柯來(lái)順 涂燕芬 林慶金 劉華斌 肖雪蓮
摘要?目的:探討牛蒡子苷元對(duì)阿爾茨海默病體外模型β淀粉樣肽25-35(Aβ25-35)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡和氧化損傷的影響及機(jī)制。方法:將PC12細(xì)胞分成對(duì)照組、模型組(Aβ25-35處理)、ATG-L組(2 μmol/L牛蒡子苷元和Aβ25-35處理)、ATG-M組(4 μmol/L牛蒡子苷元和Aβ25-35處理)、ATG-H組(8 μmol/L牛蒡子苷元和Aβ25-35處理)、ATG-H+LY29400組(AKT信號(hào)抑制劑LY29400、8 μmol/L牛蒡子苷元和Aβ25-35處理)。以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化,黃嘌呤氧化法檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)含量,Western Blotting法檢測(cè)磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)蛋白表達(dá)。結(jié)果:ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組p-AKT/AKT表達(dá)量以及SOD含量高于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組細(xì)胞凋亡率低于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);ATG-H+LY29400組p-AKT/AKT表達(dá)量以及SOD含量低于ATG-H組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);ATG-H+LY29400組細(xì)胞凋亡率高于ATG-H組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論:牛蒡子苷元通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)通路抑制阿爾茨海默病體外模型Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡和氧化損傷。
關(guān)鍵詞?牛蒡子苷元;PC12細(xì)胞;阿爾茨海默病;β淀粉樣肽25-35;AKT信號(hào);凋亡;氧化損傷;增殖
Abstract?Objective:To investigate the effect and its mechanis of arctigenin on the apoptosis and oxidative damage of PC12 cells induced by amyloid beta 25-35(Aβ25-35)in an in vitro model of Alzheimer′s disease.Methods:PC12 cells were divided into a control group,a model group (Aβ25-35 treatment),a ATG-L group (2 μmol/L arctigenin and Aβ25-35 treatment),a ATG-M group (4 μmol/L arctigenin and Aβ25-35 treatment),a ATG-H group (8 μmol/L arctigenin and Aβ25-35 treatment),and a ATG-H+LY29400 group (AKT signal inhibitor LY29400,8 μmol/L arctigenin and Aβ25-35 treatment).Flow cytometry was used to detect cell apoptosis changes.Xanthine oxidation method was used to detect superoxide dismutase (SOD) content.The expression of Phosphorylated protein kinase B (p-AKT) protein in cells was detected with Western Blotting method.Results:P-AKT/AKT expression and SOD content in the ATG-L,ATG-M,ATG-H group were higher than those in the Model group,and the differences were statistically significant (Ps<0.05); The apoptosis rate of the ATG-L,ATG-M,ATG-H group were lower than those of the Model group,and the difference was statistically significant (Ps<0.05); The p-AKT/AKT,SOD levels in the ATG-H+LY29400 group were lower than those in the ATG-L,ATG-M and ATG-H group,and the differences were statistically significant (Ps<0.05); The apoptosis rate in the ATG-H+LY29400 group were higher than those in the ATG-H group,and the differences were statistically significant (Ps<0.05).Conclusion:Arctigenin can inhibit the apoptosis and oxidative damage of PC12 cells induced by Aβ25-35 in an in vitro model of Alzheimer′s disease by activating the AKT signaling pathway.
Keywords?Arctigenin; PC12 cells; Alzheimer′s disease; Aβ25-35; AKT signal; Apoptosis; Oxidative damage; Proliferation
中圖分類(lèi)號(hào):R285;R745.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2021.22.010
阿爾茨海默病是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病,也是常見(jiàn)的老年疾病之一,對(duì)于阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制,有氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)、瀑布假說(shuō)、膽堿能學(xué)說(shuō)、瀑布假說(shuō)等多種學(xué)說(shuō)[1]。β淀粉樣肽(Amyloid Beta,Aβ)沉積誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷,促進(jìn)神經(jīng)功能障礙[2]。牛蒡子苷元是從中藥牛蒡子中提取出來(lái)的活性成分,具有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等作用,對(duì)腫瘤、糖尿病等有治療功效[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn),牛蒡子苷元可改善神經(jīng)功能,牛蒡子苷元處理可改善乙醇誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷,減少細(xì)胞凋亡[5]。牛蒡子苷元治療后的阿爾茨海默病小鼠模型記憶功能明顯改善,衰老斑塊減少[6]。目前尚未發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元在阿爾茨海默病體外PC12細(xì)胞模型中的作用研究。已經(jīng)有研究表明,牛蒡子苷元發(fā)揮作用與信號(hào)通路如AKT等有關(guān)。AKT信號(hào)在組織中廣泛表達(dá),具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、自噬、炎癥、氧化平衡等作用[7-8]。有研究顯示,阿爾茨海默病中AKT信號(hào)通路激活水平降低,而激活A(yù)KT可改善神經(jīng)損傷[9]。本實(shí)驗(yàn)以Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞,體外構(gòu)建阿爾茨海默病細(xì)胞模型,探討牛蒡子苷元對(duì)阿爾茨海默病細(xì)胞模型凋亡和氧化損傷的影響及機(jī)制,為牛蒡子苷元治療阿爾茨海默病的臨床使用提供參考。
1?材料與方法
1.1?材料
1.1.1?細(xì)胞?PC12細(xì)胞,貨號(hào)iCell-r026,由賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司提供。
1.1.2?藥物?牛蒡子苷元,規(guī)格:100 mg,批號(hào):D297801,純度:≥98.0%,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源平臺(tái)生產(chǎn)。
1.1.3?試劑與儀器?AKT抗體(Abcam公司,美國(guó),貨號(hào):ab8805),Bax抗體(Abcam公司,美國(guó),貨號(hào):ab32503);Bcl-2抗體(Santa Cruz Biotechnology公司,美國(guó),貨號(hào):sc-7382),p-AKT抗體(Cell Signaling Technology公司,美國(guó),貨號(hào):9271),Aβ25-35(Sigma公司,美國(guó),貨號(hào):A4559-250UG);SOD檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):BC0170);GSH-Px檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司,貨號(hào):A005-1-2);MDA檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所,貨號(hào):S0131S);AKT信號(hào)抑制劑LY29400(medchemexpress公司,美國(guó),貨號(hào):LY29400),酶標(biāo)儀(北京悅昌行科技有限公司,型號(hào):SpectraMax iD5),流式細(xì)胞儀(貝克曼庫(kù)爾特公司,美國(guó),型號(hào):CytoFLEX),倒置顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司,型號(hào):XSP-11CD)。
1.2?方法
1.2.1?分組與給藥方法?PC12細(xì)胞分成對(duì)照組、模型組、ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組、ATG-H+LY29400組,分組處理方法如下:1)對(duì)照組:按照常規(guī)方法培養(yǎng);2)模型組:用含有20 μmol/L的Aβ25-35細(xì)胞培養(yǎng)液刺激;3)ATG-L組:用含有2 μmol/L的牛蒡子苷元和20 μmol/L的Aβ25-35細(xì)胞培養(yǎng)液處理;4)ATG-M組:用含有4 μmol/L的牛蒡子苷元和20 μmol/L的Aβ25-35細(xì)胞培養(yǎng)液處理;5)ATG-H組:用含有8 μmol/L的牛蒡子苷元和20 μmol/L的Aβ25-35細(xì)胞培養(yǎng)液處理;6)ATG-H+LY29400組:用含有10 μmol/L的AKT信號(hào)抑制劑LY29400、8 μmol/L的牛蒡子苷元和20 μmol/L的Aβ25-35細(xì)胞培養(yǎng)液處理。
1.2.2?檢測(cè)指標(biāo)與方法?1)CCK-8實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞增殖[10]:在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種PC12細(xì)胞,接種密度為每孔4 000個(gè)細(xì)胞/100 μL,細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜以后,分別在細(xì)胞中添加牛蒡子苷元,使其終濃度為0、2、4、8、16、32 μmol/L,或按照1.2.1中方法分組,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,在孔內(nèi)添加CCK-8,每個(gè)孔中添加10 μL,在37 ℃繼續(xù)反應(yīng)3 h。調(diào)整酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為450 nm,檢測(cè)每個(gè)孔的OD值。OD值表示細(xì)胞增殖活性。2)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡[11]:對(duì)照組、模型組、ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組、ATG-H+LY29400組細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,在細(xì)胞中加入PBS洗滌2次,然后添加Binding Buffer配制成單細(xì)胞懸浮液,吸取5 μL的PI和Annexin V-FITC添加到細(xì)胞內(nèi),放在室溫條件下結(jié)合15 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡變化。3)Western Blotting方法檢測(cè)Bax、Bcl-2、p-AKT蛋白表達(dá)[12]:對(duì)照組、模型組、ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組、ATG-H+LY29400組細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后,每個(gè)檢測(cè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,在細(xì)胞中加入PBS溶液洗滌2次,添加含PMSF的RIPA,在冰上充分裂解。轉(zhuǎn)移至離心管中,4 ℃,10 000×g離心10 min。蛋白存在于上清液中。蛋白濃度測(cè)定用常規(guī)BCA方法,步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在蛋白樣品中加入5×Loading Buffer,于100 ℃煮沸5 min。本實(shí)驗(yàn)選擇10%分離膠、5%濃縮膠進(jìn)行電泳。每個(gè)泳道內(nèi)添加30 μg蛋白樣品。首先以70 V的電壓電泳,肉眼可見(jiàn)藍(lán)色染料電泳到分離膠時(shí),此時(shí)將電壓調(diào)整為100 V,等到藍(lán)色染料已經(jīng)完全進(jìn)入玻璃板底部邊緣1 mm處,關(guān)閉電源。將凝膠取出,切下分離膠。根據(jù)蛋白分子量大小裁剪NC膜。在冰上,100 V電壓條件下轉(zhuǎn)膜2 h。NC膜放在封閉液中,轉(zhuǎn)移到37 ℃條件下結(jié)合1 h。然后將NC膜放在一抗溶液中,Bax、Bcl-2一抗按照1∶800稀釋?zhuān)琾-AKT一抗按照1∶600稀釋?zhuān)珹KT一抗按照1∶1 000稀釋?zhuān)? ℃過(guò)夜反應(yīng)。把NC膜放在1∶2 000稀釋以后的二抗中,轉(zhuǎn)移到37 ℃環(huán)境中結(jié)合1 h。滴加ECL顯色試劑。以GAPDH作為參照,根據(jù)條帶的灰度值對(duì)目的蛋白表達(dá)量進(jìn)行半定量分析,目的蛋白表達(dá)量=目的條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。4)SOD、GSH-Px、MDA含量檢測(cè)[13]:對(duì)照組、模型組、ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組、ATG-H+LY29400組細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后,以SOD檢測(cè)試劑盒(黃嘌呤氧化法)、GSH-Px檢測(cè)試劑盒(比色)。
1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法?采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,數(shù)據(jù)均滿(mǎn)足正態(tài)分布及方差齊性,2組比較用t檢驗(yàn),多組差異比較用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2?結(jié)果
2.1?牛蒡子苷元對(duì)PC12細(xì)胞增殖影響?與0 μmol/L比較,2、4、8 μmol/L牛蒡子苷元處理后的PC12細(xì)胞增殖活性沒(méi)有變化,而16、32 μmol/L牛蒡子苷元處理后的PC12細(xì)胞增殖活性降低。見(jiàn)表1。選擇對(duì)PC12細(xì)胞增殖毒性無(wú)影響的2、4、8 μmol/L牛蒡子苷元做后續(xù)研究。
2.2?牛蒡子苷元對(duì)阿爾茨海默病PC12細(xì)胞增殖和凋亡的影響?模型組PC12細(xì)胞增殖活性降低,細(xì)胞凋亡率升高,細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)增多,Bcl-2蛋白表達(dá)減少,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組PC12細(xì)胞增殖活性逐漸升高,細(xì)胞凋亡率逐漸降低,細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)逐漸減少,Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸增多,與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1,表2。
2.3?牛蒡子苷元對(duì)阿爾茨海默病PC12細(xì)胞氧化損傷的影響?模型組PC12細(xì)胞SOD、GSH-Px含量降低,MDA含量升高,與對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組PC12細(xì)胞的SOD、GSH-Px含量逐漸升高,MDA含量逐漸降低,與模型組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表3。
2.4?牛蒡子苷元對(duì)阿爾茨海默病PC12細(xì)胞中AKT信號(hào)通路的激活作用?模型組PC12細(xì)胞p-AKT/AKT表達(dá)量降低,與對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。ATG-L組、ATG-M組、ATG-H組PC12細(xì)胞p-AKT/AKT表達(dá)量逐漸升高,與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)圖2和表4。
2.5?AKT信號(hào)通路抑制劑對(duì)牛蒡子苷元作用阿爾茨海默病PC12細(xì)胞增殖、凋亡和氧化損傷的影響?ATG-H+LY29400組PC12細(xì)胞增殖活性降低,細(xì)胞凋亡率升高,細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)增多,Bcl-2蛋白表達(dá)減少,p-AKT/AKT表達(dá)量減少,SOD、GSH-Px含量降低,MDA含量升高,與ATG-H組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3,表5。
3?討論
阿爾茨海默病占全部老年癡呆的60%以上,記憶減退、人格變性、認(rèn)知障礙等是阿爾茨海默病的臨床表現(xiàn)。Aβ沉積產(chǎn)生老年斑、神經(jīng)元丟失是阿爾茨海默病的典型病理特征,Aβ可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,造成神經(jīng)功能障礙[2]。細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激平衡與抗氧化酶活性有關(guān),GSH-Px、SOD是常見(jiàn)的抗氧化酶,其活性降低可以誘導(dǎo)氧自由基積累,誘導(dǎo)脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化,產(chǎn)生MDA,造成氧化損傷[14]。氧自由基還可以激活細(xì)胞凋亡途徑,加快細(xì)胞凋亡[15]。Bax和Bcl-2是Bcl-2蛋白家族成員,二者表達(dá)改變與細(xì)胞凋亡水平相關(guān)[16]。Bax在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用,Bcl-2在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮抑制作用,Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)變化共同影響細(xì)胞凋亡[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Aβ25-35處理后的PC12細(xì)胞凋亡率升高,細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)增多,Bcl-2蛋白表達(dá)減少,細(xì)胞增殖活性下降,GSH-Px、SOD含量降低,MDA含量升高,Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷,提示成功構(gòu)建了阿爾茨海默病體外細(xì)胞模型。
牛蒡子苷元是一種木脂素類(lèi)化合物,可用于治療麻疹、風(fēng)熱感冒,現(xiàn)代藥理學(xué)還證明牛蒡子苷元具有降血糖、抗菌、抗腫瘤等功效[18]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),牛蒡子苷元對(duì)阿爾茨海默病也具有改善功效,牛蒡子苷元治療后的阿爾茨海默病小鼠神經(jīng)記憶功能明顯改善[6-7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,牛蒡子苷元處理后的阿爾茨海默病PC12細(xì)胞增殖活性升高,細(xì)胞凋亡減少,細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)減少,Bcl-2蛋白表達(dá)增多,GSH-Px、SOD含量升高,MDA含量降低,牛蒡子苷元改善阿爾茨海默病PC12細(xì)胞氧化損傷,減少細(xì)胞凋亡,我們首次在體外阿爾茨海默病細(xì)胞模型中證明了牛蒡子苷元的作用,并且說(shuō)明牛蒡子苷元可能是阿爾茨海默病的治療藥物。
牛蒡子苷元的藥理學(xué)作用廣泛,但其分子作用機(jī)制尚不明確。研究表明,牛蒡子苷元可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路發(fā)揮作用。牛蒡子苷元在改善阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的同時(shí)可促進(jìn)AKT磷酸化,牛蒡子苷元作用機(jī)制可能與AKT信號(hào)通路有關(guān)[7]。AKT是一個(gè)具有廣泛作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、衰老、自噬等過(guò)程[19-21]。已知AKT信號(hào)在阿爾茨海默病中激活水平降低,而激活A(yù)KT信號(hào)可改善阿爾茨海默病進(jìn)展[22]。本實(shí)驗(yàn)表明,牛蒡子苷元提高了阿爾茨海默病PC12細(xì)胞中p-AKT磷酸化水平,并且AKT信號(hào)抑制劑可逆轉(zhuǎn)牛蒡子苷元對(duì)阿爾茨海默病PC12細(xì)胞增殖、凋亡和氧化損傷的作用,這進(jìn)一步驗(yàn)證了牛蒡子苷元可通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)影響阿爾茨海默病PC12細(xì)胞損傷,首次發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元影響阿爾茨海默病體外細(xì)胞模型凋亡和氧化損傷的機(jī)制與AKT信號(hào)有關(guān)。
綜上所述,牛蒡子苷元具有抗阿爾茨海默病作用,其可以通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)抑制阿爾茨海默病PC12細(xì)胞凋亡和氧化損傷,這為牛蒡子苷元治療阿爾茨海默病的臨床使用提供了理論支撐。以后實(shí)驗(yàn)中會(huì)繼續(xù)分析牛蒡子苷元其他可能作用機(jī)制和具體分子靶向機(jī)制。
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(2021-09-01收稿?責(zé)任編輯:楊覺(jué)雄)