王 芳 張建中 杜 娟

北京大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科，北京，100044

系統(tǒng)性硬皮病(systemic sclerosis, SSc)是以皮膚及各內(nèi)臟器官纖維化為特征的自身免疫性皮膚病。該病的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，與血管損傷、免疫失調(diào)及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)病理性沉積均密切相關(guān)[1]。SSc在皮膚、肢端硬化的同時(shí)可出現(xiàn)多種內(nèi)臟器官纖維化，包括：肺、消化道、心臟、腎臟等，晚期可出現(xiàn)器官危象，臨床治療棘手。免疫失調(diào)與SSc發(fā)病密切相關(guān)，圍繞相關(guān)免疫細(xì)胞及因子的研究近年來有較多進(jìn)展。最新二代RNA測序研究發(fā)現(xiàn)：彌漫型SSc患者早期皮損中M2型巨噬細(xì)胞(96%)、M1型巨噬細(xì)胞(94%)、CD8+T細(xì)胞(65%)、CD4+T細(xì)胞(60%)及B細(xì)胞(69%)表達(dá)均較高，可見固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答在SSc早期均發(fā)揮重要作用；而皮損中巨噬細(xì)胞浸潤提示患者病程較長、皮膚硬化程度高[2]。固有免疫是人體防御外源及內(nèi)源性傷害的“第一道”屏障，在激活免疫系統(tǒng)和晚期組織纖維化中均發(fā)揮作用[3]。它通過Toll樣受體識(shí)別內(nèi)外源性抗原，并由抗原提呈細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞等)激活特異性T細(xì)胞，建立與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的聯(lián)系；同時(shí)，單核/巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等分泌的促炎細(xì)胞因子，如IL-4、IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)等，可促進(jìn)局部炎癥，誘導(dǎo)ECM病理性沉積[4]。目前國內(nèi)文獻(xiàn)針對(duì)該領(lǐng)域關(guān)注較少[5]，本文將對(duì)固有免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞及相關(guān)蛋白、細(xì)胞因子等在SSc發(fā)病中的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 單核/巨噬細(xì)胞

單核/巨噬細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)者，SSc早期出現(xiàn)血管內(nèi)皮損傷，血液中靜息狀態(tài)的單核細(xì)胞M0被募集進(jìn)入組織，和組織中常駐巨噬細(xì)胞Mφ共同引起炎癥反應(yīng)，巨噬細(xì)胞分化為經(jīng)典M1或替代激活M2表型，稱為極化[6]。如該部位炎癥持續(xù)存在，則分泌過多促纖維化細(xì)胞因子，引發(fā)ECM病理性聚集[7]。研究表明，SSc患者外周血中單核細(xì)胞(CD14+)增加，細(xì)胞凋亡減少[8]；Soldano等最新發(fā)現(xiàn)SSc患者血液循環(huán)中的M1(CD80、CD86、TLR2和TLR4標(biāo)記)/M2(CD163、CD206和CD204標(biāo)記)雙陽性單核/巨噬細(xì)胞百分比顯著高于健康人[9]；而該組患者肺間質(zhì)纖維化和肺動(dòng)脈高壓的臨床表現(xiàn)更加嚴(yán)重[10]。同時(shí)，在患者皮損中增厚的膠原束間、血管和附屬器周圍均有單核/巨噬細(xì)胞浸潤。

目前發(fā)現(xiàn)，M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)特定的表型標(biāo)記，包括TLR2、TLR4和共刺激分子CD80和CD86，可被IFN-γ/LPS以及GM-CSF激活，并產(chǎn)生iNOS、IL-12、IL-1β和TNF等炎癥介質(zhì)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。相反，抗炎型M2型巨噬細(xì)胞主要表達(dá)甘露糖受體-1(CD206)和巨噬細(xì)胞清除劑受體(CD204和CD163)，體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)至少三種亞類的M2型巨噬細(xì)胞：M2a(被IL-4和IL-13激活)、M2b(被免疫復(fù)合物和LPS激活)和M2c(被IL-10和TGF-β激活)[6]。M2型巨噬細(xì)胞與Th2輔助T細(xì)胞共同作用，釋放VEGF及抗炎細(xì)胞因子IL-10等，參與組織修復(fù)相關(guān)和纖維化過程[11]。

通常認(rèn)為M1型巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎癥發(fā)生也促進(jìn)纖維降解，而M2型巨噬細(xì)胞緩解炎癥活動(dòng)也促進(jìn)纖維形成，但在不同的巨噬細(xì)胞表型和不同的微環(huán)境下其作用并不完全一致，M1/M2型細(xì)胞在SSc皮膚纖維化中的作用仍有爭議。Higashi-Kuwata等[12]發(fā)現(xiàn)患者皮損中M2型細(xì)胞增加且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，M2型細(xì)胞可產(chǎn)生大量TGFβ-1促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，它還可增加組織金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteases, TIMP-1)分泌，通過抑制金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)活性而減少細(xì)胞外基質(zhì)降解。M2型細(xì)胞可被IL-4激活，在創(chuàng)傷小鼠模型中可通過調(diào)節(jié)IL-4產(chǎn)生促纖維化作用，缺乏IL-4Ra受體或者M(jìn)2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因Retnlα(resistin-like alpha)的小鼠在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中膠原蛋白產(chǎn)生減少[13]。最新發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞分泌大量IL-4和TGFβ-1，并且選擇性通過IL-4/JAK1/STAT6通路促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化[14]。

巨噬細(xì)胞極化可受多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)。Wnt/β-catenin通路可促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化并向M2型表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)纖維化進(jìn)程[15]；而β-catenin的外用抑制劑C-82阻斷該通路，則可以有效改善皮膚纖維化。JAK/STAT通路也可激活巨噬細(xì)胞，當(dāng)該通路受體與IL-4結(jié)合可促使胞內(nèi)STAT6磷酸化，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，加速纖維化過程[16]。TGF-β/Smad通路激活也可促使巨噬細(xì)胞向促纖維化表型轉(zhuǎn)化，而巨噬細(xì)胞自分泌TGF-β可以加速并放大纖維化效應(yīng)。鑒于巨噬細(xì)胞在SSc中的發(fā)病作用，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化的信號(hào)通路將可能成為疾病治療中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2 肥大細(xì)胞

肥大細(xì)胞(mast cell)是一種富含致密顆粒的免疫細(xì)胞，在防止寄生蟲感染以及過敏性疾病中起關(guān)鍵作用。臨床發(fā)現(xiàn)，SSc患者硬化的皮膚中肥大細(xì)胞密度顯著增加，且與患者病程、皮膚的改良Rodnan評(píng)分以及血清抗拓?fù)洚悩?gòu)酶I抗體正相關(guān)，提示該炎癥細(xì)胞參與疾病早期炎癥[17]。同時(shí)，肥大細(xì)胞在原發(fā)性心臟、腎臟和肺部纖維化疾病中均有浸潤[18]。研究發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞的囊泡是促炎因子(如TNF-α、IL-17等)和促纖維化分子(如IL-4、IL-10及TGF-β等)的儲(chǔ)存庫，可通過脫顆粒釋放或直接與成纖維細(xì)胞接觸傳遞炎癥因子[19]。最新發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)形成細(xì)胞中由Snail通路介導(dǎo)的纖溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor type 1, PAI1)產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)肥大細(xì)胞進(jìn)入真皮，促進(jìn)成纖維細(xì)胞黏附和纖維化[20]。與之相反，有實(shí)驗(yàn)證明肥大細(xì)胞為主釋放的組胺可與成纖維細(xì)胞膜的H1受體結(jié)合，通過抑制TGF-β1/Smad2通路，抑制成纖維細(xì)胞分化[21]。整體而言，肥大細(xì)胞脫顆粒釋放的細(xì)胞因子TGF-β仍是其促纖維化的主要作用。

3 中性粒細(xì)胞

中性粒細(xì)胞也是固有免疫中的重要一員，可保護(hù)機(jī)體免受細(xì)菌及其他內(nèi)源性危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(danger-associated molecular patterns, DAMPs)等破壞，通過吞噬作用、呼吸鏈、釋放活性氧(reactive oxygen species, ROS)及中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs)等發(fā)揮作用。在創(chuàng)傷或病原體入侵部位，中性粒細(xì)胞可釋放促炎細(xì)胞因子：IL-1α，IL-1β，腫瘤壞死因子(TNF)及IL-6增強(qiáng)防御[22]，“警報(bào)解除”后，中性粒細(xì)胞凋亡并被巨噬細(xì)胞清除，完成使命。目前，中性粒細(xì)胞在慢性炎癥及SSc纖維化中的作用并未完全闡明。中性粒細(xì)胞是活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要來源，當(dāng)局部聚集過量的ROS可損傷血管內(nèi)皮[23]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)血管內(nèi)皮持續(xù)損傷并激活聚集的血小板時(shí)，可釋放大量SSc微粒(SSc-microparticles)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞自噬，蛋白水解增加，同時(shí)釋放NETs發(fā)揮促炎作用[24]。NETs在肺和皮膚纖維化標(biāo)本中與α-SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞非常近，提示可能存在由中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的新的纖維化機(jī)制[25]。然而另一研究發(fā)現(xiàn)，提取SSc患者血漿和中性粒細(xì)胞中的外來體(exosome)-細(xì)胞衍生的囊泡，內(nèi)含各種DNA、RNA和蛋白質(zhì)，該外來體可抑制人真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[26]。由此，中性粒細(xì)胞在慢性炎癥中是否存在雙向調(diào)節(jié)作用仍值得研究。

4 樹突狀細(xì)胞

樹突狀細(xì)胞包括傳統(tǒng)樹突狀細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)。pDC是一種特殊類型的細(xì)胞，當(dāng)被激活時(shí)可以釋放大量干擾素(interferon, IFN)。SSc患者皮膚及肺部長期有pDC浸潤，通過產(chǎn)生CXCL4，激活TLR8受體，釋放INF-α促進(jìn)纖維化；在SSc小鼠模型中敲除pDC后可逆轉(zhuǎn)皮膚纖維化[27]。另一研究也發(fā)現(xiàn)在博來霉素誘導(dǎo)的硬皮病小鼠中敲除pDC后，其臨床評(píng)分、肺部病理評(píng)分、皮膚厚度和膠原蛋白含量均得到改善；pDC敲除的小鼠肺部改善與趨化因子、樹突狀細(xì)胞分化、促炎和纖維化相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)。該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)肺組織中浸潤B細(xì)胞、T細(xì)胞減少，可見pDC在SSc持續(xù)的免疫異常中發(fā)揮作用[28]。pDC如何被調(diào)控？已證實(shí)在SSc小鼠中TGF-β可趨化pDC、Th細(xì)胞及漿細(xì)胞等進(jìn)入皮膚，而TGF-β拮抗劑可明顯抑制該過程[29]。最新發(fā)現(xiàn)SSc患者皮損pDC中的微小RNA-618(miRNA-618)表達(dá)顯著升高，進(jìn)而增加INF分泌，成為SSc樣pDC表型[30]。此外，用DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I(TopoI)的肽段可誘導(dǎo)DC產(chǎn)生抗TopoI抗體，增加IL-17A和CXCL4促炎因子，導(dǎo)致皮膚和肺部的持續(xù)纖維化[31]，但pDC在抗原提呈、如何與T細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞相互作用等環(huán)節(jié)仍需更多研究。

5 Toll樣受體及其配體

Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是固有免疫中識(shí)別內(nèi)外源性危險(xiǎn)信號(hào)的一類重要蛋白分子，也是連接其與適應(yīng)性免疫的“橋梁”。目前人體中發(fā)現(xiàn)10種，在不同免疫細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的細(xì)胞膜或胞吞囊泡中表達(dá)，通過識(shí)別病原性配體激活胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路。其配體包括外源性病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)和DAMPs，DAMPs通常為細(xì)胞內(nèi)源性分子，當(dāng)外傷或應(yīng)激狀態(tài)下可釋放，觸發(fā)免疫應(yīng)答，包括內(nèi)源性Ca2+、ATP、自身核酸、熱休克蛋白、ECM片段及損傷的線粒體DNA等[32]。TLRs及其配體在感染、腫瘤、炎癥性疾病和自身免疫病等中均發(fā)揮重要作用，最近證實(shí)SSc患者中TLRs表達(dá)水平升高[33]。

在人體中，TLR1、2、4、5、6和10為細(xì)胞膜蛋白，在巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞或成纖維細(xì)胞等中有表達(dá)。目前，TLR4及其配體在SSc中的作用研究最為深入。SSc患者皮膚活檢中TLR4、胞外附屬的髓樣分化蛋白和CD14均明顯升高[34]?；蚯贸齌LR4后在博來霉素誘導(dǎo)C57BL/6小鼠和TLR4-/-TSK+硬皮小鼠(the tight skin mouse, TSK)模型中均免于纖維化誘導(dǎo)[35]。組織損傷時(shí)，內(nèi)源性DAMPs配體可被TLR4識(shí)別，近年來發(fā)現(xiàn)一些新的DAMPs及其作用方式。SSc患者皮膚和血清中的腱生蛋白C(tenascin-C)增加，該細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的FBG區(qū)域可與巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞上的TLR4受體結(jié)合，激活胞內(nèi)MyD88介導(dǎo)的信號(hào)通路，促進(jìn)α-SMA和膠原蛋白生成[36]。同樣，外傷后暴露的纖連蛋白EDA區(qū)域在SSc患者皮膚和血清中也明顯增加，通過激活并釋放TGF-β1，進(jìn)而促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化及分泌ECM[37]。近期體外研究證實(shí)，細(xì)胞外線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)可促使成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA，成為一種新的TLRs配體[38]。此外，TLR2在SSc患者成纖維細(xì)胞中表達(dá)也顯著升高，通過識(shí)別血清淀粉樣蛋白A，促使胞內(nèi)促纖維化細(xì)胞因子IL-6釋放[39]。

細(xì)胞內(nèi)TLRs包括TLR3、7、8和9，這組蛋白可敏感監(jiān)測病毒來源的核酸片段。TLR3經(jīng)IFN1刺激后分泌增加，進(jìn)一步增加IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)，招募更多巨噬細(xì)胞進(jìn)入組織中[40]，而后者是固有免疫中重要的調(diào)節(jié)者。TLR7/8是單鏈RNA(ssRNA)的受體，被激活后通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP1)的分泌，進(jìn)而抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，促進(jìn)皮膚纖維化。TLR8還可通過增加樹突狀細(xì)胞分泌的CXCL4誘導(dǎo)纖維化[27]。TLR9在SSc皮膚樣本的肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)也升高，可識(shí)別雙鏈DNA(dsDNA)的非甲基化CpG序列，通過MyD88通路促進(jìn)TGF-β大量分泌，促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化發(fā)揮作用[41]。隨著TLRs在SSc發(fā)病機(jī)制中的研究，目前針對(duì)阻斷DAMPs配體、TLRs受體(TLR2、4、7、8等)及下游信號(hào)通路的小分子靶向藥物成為治療本病的熱點(diǎn)之一[33]。

6 相關(guān)細(xì)胞因子

SSc炎癥中有很多細(xì)胞因子參與，在皮膚、肺部及血清中均有不同程度升高，目前針對(duì)IL-4、IL-6 和TGF-β的研究較為深入。研究發(fā)現(xiàn)IL-4可促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白及其他ECM，IL-4抗體可抑制TSK硬皮小鼠纖維化；同樣的，敲除TSK小鼠的IL-4受體也可見纖維化減輕[42]。TGF-β是成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞中最重要的細(xì)胞因子，它可以激活TGF-β/Smad通路，促進(jìn)膠原蛋白I、III型、纖連蛋白等ECM蛋白合成；同時(shí)它可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞自分泌TGF-β，放大纖維化過程[43]。TGF-β還可通過MAPK、JNK和ERK1等非Smad通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[44]。IL-6在SSc早期和晚期均發(fā)揮作用，IL-6敲除的小鼠纖維化作用明顯減弱；IL-6及其受體可通過IL-6/STAT3通路促進(jìn)膠原蛋白分泌[44]。目前針對(duì)IL-6受體的托珠單抗(tocilizumab)已發(fā)現(xiàn)可有效改善SSc患者皮膚硬化，有望成為新的治療藥物[45]。

7 總結(jié)

SSc發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，大量證據(jù)表明固有免疫對(duì)于啟動(dòng)免疫系統(tǒng)至關(guān)重要，多種細(xì)胞及分子參與了病理過程中血管損傷、免疫細(xì)胞激活及纖維化的過程。其中，TLRs及其配體、巨噬細(xì)胞發(fā)揮重要作用，其與適應(yīng)性免疫的T細(xì)胞、B細(xì)胞相互作用，并有其他細(xì)胞因子、趨化因子等參與，最終調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞分化、及ECM合成及降解的平衡。未來對(duì)于各類固有免疫細(xì)胞的病理學(xué)作用的精細(xì)研究及針對(duì)特定細(xì)胞亞群或分子研制相應(yīng)的靶點(diǎn)研究，將有助于SSc臨床評(píng)估及新藥物研發(fā)。