大動脈炎主動脈壁炎癥細胞免疫組化染色

萬瑾，張倩茹，郭娟，楊研，周煒

大動脈炎(Takayasu arteritis，TA)是一種自身免疫性大血管炎，主要累及主動脈弓及其一級分支，受累血管可出現(xiàn)狹窄、閉塞或擴張，從而引起相應的臨床癥狀[1]，可有脈搏消失、頭暈、黑朦、間歇性跛行等表現(xiàn)，常伴有發(fā)熱、乏力等全身炎癥反應。該病好發(fā)于亞洲，年輕女性多見，多于50歲以前起病，男女患病率約1∶4[2-3]。TA的發(fā)病原因尚不清楚，病理為全層動脈炎性改變[4]。細胞免疫在大動脈炎發(fā)病機制中占有重要地位，TA動脈壁標本可見較多CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞浸潤[5]，但體液免疫是否參與仍不明確。本研究通過分析TA動脈壁免疫細胞表達的特點，并與其他大動脈病變相比較，以期探討B(tài)細胞和漿細胞是否在大血管炎發(fā)病中發(fā)揮作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

對阜外醫(yī)院經(jīng)心臟外科行手術治療的8例TA患者進行回顧性研究，手術時間為2002年10月至2008年5月，所有患者有大動脈壁病理標本。8例TA均符合1990年美國風濕病學會大動脈炎診斷標準[6]，采集其臨床表現(xiàn)、實驗室檢查及影像學資料，臨床分型依據(jù)中華醫(yī)學會風濕病學分會發(fā)布的《大動脈炎診斷及治療指南》[7]，包括I型：頭臂動脈型；Ⅱ型：胸腹主動脈型；Ⅲ型：廣泛型；Ⅳ型：肺動脈型。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗體與試劑：鼠抗人CD20單克隆抗體，CD138單克隆抗體，CD4單克隆抗體(美國invitrogen公司)；辣根過氧化物酶標記兔抗鼠二抗(美國GBI公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(北京中衫金橋生物技術有限公司)；蘇木素(南京凱基生物發(fā)展有限公司)。

1.2.2 病理檢查：(1)11例患者于手術中切除的動脈壁組織常規(guī)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片HE染色，進行病理診斷。(2)免疫組織化學染色(immunohistochemistry， IHC)：對石蠟包埋標本再次切片(5 μm)，常規(guī)脫蠟水化； pH 6.0檸檬酸鹽抗原修復液高壓抗原修復。0.03%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶；3%牛血清白蛋白封閉抗原。隨后滴加一抗37 ℃孵育90 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次；辣根過氧化物酶標記二抗37 ℃避光孵育半小時。PBS清洗3次。DAB顯色，蘇木素復染細胞核。

1.2.3 結果判斷：常規(guī)HE染色，動脈壁中除內(nèi)皮細胞、成纖維細胞以及平滑肌細胞以外的單個核類圓形細胞為淋巴細胞，每平方毫米50個以上淋巴細胞聚集為浸潤的淋巴細胞灶。IHC組織切片上細胞有50%以上的細胞膜出現(xiàn)棕黃色著色為染色陽性。CD4+的單個核細胞為輔助T淋巴細胞；CD20+的單個核細胞為B淋巴細胞；CD138+的單個核細胞為漿細胞，計數(shù)每個動脈壁組織切片內(nèi)輔助T細胞，B細胞和漿細胞數(shù)量。每平方毫米有50個以上CD4+T細胞、CD20+B細胞或CD138+漿細胞聚集定義為1個細胞灶。有細胞灶出現(xiàn)時，細胞灶內(nèi)陽性細胞數(shù)量遠遠多于散在陽性細胞，因此僅計數(shù)每個切片中出現(xiàn)的淋巴細胞和/或漿細胞灶數(shù)；沒有細胞聚集成灶的組織切片，計數(shù)散在CD4+T細胞、CD20+B細胞或CD138+漿細胞的數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 臨床及影像學表現(xiàn)

8例TA中，男性4例，女性4例，平均年齡(34.5±15.78)歲,病程平均為(46.13±37.47)個月。

TA患者臨床表現(xiàn)見表1，頭暈、黑矇、活動后胸悶、心悸等癥狀多見。8例TA患者中5例ESR升高，平均(29.25±15.64) mm/h。8例TA患者血管受累較廣泛，2例Ⅱ型，6例Ⅲ型。

2.2 病理學檢查結果

8例患者均為主動脈標本，大體肉眼所見均有管壁增厚，呈“洋蔥皮”樣改變，HE染色符合大動脈炎表現(xiàn)，其中4例可見淋巴細胞聚集灶，其他標本動脈壁中均見不同程度炎癥細胞浸潤(表1，圖1)。

2.3 免疫組織化學染色結果

8例TA中， 6例CD4+輔助T細胞聚集成灶(圖2A)，2例散在分布，分別計數(shù)64個和91個細胞(表1)；6例CD20+B細胞灶性浸潤(圖2B)，2例散在分布，分別計數(shù)13個和69個細胞(表1)；3例見到大量CD138+漿細胞浸潤(表1)并聚集成灶(圖2C)。

表1 8例TA患者臨床表現(xiàn)、影像學結果及病理表現(xiàn)Table 1 Clinical manifestations, radiological image findings, and the pathological characteristics of aorticwall biopsy of 8 TA patients

圖 1 TA動脈壁組織病理圖片(TA動脈壁中見炎癥細胞灶性浸潤)(HE染色,×100)Fig 1 A massive inflammatory infiltrating foci within the adventitia of an aortic specimen from a patient with Takayasu arteritisHematoxylin-eosin staining(×100)

圖 2 TA動脈壁免疫組化染色Fig 2 Distribution of (A,B) CD4+T cells,(C,D) CD20+B cells and (E,F) CD138+ plasma cells in a massive inflammatory infiltrating foci within the adventitia of an aortic specimen from a patient with Takayasu arteritisA：CD4+T細胞呈灶狀分布(EliVision法,×100)；B：A放大圖(×400)；C：CD20+B細胞呈多量浸潤分布(EliVision法,×100)；D：C放大圖(×400)；E：CD138+漿細胞呈多量浸潤分布(EliVision法,×100)；F：E放大圖(×400)

3 討論

TA是一種以主動脈及其主要分支受累出現(xiàn)狹窄、閉塞，或伴有動脈瘤形成的慢性非特異性大血管炎[8]。TA病理標本顯示主動脈壁增厚不規(guī)則，內(nèi)膜增生，中膜和外膜纖維化收縮，伴有急性滲出性炎癥、慢性非特異性炎癥和各種肉芽腫性炎[9]，不同時期病理表現(xiàn)不同：急性期炎癥過程涉及血管壁的所有層，表現(xiàn)為淋巴細胞、漿細胞和多形核白細胞的積聚[10],中期表現(xiàn)為動脈壁增生和外中膜和外膜內(nèi)炎癥過程的進展,終末期則表現(xiàn)為彌漫性或結節(jié)性血管周圍纖維化，隨后管腔變窄[10-11],當疾病快速進展導致纖維化不足和延遲時，血管壁可能會變薄并導致動脈瘤樣擴張[10]。本研究TA血管病變主要表現(xiàn)為管壁的狹窄、閉塞,考慮這些患者病程均為疾病的中期或終末期。

有研究證實,在組織學中可以看到TA動脈管壁浸潤的炎癥細胞15%為CD4+T細胞[12]，其作用是可以通過Th1釋放干擾素誘發(fā)和維持肉芽腫形成[13]。同時,在活動性TA動脈外膜中發(fā)現(xiàn)了B細胞浸潤[9],在外周血中也發(fā)現(xiàn)高于正常對照組的B細胞[14]，活動性TA患者的B細胞活化因子水平(BAFF)升高，緩解期時BAFF循環(huán)水平下降[15]，利妥昔單抗治療TA有效[16]，這些證據(jù)均支持CD4+T細胞及B細胞在TA發(fā)病機制中的作用。在本研究所有TA標本中均見到CD4+輔助T細胞和CD20+B細胞在動脈壁中浸潤，與文獻報道一致，且其中大部分患者輔助T細胞和B細胞均聚集成灶，有3例患者漿細胞也聚集成灶，并且此3例患者均處于TA活動期，提示適應性免疫反應，包括體液免疫反應參與了TA發(fā)病。

B細胞在自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的發(fā)病中起重要作用。Zhao等[17]提出，SLE中B細胞同時通過抗體依賴和非抗體依賴途徑發(fā)揮免疫作用。目前尚無TA相關自身抗體被發(fā)現(xiàn)，TA的發(fā)病是固有免疫成分異常激活，還是適應性免疫反應異常激活，尚無定論。本研究發(fā)現(xiàn)TA動脈壁中有T細胞，B細胞和漿細胞的灶性浸潤，提示B細胞在TA發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用。B細胞除了活化形成漿細胞分泌自身抗體外，可能通過非抗體依賴途徑影響T細胞活化和促炎細胞因子的產(chǎn)生而參與大動脈壁內(nèi)炎癥反應。TA動脈壁IHC結果提示B細胞清除治療(B cell depletion therapy，BCDT)可能成為治療難治性TA患者的一種選擇。近年來越來越多使用BCDT成功治療難治性TA的研究均提示B淋巴細胞在TA生理病理學中的潛在作用[18-19]。

綜上所述，本研究提示除了T細胞介導的細胞免疫發(fā)病機制外，B細胞也參與TA發(fā)病，為BCDT治療難治性TA提供了證據(jù)。目前尚無TA相關自身抗體被發(fā)現(xiàn)，體液免疫在TA發(fā)病中的作用需要進一步的研究。