杜鵑紅山茶愈傷組織誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

李先民 卜朝陽(yáng) 李春牛 崔學(xué)強(qiáng) 黃莉萍 盧家仕 黃展文 蘇群

摘要：為明確不同處理對(duì)杜鵑紅山茶愈傷組織誘導(dǎo)的影響，以8年生杜鵑紅山茶為材料，研究不同外植體材料、滅菌方式、培養(yǎng)基種類、激素種類及配比、活性炭濃度等對(duì)杜鵑紅山茶愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：（1）在相同的滅菌方式下，葉片外植體愈傷誘導(dǎo)率均明顯高于葉柄外植體和花瓣外植體。采用0.1% HgCl2滅菌5 min，葉片外植體愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá)48.89%。（2）MS培養(yǎng)基是最適合葉片和花瓣外植體愈傷組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基，葉片和花瓣在該培養(yǎng)基中的愈傷誘導(dǎo)率均最高，分別達(dá)42.12%、37.62%。（3）培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA與GA3對(duì)葉片外植體愈傷誘導(dǎo)率具有顯著影響，低濃度的6-BA和高濃度的GA3有利于提高愈傷誘導(dǎo)率，愈傷誘導(dǎo)率最高的激素組合為1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+0.6 mg/L GA3，誘導(dǎo)率達(dá)61.67。（4）外植體褐化率隨添加活性炭濃度的增加呈逐漸降低的趨勢(shì)，添加活性炭濃度為1.2 g/L時(shí)，葉片和花瓣外植體褐化率最低且愈傷誘導(dǎo)率處于最高水平。

關(guān)鍵詞：杜鵑紅山茶;愈傷組織誘導(dǎo);外植體;滅菌;培養(yǎng)基;激素

中圖分類號(hào)：S685.140.4+3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）23-0061-05

收稿日期：2021-06-22

基金項(xiàng)目：廣西科技基地和人才專項(xiàng)（編號(hào)：桂科AD18281004）;廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)（編號(hào)：桂農(nóng)科2017YM47）;廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技先鋒隊(duì)專項(xiàng)（編號(hào)：桂農(nóng)科JZ2020013）;廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金（編號(hào)：桂農(nóng)科2021JM29）。

作者簡(jiǎn)介：李先民（1988—），男，廣西南寧人，碩士，助理研究員，主要從事觀賞植物栽培與育種研究。E-mail：lixm7406@126.com。

通信作者：李春牛，碩士，副研究員，主要從事觀賞植物選育及栽培研究。E-mail：lichunniu@126.com。

杜鵑紅山茶（Camellia azalea）為山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）常綠灌木或小喬木，是中國(guó)特有珍稀瀕危物種，現(xiàn)存野生植株僅1 000多株，僅在廣東省陽(yáng)春市鵝凰嶂省級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)一個(gè)狹窄的河谷兩旁有零星分布[1]，已被《中國(guó)物種紅色名錄》列為極危種[2]。杜鵑紅山茶花期長(zhǎng)，夏、秋2季為盛花期，在適宜的栽培條件下一年四季都可以開(kāi)花，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能真正全年開(kāi)花的山茶物種，彌補(bǔ)了山茶屬夏季和秋季不開(kāi)花的空白[3]。杜鵑紅山茶開(kāi)花稠密、花朵大而艷紅，葉形奇特、葉厚革質(zhì)，植株緊湊，病蟲害少，適應(yīng)性強(qiáng)，在園林與觀賞園藝方面具有廣闊的應(yīng)用前景[4];同時(shí)，杜鵑紅山茶是培育雜交四季茶花優(yōu)良品種的寶貴親本材料，具有極高的科研價(jià)值[5]。

近年來(lái)，隨著杜鵑紅山茶知名度及市場(chǎng)需求與日俱增，國(guó)內(nèi)外關(guān)于杜鵑紅山茶繁殖技術(shù)的研究也逐漸增多，主要集中在扦插繁殖[6]、嫁接繁殖[7]、播種育苗[8]方面，有關(guān)組織培養(yǎng)的研究較少。利用組織培養(yǎng)，可以生產(chǎn)大量的優(yōu)良無(wú)性系[9]，將植物組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于杜鵑紅山茶的快速繁殖，對(duì)種質(zhì)資源保護(hù)，豐富園林植物多樣性，緩解杜鵑紅山茶苗木供應(yīng)緊張的狀況，為科研提供優(yōu)良無(wú)性系，皆具有十分重要的意義。本研究以杜鵑紅山茶葉片、葉柄及花瓣作為外植體，研究不同外植體材料、滅菌方式、培養(yǎng)基種類、激素種類及配比、活性炭濃度等對(duì)杜鵑紅山茶愈傷組織誘導(dǎo)的影響，探索提高杜鵑紅山茶愈傷組織誘導(dǎo)效果的技術(shù)方法，旨在為杜鵑紅山茶組織培養(yǎng)提供理論依據(jù)，以期為其他同類型林木組織培養(yǎng)技術(shù)的研究提供經(jīng)驗(yàn)和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所組培中心。組織培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，光照度為3 000 lx，光照時(shí)長(zhǎng)為12 h/d。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研發(fā)與推廣中心山茶資源圃生長(zhǎng)健壯的8～9年生杜鵑紅山茶植株，以成熟葉片、成熟葉片的葉柄、花瓣（選擇花苞，剝?nèi)ネ獠渴軗p花瓣，采用由外至內(nèi)第3～4層花瓣）3種材料作為外植體。在碟子上將葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的塊狀，葉柄剪成約0.5 cm的小段，將花瓣剪成0.5 cm×0.5 cm的塊狀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同外植體及滅菌方式 試驗(yàn)于2020年6月進(jìn)行，以葉片、葉柄、花瓣作為外植體材料，先用75%乙醇棉球擦洗外植體表面，飽和洗衣粉水洗滌，再用流水沖洗15～20 min，在超凈工作臺(tái)上用75%的乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3次后，進(jìn)行滅菌處理，滅菌劑采用0.1% HgCl2（氯化汞）或10% NaClO（次氯酸鈉），0.1% HgCl2設(shè)置5、7、10 min 3個(gè)滅菌時(shí)間，10% NaClO設(shè)置10、15、20 min 3個(gè)滅菌時(shí)間，共6個(gè)滅菌處理，滅菌處理后用無(wú)菌水清洗5～6次。處理完成接種于MS+6-BA（1.0 mg/L）+NAA（1.0 mg/L）培養(yǎng)基中，各處理接種15瓶，每瓶3個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)外植體愈傷誘導(dǎo)率及污染率。

1.3.2 不同外植體及培養(yǎng)基 試驗(yàn)于2020年6月進(jìn)行，以葉片、花瓣作為外植體材料，先用75%乙醇棉球擦洗表面，飽和洗衣粉水洗滌，再用流水沖洗15～20 min，在超凈工作臺(tái)上用75%的乙醇浸泡 30 s ，無(wú)菌水沖洗3次后，轉(zhuǎn)入0.1% HgCl2中浸泡5 min，無(wú)菌水沖洗5～6次。在碟子上將葉柄剪成約0.5 cm的小段，葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的塊狀，花瓣除去最外層后，將花瓣剪成0.5 cm×0.5 cm 的塊狀，分別接入MS培養(yǎng)基（青島海博）、B5培養(yǎng)基（青島海博）、WPM培養(yǎng)基（青島海博）及SH培養(yǎng)基（北京酷來(lái)搏）中，每種培養(yǎng)基均添加 1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。各處理接種15瓶，每瓶3個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)外植體愈傷誘導(dǎo)率及褐化率。

1.3.3 不同激素處理 試驗(yàn)于2020年6月進(jìn)行，以葉片作為外植體材料，按“1.3.2”節(jié)的方法滅菌，誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本成分，添加3%蔗糖、0.4%瓊脂，同時(shí)添加不同種類和濃度的激素，采用 L9（34） 正交設(shè)計(jì)方案（表1），設(shè)置6-BA濃度、NAA濃度及GA3濃度等3個(gè)因素，每個(gè)因素分別設(shè)3個(gè)水平，共9個(gè)激素組合處理，pH值5.8。各激素組合接種10瓶，每瓶2個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)外植體愈傷誘導(dǎo)率。

1.3.4 活性炭防褐化試驗(yàn) 試驗(yàn)于2020年6月進(jìn)行，以葉片、葉柄、花瓣作為外植體材料，按“1.3.2”節(jié)的方法滅菌，接入不同濃度處理的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基為MS+6-BA（1.0 mg/L）+ NAA（1.0 mg/L）誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加活性炭濃度設(shè)置4個(gè)水平，即0、0.4、0.6、1.2 g/L。每種處理接種15瓶，每瓶3個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率和褐化率。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)（Duncans新復(fù)極差法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體及滅菌方式對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同外植體及滅菌方式對(duì)杜鵑紅山茶愈傷組織誘導(dǎo)率及污染率的影響見(jiàn)表2，不同處理間杜鵑紅山茶外植體愈傷誘導(dǎo)率及褐化率的差異均達(dá)到了顯著水平。選擇葉片作為外植體，采用0.1% HgCl2滅菌5 min，外植體誘導(dǎo)愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá)48.89%，與選擇葉片作為外植體的其他處理以及T13、T14、T16相比差異不顯著（P>0.05），但顯著高于其他處理。選擇葉片作為外植體，在相同的滅菌方式下，其愈傷誘導(dǎo)率均明顯高于采用葉柄和花瓣作為外植體。選擇葉柄作為外植體，采用10% NaClO滅菌10 min，外植體褐化率最高，達(dá)61.90%，與選擇葉柄作為外植體的其他處理以及T4相比差異不顯著（P>0.05），但顯著高于其他處理。選擇葉柄作為外植體，在相同的滅菌方式下，其褐化率均明顯高于采用葉片和花瓣作為外植體。

2.2 不同外植體及培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同外植體及培養(yǎng)基對(duì)杜鵑紅山茶愈傷組織誘導(dǎo)率及褐化率的影響見(jiàn)表3，不同處理間杜鵑紅山茶外植體愈傷誘導(dǎo)率及褐化率的差異均達(dá)到了顯著水平（P<0.05）。各處理中，選擇葉片作為外植體，接種于MS培養(yǎng)基上，愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá)4212%，愈傷誘導(dǎo)率顯著高于接種于其他培養(yǎng)基上的葉片，但與花瓣接種于MS、B5及SH培養(yǎng)基相比差異不顯著。選擇葉片作為外植體，接種于B5培養(yǎng)基上，外植體褐化率最高，達(dá)68.75%，顯著高于其他處理，其他處理間褐化率差異不顯著，褐化率最低的處理為T3，即選擇葉片作為外植體，接種于WPM培養(yǎng)基上，褐化率為31.67%。

2.3 不同激素處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表4可以看出，愈傷誘導(dǎo)率最高的處理為激素組合3，即1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+0.6 mg/L GA3，發(fā)芽率達(dá)61.67%，與組合5相比愈傷誘導(dǎo)率差異不顯著，顯著高于其他處理組合（P<0.05）。

方差分析（表5）表明，6-BA濃度與GA3濃度對(duì)杜鵑紅山茶葉片愈傷誘導(dǎo)率的影響達(dá)到顯著水平（P<0.05）。從圖1可以看出，隨著6-BA濃度的增加，愈傷誘導(dǎo)率呈逐漸降低的趨勢(shì);隨著GA3濃度的增加，愈傷誘導(dǎo)率呈逐漸升高的趨勢(shì)。NAA濃度對(duì)杜鵑紅山茶愈傷誘導(dǎo)率的影響不顯著（P>0.05），但較高濃度的NAA可提高葉片愈傷誘導(dǎo)率。極差分析結(jié)果表明，本試驗(yàn)設(shè)置的3個(gè)因素對(duì)發(fā)芽率的影響由大到小排列為GA3濃度>6-BA濃度>IAA濃度，就愈傷誘導(dǎo)率而言A1B3C3組合為最佳組合，即采用添加了1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+0.6 mg/L GA3的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織效果最佳，該組合與實(shí)際觀測(cè)的最優(yōu)組合（處理組合3）一致。

2.4 活性炭對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及防褐化的影響

不同活性炭濃度對(duì)杜鵑紅山茶愈傷組織誘導(dǎo)率及褐化率的影響見(jiàn)表6，不同處理間杜鵑紅山茶外植體愈傷誘導(dǎo)率及褐化率的差異不顯著。選擇葉片作為外植體，添加活性炭濃度為1.2 g/L時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率最高且褐化率最低，分別為40.39%、2056%，但愈傷誘導(dǎo)率和褐化率與其他處理相比差異不顯著。選擇葉片或花瓣作為外植體，隨著添加活性炭濃度的增加，外植體褐化率均呈逐漸降低的趨勢(shì)。

3 討論與結(jié)論

外植體類型會(huì)影響愈傷的誘導(dǎo)[10]，同種植物不同部位的組織，其再生能力存在較大差別，因此對(duì)外植體的篩選也是組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù)。本試驗(yàn)中，選擇杜鵑紅山茶葉片和花瓣作為外植體，在相同的滅菌方式下，其愈傷誘導(dǎo)率均高于葉柄，褐化率均低于葉柄，這可能是由于葉柄基部抱莖，夾帶有較多雜菌，且外形不規(guī)整，不易被消毒清洗徹底，結(jié)合實(shí)際觀察，葉柄作為外植體接種后褐化率較高，導(dǎo)致其難以形成愈傷組織。同時(shí)，考慮組織培養(yǎng)生產(chǎn)的無(wú)菌葉片數(shù)量上要多于葉柄及花瓣，因此，葉片更適合作為外植體加以使用。本試驗(yàn)中，隨著滅菌劑滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片及花瓣的愈傷誘導(dǎo)率及褐化率均逐漸降低，這可能是因?yàn)橄緯r(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)可以降低污染，但是會(huì)傷害到外植體組織，導(dǎo)致外植體死亡率升高[11]。結(jié)合實(shí)際觀察，選擇葉片作為外植體，采用0.1% HgCl2滅菌5 min，出現(xiàn)愈傷組織時(shí)間較快，最有利于愈傷組織誘導(dǎo)。

本研究表明，培養(yǎng)基的種類對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率及愈傷組織的質(zhì)量存在顯著影響，這與不同培養(yǎng)基的組成差異較大，對(duì)杜鵑紅山茶外植體細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生了不同的影響有關(guān)[12]。本試驗(yàn)中，葉片外植體接種于MS培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)率最高，葉片及花瓣外植體接種于MS培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)率均高于接種于其他3種培養(yǎng)基。結(jié)合實(shí)際觀察，就葉片而言，接種于MS培養(yǎng)基較其他培養(yǎng)基形成愈傷組織快，數(shù)量多，質(zhì)地均勻致密，為黃綠色，愈傷組織質(zhì)量較好，生長(zhǎng)能力更強(qiáng)，更接近與胚性愈傷組織，說(shuō)明MS培養(yǎng)基能充分提供杜鵑紅山茶愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)所需養(yǎng)分，是最適合杜鵑紅山茶愈傷組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基。

植物激素是植物愈傷組織誘導(dǎo)分化的關(guān)鍵性因素[13]，外源激素起著傳遞遺傳物質(zhì)的脫分化、再分化等發(fā)育信號(hào)的作用[14]，激素種類及濃度是影響胚性愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵因子之一[15-16]，本試驗(yàn)選擇的3種激素中，6-BA濃度與GA3濃度對(duì)杜鵑紅山茶葉片愈傷誘導(dǎo)率影響顯著，NAA濃度對(duì)杜鵑紅山茶愈傷誘導(dǎo)率的影響不顯著;隨著6-BA濃度的增加，愈傷誘導(dǎo)率呈逐漸降低的趨勢(shì)，隨著GA3濃度的增加，愈傷誘導(dǎo)率呈逐漸升高的趨勢(shì)?？梢哉J(rèn)為杜鵑紅山茶外植體在誘導(dǎo)愈傷組織階段對(duì)6-BA濃度與GA3濃度反應(yīng)敏感，外植體要求較低的6-BA濃度水平及較高的GA3濃度水平。試驗(yàn)通過(guò)多重比較得出理論上最佳組合為A1B3C3，與實(shí)際觀測(cè)的最優(yōu)組合一致，在今后的試驗(yàn)中可以以這一組合為參考，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步調(diào)整細(xì)化6-BA及GA3的配比，以達(dá)到更為理想的愈傷組織誘導(dǎo)效果。

山茶科植物中酚類物質(zhì)含量較高[17]，當(dāng)酚類化合物含量高時(shí)，木質(zhì)素、單寧或色素形成就多，酚類物質(zhì)易經(jīng)氧化形成醌類物質(zhì)，導(dǎo)致褐變的發(fā)生[18]，褐化現(xiàn)象是制約愈傷組織生長(zhǎng)、增殖和分化的主要因素[19]。在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的防褐化劑可有效地抑制褐化[20]。本試驗(yàn)中，隨著添加活性炭濃度的增加，外植體褐化率呈逐漸降低的趨勢(shì)，與呂宗友等的研究結(jié)果[21-22]一致，說(shuō)明在培養(yǎng)基中添加適宜濃度活性炭對(duì)外植體褐化有較好的控制效果，且能有效提高愈傷誘導(dǎo)率，這可能是采用活性炭等酚類吸收劑從根源上阻斷了褐化這一系列化學(xué)反應(yīng)，本試驗(yàn)中添加活性炭濃度為1.2 g/L時(shí)，葉片和花瓣外植體褐化率最低且愈傷誘導(dǎo)率處于最高水平，是最為適合的活性炭添加濃度。

杜鵑紅山茶愈傷組織誘導(dǎo)宜選擇葉片作為外植體。就葉片外植體而言，采用0.1% HgCl2滅菌 5 min 滅菌效果最佳;接種于MS培養(yǎng)基上形成愈傷組織快，愈傷組織質(zhì)量好;在MS培養(yǎng)基中添加低濃度的6-BA及高濃度的GA3有利于提高愈傷誘導(dǎo)率，添加1.2 g/L活性炭，能有效防止外植體褐化。

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