賈 潛，程 超,2，田 成，李 偉，周 志，莫開菊,2，汪興平,2,

（1.湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.生物資源與利用湖北省重點實驗室（湖北民族大學(xué)），湖北 恩施 445000）

糟姜是嫩姜片和紅辣椒丁，配以大蒜、適量食鹽等自然發(fā)酵而成，具有酸、辣、香、脆特點[1]。由于糟姜經(jīng)發(fā)酵形成多種風味化合物，食味優(yōu)良，因此深受消費者的喜愛。目前國內(nèi)外許多學(xué)者對發(fā)酵蔬菜的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行研究[2-8]，但是糟姜的風味相關(guān)研究鮮見報道。

頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（head-space solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass specteometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)是目前對揮發(fā)性風味成分進行分析的重要手段[9]。借助于此技術(shù)，Lu Zhenming等[10]對牛樟芝不同發(fā)酵階段發(fā)酵液中的揮發(fā)性化合物進行定性和定量分析，Ma Xiaowei等[11]對中國37 個芒果品種的揮發(fā)物組成和含量進行分析，Begala等[12]分析了Cannonau 葡萄酒香氣成分，尤其是葡萄酒中萜烯的產(chǎn)生機理。電子鼻可將揮發(fā)成分的整體信息與數(shù)據(jù)庫中的信號作比較，從而綜合判定樣品的氣味[13]。該技術(shù)可在短時間內(nèi)迅速分析、判別樣品中的氣味差異[14]， 因此電子鼻技術(shù)普遍使用在加工方式對樣品風味的 影響[15]、樣品分類[16-17]、產(chǎn)地鑒別[18]等方面。

風味是指導(dǎo)消費者購買的重要感官指標之一，而處理方式對產(chǎn)品風味的影響一直是關(guān)注的熱點。如謝靚等[19]發(fā)現(xiàn)3 種方式干燥的豆豉味道有差異，自然曬制、烘箱烘干2 種干燥方式處理后豆豉的味道較接近?；酐惗郲20]發(fā)現(xiàn)耐高溫包裝袋烤鰻魚的品質(zhì)保真效果最好，是烤鰻魚的最佳包裝袋。常思盎等[21]發(fā)現(xiàn)復(fù)熱工藝能使產(chǎn)品本身的雞肉風味有所增強。王歡歡[22]發(fā)現(xiàn)全程維持4 ℃貯藏，隨時間延長番茄汁特征性風味組分的比例得到了很好的保持。 張靜等[23]發(fā)現(xiàn)電磁加熱處理的肌肉風味成分更豐富。

目前國內(nèi)外學(xué)者對糟姜貯藏過程中風味物質(zhì)變化規(guī)律及保真方法的研究相對較少，而揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化規(guī)律的掌握可在一定程度上指導(dǎo)糟姜的工業(yè)化生產(chǎn)，因此對糟姜風味保真技術(shù)的研究勢在必行。本實驗即采用HS-SPME-GC-MS結(jié)合電子鼻技術(shù)檢測6 種處理方法的糟姜的風味物質(zhì)，通過主成分（principal component analysis，PCA）和聚類分析，以確定不同處理方式對糟姜的風味保真效果，旨在為糟姜產(chǎn)品開發(fā)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮姜購于湖北鳳頭食品有限公司。烷烴標準品（C8～C40）（色譜純） 美國Sigma公司；NaCl、無水Na2SO4（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；脫氫乙酸鈉、雙乙酸鈉、山梨酸鉀均為食品級。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；萃取頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS、手動SPME進樣器 美國Supelco公司；6890-5973 GC-MS聯(lián)用儀 美國 Agilent公司；PEN3便攜式電子鼻 德國Airsense公司。

1.3 方法

1.3.1 糟姜樣品制備

取嫩姜樣品，切片機切成5 mm左右，添加4%苞谷酒、4%冰糖、6%～7%的食鹽，同時配以適量紅辣椒丁、花椒、大蒜、25 ℃發(fā)酵1 個月，然后采用巴氏殺菌、防腐劑處理后真空包裝，并以僅真空包裝樣品為對照。具體處理方式見表1。

表1 6 種處理方式糟姜樣品編號Table 1 Six treatments applied to Zaojiang samples

1.3.2 HS-SPME-GC-MS測定糟姜的揮發(fā)性成分

萃取條件：將不同處理的糟姜，切碎，磨成漿狀，稱取1 g裝于萃取瓶中，依次加入30% NaCl、2 g無水Na2SO4，將萃取瓶在45 ℃水浴溫度下平衡12 min，之后在同樣溫度下將裝有50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維頭的手動進樣器插入萃取瓶中頂空萃取40 min，最后將纖維頭插入GC-MS進樣口，解吸溫度250 ℃，解吸時間5 min。重復(fù)測定3 次。

GC條件：DB-5MS石英毛細柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；He流量1 mL/min；不分流進樣；進樣口溫度250 ℃；程序升溫：初始溫度50 ℃，以5 ℃/min上升至85 ℃，保持1 min；以3 ℃/min上升至165 ℃，保持1 min；以10 ℃/min上升至250 ℃，保持3 min[24]。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z33～400。

1.3.3 電子鼻檢測糟姜的揮發(fā)性成分

PEN3便攜式電子鼻，包含10 個金屬傳感器陣列（表2）。將不同處理的糟姜磨成漿狀，分別稱取樣品12 g裝入樣品瓶，常溫放置30 min，進行測定。

表2 電子鼻傳感器所對應(yīng)的香氣類型Table 2 Aroma types corresponding to electronic nose sensors

電子鼻參數(shù)設(shè)置：樣品間隔時間1 min，自動清洗時間95 s，歸零時間5 s，插入時間5 s，測定時間90 s，吸氣流量180 mL/min，進樣流量180 mL/min。金屬傳感器在60 s后基本穩(wěn)定，選定65、66 s和67 s時響應(yīng)值，并計算其平均值[25]，重復(fù)操作5 次。

1.3.4 風味物質(zhì)分析

利用GC-MS儀器自帶的分析軟件，對糟姜樣品采集到的數(shù)據(jù)在NIST 14標準譜庫中檢索，選擇相似度達80%以上的成分，并根據(jù)烷烴標準品（C8～C40）提供的保留時間（retention time，RT）計算保留指數(shù)（retention index，RI），對鑒定得到的揮發(fā)性成分進行分析，通過各物質(zhì)峰面積估算各物質(zhì)含量，以相對含量計[26]。每組樣品測定3 個平行，其保留時間和相對含量均以平均值計算。RI公式如下：

式中：n為正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)；tx、tn、tn＋1分別為物質(zhì)x和n、n＋1碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴的保留時間/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Smica14.1軟件對數(shù)據(jù)進行PCA和作圖，利用SPSS 22和Origin 2018作聚類分析[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理糟姜的HS-SPME-GC-MS分析

2.1.1 不同處理糟姜風味物質(zhì)的GC-MS分析

表3 不同處理糟姜的揮發(fā)性成分及相對含量Table 3 Contents of volatile components in Zaojing subjected to different treatments

續(xù)表3

續(xù)表3

采用GC-MS測定6 種處理方式糟姜的風味成分，結(jié)果見表3，按照化學(xué)結(jié)構(gòu)對風味物質(zhì)進行分類，結(jié)果見 圖1。由表3可計算出在6 種處理的糟姜中共鑒定117 種風味物質(zhì)，對照表3的主要風味物質(zhì)，可以看出在烷烴類物質(zhì)（74 種）中主要是萜烯類化合物，而醇類物質(zhì)主要是萜烯醇類（20 種），其他的化合物如羰基化合物7 種、酯類7 種、酸類3 種、酚類2 種、芳香族化合物4 種。不同處理糟姜所含的風味物質(zhì)種類不同，P65、P85、SD、SDA、PS、CG分別鑒定出55、60、40、59、62、60 種，其中變化較大的是烷烴類物質(zhì)，SD處理糟姜中顯著下降，僅有26 種。此外不同處理間糟姜所含主要風味物質(zhì)種類有差異，P65和P85熱處理，與對照CG相比，萜烯類物質(zhì)含量和種類增加，同時萜烯醇類和芳香族化合物含量隨溫度升高大幅度上升，而羰基化合物隨溫度升高顯著下降。相比而言，SD、SDA和PS使用了防腐劑處理的糟姜，萜烯類、萜烯醇類、芳香族化合物、酯類含量變化差異不大。這幾個處理組檢出的酸類物質(zhì)主要是防腐劑對應(yīng)的酸。此外在不同處理組中共有風味成分含量也有差異，其中變化最顯著的是姜油烯、β-倍半水芹烯、α-姜黃烯，這三類風味成分在熱處理組含量明顯高于對照組。

通過以上變化可以看出，冷處理組（SD、SDA和PS）對糟姜的風味物質(zhì)含量影響不大，但是P65和P85伴隨著熱處理，萜烯醇類及羰基化合物、芳香族化合物隨著殺菌溫度發(fā)生變化，導(dǎo)致風味變化。

2.1.2 不同處理糟姜GC-MS測定風味物質(zhì)的PCA

由2.1.1節(jié)分析可看出不同處理糟姜的風味物質(zhì)種類有變化，進一步分析相對保真效果好的風味物質(zhì)，利用PCA對不同糟姜中的GC-MS測定的風味物質(zhì)進行評價，提取3 個PC，PC1方差貢獻率為42.80%，PC2為27.80%，PC3為17.10%，累計方差貢獻率為87.70%，表明PC1、PC2、PC3的總貢獻率包含了樣品的大部分信息，能代表樣品揮發(fā)性風味的主要特征。PCA的特征向量和載荷矩陣見表4。

表4 PC的特征向量與載荷矩陣Table 4 Eigenvectors and loading matrix of first three PC

各P C 的載荷值代表該類物質(zhì)在該P C 上的反映 程度[28]。相關(guān)系數(shù)絕對值越大，PC對該變量的代表性也越大[29]。羰基化合物和酯類在PC1上載荷值較高，說明PC1主要反映羰基化合物和酯類風味成分信息，且呈正相關(guān)；醇類和芳香族化合物在PC2上載荷值較高，且呈正相關(guān)；酸類在PC3上載荷值較高，且酸類為風味成分的負向影響因素。

圖2 不同處理糟姜GC-MS測定風味成分的PCA圖Fig. 2 PCA plot of flavor components determined by GC-MS in Zaojiang subjected to different treatments

如圖2所示，沿PC1方向，SDA與CG相距最遠，即經(jīng)過雙乙酸鈉處理的糟姜與對照組香氣成分差異較大；PS與CG相距最近，即經(jīng)過山梨酸鉀處理的糟姜與對照組香氣成分差異最小。沿PC2方向，P85與CG糟姜樣相距較遠，即經(jīng)過85 ℃巴氏殺菌處理的糟姜與對照組香氣成分差異較大，沿著PC3方向，P65與CG糟姜樣相距較遠，即經(jīng)過65 ℃巴氏殺菌處理的糟姜與對照組風味成分差異較大。但從PC1、PC2、PC3綜合來看，PS與CG糟姜樣都相距最近，可判斷山梨酸鉀處理組與對照組兩者整體風味相似；SD、SDA與CG較近，P65、P85與CG最遠；基本上可以劃分為冷處理和熱處理兩類。

2.1.3 不同處理糟姜GC-MS測定風味物質(zhì)的聚類分析

圖3 不同處理糟姜GC-MS測定風味物質(zhì)的聚類分析圖Fig. 3 Cluster analysis dendrogram of flavor components determined by GC-MS in Zaojiang subjected to different treatments

采用Origin 2018軟件對GC-MS所測數(shù)據(jù)進行聚類分析，以相關(guān)性為聚類指標，相關(guān)性越近的距離越近，結(jié)果見圖3?？梢钥闯觯跉W式距離小于0.001時，SDA、PS和CG聚為一類，說明這三者風味物質(zhì)和風味特征相似度最高，這與GC-MS所測風味物質(zhì)的PCA結(jié)果一致。

為了進一步明確PS、CG、SDA和其他處理組的差異，選取這3 組和與其差異最大的P85處理糟姜進行Venn圖分析。由圖4可以看出，這4 種處理組中共有的風味物質(zhì)29 種，CG、PS、SDA、P85各單獨有7、8、4、16 種獨有的成分，P85處理糟姜獨有風味成分最多，可能是因為熱處理過程中糟姜產(chǎn)生了新的風味物質(zhì)。經(jīng)比對P85處理糟姜中主要特有的風味物質(zhì)為γ-姜黃素、氧化芳樟醇（具有強烈的新鮮的甜香、木香和花香）、桉樹醇、松油醇（萜品醇，具似海桐花的清香，甜的紫丁香、鈴蘭氣息）、4-萜烯醇、(＋)-α-柏木萜烯、γ-去二氫菖蒲烯等，這些風味物質(zhì)可能是糟姜熱處理過程中產(chǎn)生的嗅感成分。

圖4 4 種處理糟姜的GC-MS測定風味成分Venn圖Fig. 4 Venn diagram showing shared and unique flavor components among Zaojiang subjected to different treatments

2.2 不同處理糟姜的電子鼻分析

由于GC-MS可以測得具體的微觀風味物質(zhì)種類和含量，但無法從宏觀上把握糟姜的整體風味，因此利用電子鼻對不同處理的糟姜進行測定。

2.2.1 電子鼻的傳感器信號分析

圖5 不同處理糟姜的電子鼻指紋圖Fig. 5 Electronic nose fingerprint of Zaojiang subjected to different treatments

通過提取各個傳感器的響應(yīng)值，建立不同處理糟姜的電子鼻指紋圖，如圖5所示。不同處理的糟姜對10 種傳感器的反應(yīng)信號強度有差異，其中5 種傳感器（W1C、W3C、W5C、W1W、W2W）響應(yīng)值的差異比較明顯，結(jié)合電子鼻傳感器陣列性能特點[30]，這幾種傳感器均是對芳香族化合物、萜烯類物質(zhì)比較敏感，由此可見在不同處理組的糟姜中芳香族化合物和萜烯類物質(zhì)含量豐富。

2.2.2 不同處理糟姜的電子鼻PCA

如圖6A所示，不同處理糟姜電子鼻分析共提取了2 個主成分，PC1方差貢獻率為86.40%，PC2為9.41%，累計方差貢獻率為95.81%。表明PC1和PC2的總貢獻率幾乎包含了糟姜樣品的所有信息，可以代表樣品揮發(fā)性風味的主要特征。圖中數(shù)據(jù)點之間無重疊，說明電子鼻可以較好地分辨樣品風味。從6 種糟姜在圖6A的分布位點看，即PC1和PC2的綜合距離看，可以認為PS與CG距離最近，風味特征最相似，SD與SDA、P65與P85相似。若僅以PC2判定，可以將樣品分為熱處理類和冷處理類。另由圖6B可看出，除W2W傳感器與PC2相關(guān)性大外，其他傳感器均與PC1顯著相關(guān)。

圖6 不同處理糟姜的電子鼻PCA圖Fig. 6 PCA plots of electronic nose sensor responses to Zaojiang subjected to different treatments

2.2.3 不同處理糟姜的電子鼻聚類分析

圖7 不同處理糟姜的電子鼻聚類分析圖Fig. 7 Cluster analysis dendrogram of electronic nose sensor responses to Zaojiang subjected to different treatments

采用和GC-MS相同的處理方法對不同處理糟姜的電子鼻數(shù)據(jù)進行聚類分析，結(jié)果見圖7。當歐式距離為小于0.002時，PS、CG聚為一類，歐式距離小于0.004時，PS、CG和SDA歸為一類，歐式距離小于0.006時，PS、CG、SDA和P65歸為一類，而P85和SD則與之歐式距離較遠。再次說明PS（山梨酸鉀處理）風味最接近CG（對照）糟姜的固有風味，其次是SDA（雙乙酸鈉處理），而同為防腐劑處理的SD（脫氫乙酸鈉處理），則與CG相差較大。同為巴氏殺菌的處理，P65比P85更接近CG。對比GC-MS的聚類分析結(jié)果可以看出，二者有略微差異，但在聚類歐式距離0.002以內(nèi)，電子鼻和GC-MS的聚類分析結(jié)果基本一致。

3 結(jié) 論

HS-SPME-GC-MS檢測出6 種處理的糟姜共有117 種揮發(fā)性風味物質(zhì)，主要物質(zhì)類別為萜烯類（74 種），其次分別是醇類（20 種）、羰基化合物（7 種）、芳香族化合物（4 種）、酯類（7 種）、酸類（3 種）、酚類（2 種）。

糟姜作為一種民族特色食品，其產(chǎn)品品質(zhì)長期以來受到處理方式的困擾，因此本實驗分別對比熱處理和冷處理兩類方式在糟姜風味保真效果的影響。通過對 HS-SPME-GC-MS和電子鼻測定結(jié)果進行PCA、聚類分析，相對于對照組和冷處理組，熱處理糟姜的GC-MS中產(chǎn)生了較多的萜烯、萜烯醇、羰基化合物和較少的芳香族化合物，因此從風味上冷處理對糟姜的保真效果優(yōu)于熱處理。在冷處理中0.1%山梨酸鉀與對照組糟姜風味最為接近，風味保真效果最好。此外發(fā)現(xiàn)電子鼻結(jié)合GC-MS聯(lián)用技術(shù)可以全面分析不同處理對糟姜風味的影響，電子鼻宏觀上說明了不同處理糟姜的風味輪廓的相似性和差異性，而HS-SPME-GC-MS不僅能對不同保藏方法的糟姜風味成分進行定性、定量分析，且能從微觀上補充了更為詳細的風味物質(zhì)的具體種類及其異同點。通過對2 種測定方法的具體實驗數(shù)據(jù)分析表明，GC-MS結(jié)合電子鼻技術(shù)可以對不同處理的糟姜進行有效且明顯的區(qū)分和歸類，GC-MS和電子鼻具有高度的統(tǒng)一性，可以評價糟姜的風味保真效果，本研究為糟姜的加工、貯藏和開發(fā)利用提供一定的依據(jù)。