白SQSTM1，并與自噬體內(nèi)膜上的LC3-Ⅱ蛋白結(jié)合；隨后自噬體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體。Beclin1、ATG12、LC3-Ⅱ、p62等均被認(rèn)為是自噬發(fā)生的生物標(biāo)志物。Beclin1是自噬啟動(dòng)的標(biāo)志性蛋白。ATG基因通過(guò)ATG12-ATG5和LC3-Ⅱ復(fù)合體控制自噬體形成。LC3與自噬小泡的數(shù)量呈正比，是自噬小體的標(biāo)志性分子。自噬受體蛋白p62是自噬后期的降解產(chǎn)物，與自噬活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。磷酸化AMPK的主要上游激酶是肝激酶B1(LKB1)，下游底物蛋白是mTOR。LKB1可以編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，直接激活A(yù)MPK。二甲雙胍通過(guò)使LKB1蛋白表達(dá)和啟動(dòng)子活性增加，以時(shí)間和劑量依賴方式刺激AMPK磷酸化而激活自噬，上調(diào)LC3-Ⅱ表達(dá)。3-甲基腺嘌呤和氯喹通過(guò)抑制自噬通路或下調(diào)Beclin1和LC3-Ⅱ，阻斷二甲雙胍的自噬保護(hù)作用[19-23]。在肺纖維化過(guò)程中，AMPK活性降低可激活mTOR表達(dá)，使自噬水平受到抑制，隨之發(fā)生纖維化病變。二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK/mTOR通路上調(diào)自噬水平而發(fā)揮抗肺纖維化作用。

3 二甲雙胍在肺纖維化模型中的應(yīng)用

3.1 二甲雙胍在BIPF中的作用 BIPF是最經(jīng)典的肺纖維化模型，被廣泛用于肺纖維化研究。在BIPF中，肺組織呈現(xiàn)明顯的纖維化病理改變，早期表現(xiàn)為肺部炎癥改變，晚期表現(xiàn)為肺部纖維化改變。有研究報(bào)道，二甲雙胍干預(yù)能夠降低BIPF小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)總細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，血清炎癥因子(如TNF-α、IL-6)水平降低，肺組織勻漿纖維化標(biāo)志物(如TGF-β、Smad2/3、Ⅰ型膠原蛋白等)表達(dá)亦降低[7，12，24]。GAMAD等[24]用不同劑量二甲雙胍干預(yù)BIPF小鼠，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠明顯改變肺纖維化病理改變，并具有劑量依賴性；進(jìn)一步研究證實(shí)，二甲雙胍通過(guò)上調(diào)AMPK表達(dá)和活性，抑制TGF-β表達(dá)，從而發(fā)揮抗肺纖維化作用。結(jié)果表明二甲雙胍能夠降低BIPF小鼠肺部炎癥反應(yīng)和纖維化程度[12，24]。

3.2 二甲雙胍在吉非替尼誘導(dǎo)肺纖維化中的作用 吉非替尼是一種治療肺癌的表皮生長(zhǎng)因子受體—酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，其副作用之一是可導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)和纖維化。LI等[25]在雄性SD大鼠氣管內(nèi)注射博來(lái)霉素可導(dǎo)致正常肺結(jié)構(gòu)破壞，成纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞增多，膠原纖維廣泛沉積；口服吉非替尼可顯著增強(qiáng)其肺纖維化程度；羥脯氨酸(HYP)是肺纖維化中膠原纖維的主要成分之一，二甲雙胍干預(yù)后可使肺組織HYP表達(dá)降低。二甲雙胍能夠顯著降低EGFR-TKI治療后肺癌細(xì)胞中TGF-β表達(dá)，其下游分子IL-6、pSmad2和pSmad3表達(dá)降低，減少了肺泡區(qū)EMT發(fā)生。以上研究表明，二甲雙胍能夠用于治療吉非替尼誘導(dǎo)的肺纖維化，或許今后可以與抗腫瘤藥物一起服用，來(lái)預(yù)防吉非替尼副作用引起的肺纖維化。

3.3 二甲雙胍在輻射誘導(dǎo)肺纖維化中的作用 放療是惡性腫瘤的主要治療手段之一，但輻射過(guò)量可誘導(dǎo)肺纖維化。WANG等[26]研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠接受全肺20 Gy照射后肺密度值明顯升高，而二甲雙胍干預(yù)后能明顯降低胸部照射引起的肺密度值升高，說(shuō)明二甲雙胍能夠降低肺實(shí)質(zhì)組織病理學(xué)改變，局灶性纖維化結(jié)節(jié)、炎癥浸潤(rùn)和膠原沉積明顯改善；二甲雙胍治療后肺組織HYP、Col1、TGF-β表達(dá)降低，還觀察到二甲雙胍干預(yù)能夠抑制輻射誘導(dǎo)的pSmad2、pSmad3表達(dá)。以上研究表明，二甲雙胍能夠抑制輻射誘導(dǎo)的肺纖維化，其機(jī)制可能與抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路，從而減弱輻射誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞活化有關(guān)。因此，二甲雙胍可能適用于放療引起肺纖維化的預(yù)防和治療。

當(dāng)前，對(duì)IPF仍缺乏有效的治療手段，二甲雙胍作為治療2型糖尿病的首選藥物，能夠通過(guò)激活A(yù)MPK作用于下游靶標(biāo)NF-κB、TGF-β、mTOR，從而通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、肺纖維化和激活自噬發(fā)揮肺保護(hù)作用。二甲雙胍對(duì)IPF動(dòng)物模型具有較好的肺保護(hù)作用，但對(duì)IPF患者并未明顯改善疾病進(jìn)展和臨床預(yù)后[27]，這可能與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不一、觀察時(shí)間不足以及服用可能影響結(jié)局的干預(yù)藥物等有關(guān)。二甲雙胍雖然有望成為未來(lái)治療IPF相對(duì)理想的藥物，但目前仍需要相關(guān)的臨床研究進(jìn)一步探索。