陳柳，倪征，余斌，華炯鋼，葉偉成，云濤，劉可姝，朱寅初，張存

重組鴨瘟病毒載體中篩選高效表達(dá)鴨坦布蘇病毒E蛋白啟動(dòng)子

陳柳，倪征，余斌，華炯鋼，葉偉成，云濤，劉可姝，朱寅初，張存

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021）

鴨瘟和鴨坦布蘇病毒是鴨的兩種重要傳染病，鴨瘟屬于皰疹病毒科，具有開(kāi)發(fā)成病毒載體的優(yōu)勢(shì)。為了優(yōu)化鴨坦布蘇病毒E基因在重組鴨瘟病毒載體中的表達(dá)，之前探討了不同形式鴨坦布蘇病毒E蛋白在重組鴨瘟病毒載體中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)以鴨為宿主進(jìn)行密碼子優(yōu)化的E基因C端截短形式（E451-dk，簡(jiǎn)稱為Es）表達(dá)量最高?！尽刻接懖煌瑔?dòng)子對(duì)Es 在重組鴨瘟病毒載體中表達(dá)的影響，為鴨瘟病毒—坦布蘇病毒二聯(lián)苗的研制奠定基礎(chǔ)。將pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)啟動(dòng)子通過(guò)常規(guī)基因克隆的方法替換轉(zhuǎn)移載體pEP-BGH-Es中的pCMV啟動(dòng)子，構(gòu)建不同啟動(dòng)子調(diào)控Es表達(dá)的重組表達(dá)框pro-Es-BGH-pA。在鴨瘟病毒（DEV）疫苗株細(xì)菌人工染色體克隆pDEV-EF1的基礎(chǔ)上，將5個(gè)重組表達(dá)框分別通過(guò)“Red E/T兩步重組”克隆至pDEV-EF1突變體的US7和US8基因之間，構(gòu)建了攜帶不同啟動(dòng)子調(diào)控的Es突變體克隆pDEV-pro-Es。用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞（CEFs）拯救獲得相應(yīng)重組病毒rDEV-pro-Es，并對(duì)重組病毒感染細(xì)胞蝕斑大小和Es蛋白表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定。將重組突變體克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞拯救獲得了5株重組病毒rDEV-pro-Es。Western blotting分析表明外源蛋白Es在 pRSV調(diào)控下表達(dá)量最高，其表達(dá)量較rDEV-Es提高了169.12%。完成了Es在重組鴨瘟病毒載體中高效表達(dá)啟動(dòng)子的篩選，獲得了一種調(diào)控Es高效表達(dá)的啟動(dòng)子pRSV。同時(shí)也獲得了一株高效表達(dá)鴨坦布蘇病毒外源基因Es的重組鴨瘟病毒rDEV-pRSV-Es。

鴨瘟病毒；鴨坦布蘇病毒；E蛋白；細(xì)菌人工染色體；病毒載體；啟動(dòng)子

0 引言

【研究意義】自從2010年發(fā)生以來(lái)，鴨坦布蘇病毒（DTMUV）給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因?yàn)槠潼S病毒屬性，鴨坦布蘇病毒及其他的水禽TMUV可能納入公共健康關(guān)注。因此，關(guān)于DTMUV疫苗的研制是非常迫切的。目前，已有商品化的DTMUV滅活疫苗（HB株）和減毒疫苗（WF100株）。這些疫苗各有優(yōu)缺點(diǎn)，滅活苗安全性高、但價(jià)格高，而減毒疫苗存在一定安全隱患。鴨瘟是鴨、鵝和其他雁形目禽類(lèi)的一種急性、熱性、敗血性傳染病。該病流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率都高，曾給禽類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鴨瘟的防控目前主要靠傳統(tǒng)鴨瘟雞胚化弱毒活疫苗，在水禽生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用，具有免疫效果好、安全性高的特點(diǎn)，還能突破母源抗體的干擾。但不能區(qū)分免疫鴨和自然感染鴨，影響該病的免疫檢測(cè)及監(jiān)控。這也是疫苗研究工作者急需解決的問(wèn)題。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，疫苗的研究出現(xiàn)了根本性的變化，目前研發(fā)的新型的疫苗主要有基因疫苗、亞單位疫苗、合成肽疫苗和載體疫苗等。重組載體疫苗除具有弱毒疫苗的優(yōu)點(diǎn)外，還具有遺傳標(biāo)記易區(qū)別于野毒、容易研發(fā)新型多聯(lián)多價(jià)疫苗的特點(diǎn)，深受研究者的青睞，成為新型獸用疫苗研究的熱點(diǎn)。【前人研究進(jìn)展】目前，痘病毒、腺病毒、皰疹病毒、慢病毒、腺聯(lián)相關(guān)病毒已被廣泛用于疫苗載體的研發(fā)[1-11]。鴨瘟病毒（DEV）除了具有皰疹病毒特性之外，商品化的DEV弱化疫苗株已被廣泛用于DEV的防控。因此，DEV是極佳的用于研發(fā)水禽疫苗的病毒載體候選者。迄今為止，研究者已嘗試以DEV為載體，分別將傳染性法氏囊病病毒、鴨病毒性肝炎病毒I型和III型、新城疫病毒、H5N1亞型禽流感病毒（AIV）、H5N6亞型AIV、H5N8亞型AIV、H9N2亞型AIV、DTMUV、鵝細(xì)小病毒、鵝H5亞型禽流感病毒的抗原基因插入至DEV基因組中，用于研發(fā)相關(guān)的二聯(lián)疫苗[12-26]。CHEN等分別將前綴信號(hào)肽tPAS的DTMUV截短形式的E蛋白（TE）、和與prM串聯(lián)表達(dá)的E截短體（prM/TE）插入到DEV疫苗株基因組的US7/US8間，獲得了兩株重組鴨瘟病毒，該病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞能表達(dá)外源蛋白，并能誘導(dǎo)鴨體產(chǎn)生E蛋白抗體，經(jīng)過(guò)兩次免疫，rDEV-PrM/TE能完全保護(hù)鴨免受DTMUV的攻擊，而rDEV-TE只能保護(hù)部分鴨子遭受DTMUV攻毒。該研究顯示，tTPA信號(hào)肽的加入增加了E蛋白的表達(dá)量及分泌型蛋白的產(chǎn)生[24]。ZOU等以DEV作為載體表達(dá)DTMUV全長(zhǎng)E基因也取得了成功。重組病毒C-KCE-E能保護(hù)鴨免于DEV強(qiáng)毒攻擊，且能產(chǎn)生DTMUV E蛋白中和性抗體[25]。之后，ZOU等又同時(shí)將H5N1亞型禽流感病毒 HA和DTMUV prM-E克隆至DEV疫苗株基因組，獲得了重組病毒C-KCE-HA/ PrM-E，該病毒能誘導(dǎo)部分鴨產(chǎn)生針對(duì)H5N1亞型AIV和DTMUV的中和性抗體，但同時(shí)也能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，接種重組病毒能保護(hù)鴨免于DEV、H5N1亞型AIV和DTMUV強(qiáng)毒的攻擊[15]。雖然這些研究取得了不錯(cuò)的成績(jī)，但沒(méi)有系統(tǒng)性地研究影響外源E基因在重組DEV載體中的因素，前期我們摸索了DTMUV的抗原形式（包括前綴信號(hào)肽的E基因、去除跨膜區(qū)的截短的E基因），并對(duì)外源抗原密碼子進(jìn)行優(yōu)化，選中了一種較為優(yōu)化的抗原形式E451-dk (簡(jiǎn)稱為Es)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然課題組已針對(duì)DTMUV E蛋白進(jìn)行了多方面的優(yōu)化研究，但對(duì)于調(diào)控蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素——啟動(dòng)子這部分工作還沒(méi)有開(kāi)展。外源基因序列及調(diào)控表達(dá)的啟動(dòng)子等對(duì)于調(diào)控外源基因的表達(dá)至關(guān)重要。LI等以馬立克氏病毒MDV作為活病毒載體表達(dá)了傳染性法氏囊病病毒IBDV的VP2蛋白，發(fā)現(xiàn)在Pec啟動(dòng)子調(diào)控下的VP2表達(dá)量較pCMV調(diào)控下的高，且rDEV-Pec-VP2產(chǎn)生的免疫保護(hù)能力較rDEV-CMV-VP2更好，說(shuō)明重組MDV疫苗對(duì)IBDV的保護(hù)效率與該病毒外源蛋白VP2的表達(dá)水平密切相關(guān)[27]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為了控制和預(yù)防鴨坦布蘇病毒感染，本研究擬在前期工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)更換調(diào)控外源E451-dk（簡(jiǎn)稱為Es）蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子，從而篩選出一株以鴨瘟病毒疫苗株作為載體Es基因更高效表達(dá)的重組鴨瘟病毒，期望獲得一株可以誘導(dǎo)鴨產(chǎn)生DEV和DTMUV兩種病毒中和抗體和對(duì)病毒產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的重組鴨瘟病毒，為研究鴨瘟病毒和鴨坦布蘇病毒二聯(lián)活疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年6月至2017年10月在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所完成。

1.1 菌株、質(zhì)粒和病毒

pCDNA3.1+、pCAGGS-NLS-Cre質(zhì)粒由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存；pBS448 RSV-gfp-Cre質(zhì)粒購(gòu)自Addgene公司；pDEV-EF1/GS1783菌株（為攜帶有鴨瘟病毒疫苗株感染性BAC克隆的菌株）和對(duì)應(yīng)的rDEV-EF1病毒株由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病組研究室構(gòu)建并保存[28-29]；攜帶以鴨為宿主進(jìn)行密碼子優(yōu)化的DTMUV E451基因（簡(jiǎn)稱為Es）的重組質(zhì)粒pEP-BGH-E451-dk（即pEP-BGH-Es）和重組鴨瘟病毒rDEV-Es（即rDEV-pCMV-Es）由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病組研究室構(gòu)建并保存[30]。MDV RISPEN疫苗株購(gòu)自乾元浩生物股份有限公司。

1.2 主要試劑

KOD酶購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、凝膠純化試劑盒、快速連接試劑盒、Western BLoT Chemiluminescence HRP Substrate化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自于寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；Trans-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、蛋白分子量Marker（EasySee Western Marker）購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)有限公司；胎牛血清為Gibco BRL公司產(chǎn)品；磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自于上海吉諾生物醫(yī)藥有限公司；酶標(biāo)二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG）購(gòu)于Santa Cruz公司；GFP單抗購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司。蛋白濃縮超濾管（30k）購(gòu)于millipore公司；小鼠抗雞beta-actin單克隆抗體購(gòu)自Sigma。

1.3 細(xì)胞

取9—11日齡SPF雞胚采用胰蛋白酶消化法[31]制備雞胚成纖維細(xì)胞（CEFs）。SPF雞胚由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院良種家禽孵化基地提供。

1.4 TUMV E蛋白DIII結(jié)構(gòu)域多克隆抗體的制備

TUMV E蛋白DⅢ結(jié)構(gòu)域抗原由本課題組制備[32]，按常規(guī)方法免疫兔制備兔抗DIII多克隆抗體，以純化的DIII蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板，采用間接ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)。DEV UL44多克隆抗體制備方法同上，采用原核表達(dá)法制備抗原，所用引物為Dev UL44（BamHI+）和Dev UL44 （XhoI-）引物對(duì)（表1）。純化抗原免疫小鼠制備鼠抗UL44多克隆抗體，采用間接ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)。

1.5 引物設(shè)計(jì)及合成

本文所用引物見(jiàn)表1：pCAG（MluI+）/ PCAG （NheI-）引物對(duì)用于以pCAGGS-NLS-Cre為模板擴(kuò)增pCAG基因；pRSV（BglII+）/pRSV（NheI-）用于以pBS448 RSV-gfp-Cre質(zhì)粒為模板擴(kuò)增pRSV基因；pSV40（MluI+）/pSV40（（NheI-）用于以pCDNA3.1+為模板擴(kuò)增pSV40基因；F（MDV p1.8k BglII+）/R（MDV p1.8k NheI-）用于以MDV RISPEN病毒DNA為模板擴(kuò)增MDV 1.8k基因啟動(dòng)子（p1.8k）；F（MDV gB BglII+）/ R（MDV gB NheI-）用于以MDV RISPEN病毒DNA為模板擴(kuò)增MDV gB啟動(dòng)子（pgB）。pDEV vac-in-s和pDEV vac-in-as用于分別將表達(dá)框pCAG- Es-BGH-pA、pRSV-Es-BGH-pA和pSV40-Es-BGH-pA插入到DEV基因組的US7和US8基因之間；pDEV vac-in-s（p1.8k，pgB）和pDEV vac-in-as用于分別將表達(dá)框p1.8k（MDV）-Es-BGH-pA、pgB（MDV）-Es-BGH- pA插入到DEV基因組的US7和US8基因之間。下劃線部分與pEP-pro-Es上序列同源，可以從pEP-pro-Es擴(kuò)增出含有外源基因表達(dá)框及Kan篩選基因的片段，加粗序列分別與位于DEV US7和US8基因間插入位點(diǎn)上、下游序列同源，用于引入同源重組臂。DEV-tk-F/DEV-tk-R和JD-F/JD-R為鑒定引物對(duì)，前者用于擴(kuò)增DEV基因、后者用于驗(yàn)證外源基因是否正確插入到BAC基因組中。

1.6 pEP-pro-Es質(zhì)粒的構(gòu)建

采用表1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的pCAG、pSV40、pRSV、pgB（MDV）和p1.8k（MDV）基因，在5′和3′端分別引入了酶切位點(diǎn)，將片段用對(duì)應(yīng)的酶進(jìn)行雙酶切之后插入到pEP-BGH-Es相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，從而分別用pCAG、pSV40、pRSV、pgB（MDV）和p1.8k（MDV）替換pEP-BGH-Es上的pCMV啟動(dòng)子，構(gòu)建不同啟動(dòng)子調(diào)控Es基因的質(zhì)粒。通過(guò)PCR和酶切鑒定篩選獲得陽(yáng)性克隆，送上海博尚生物公司測(cè)序，獲得陽(yáng)性克隆分別命名為pEP-pCAG-Es、pEP-pSV40-Es、pEP-pRSV-Es、pEP-pgB（MDV）-Es和pEP-p1.8k（MDV）- Es（總稱為pEP-pro-Es）。

表1 本文所用引物

加粗序列分別與位于DEV US7和US8基因間插入位點(diǎn)上、下游序列同源，用于引入同源重組臂；下劃線部分與pEP-pro-Es上序列同源；斜體部分為引入酶切位點(diǎn)

The bold sequences are homologous to the sequences located at the intergene insertion sites of DEV US7 and US8, which introduces homologous recominant arms; the underlined sequences are homologous to the sequence on pEP-pro-Es;and the restriction enzyme recognition sequences are italicized

1.7 重組鴨瘟病毒突變體BAC克隆的構(gòu)建

各重組鴨瘟突變體BAC克隆通過(guò)“Red E/T兩步重組”[33-34]獲得。以pEP-pro-E451-dk質(zhì)粒為模板，用引物對(duì)pDEV vac-in-s/pDEV vac-in-as或pDEV vac-in-s（p1.8k，pgB）/pDEV vac-in-as （序列見(jiàn)表1）擴(kuò)增長(zhǎng)度為3 191—4 493 bp不等的PCR片段，將PCR片段電轉(zhuǎn)化至pDEV-EF1/GS1783感受態(tài)細(xì)胞，PCR片段通過(guò)自身序列上的DEV基因組同源臂將pro-Es-BGH-pA表達(dá)框和篩選基因卡那霉素（Kan）插入到pDEV-EF1。獲得的重組BAC克隆用I酶切鑒定，篩選到含Kan標(biāo)記的重組BAC克隆中間體pDEV-pro-kan.Es。之后通過(guò)pEP-BGH-Es質(zhì)粒載體上自身攜帶的同源序列將Kan基因去除，獲得只含有pro-Es-BGH-pA表達(dá)框的重組子。抽提重組子BAC DNA，通過(guò)I酶切，篩選出正確克?。╬DEV-pro- Es）。最后采用鑒定引物對(duì)DEV-tk-F/DEV-tk-R和JD-F /JD-R（序列見(jiàn)表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)出片段送出測(cè)序。

1.8 重組病毒的拯救

采用堿裂解法抽提各個(gè)pDEV-pro-Es，依照磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒操作說(shuō)明轉(zhuǎn)染CEFs，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待出現(xiàn)70%—80%熒光斑之后收集細(xì)胞及上清，即為拯救的病毒液，分別命名為rDEV-pCAG-Es、rDEV-pSV40-Es、rDEV-pRSV-Es、rDEV-pgB（MDV）-Es、rDEV-p1.8k（MDV）-Es（總稱為rDEV-pro-Es）。

1.9 重組病毒蝕斑大小的測(cè)定

將rDEV-pCAG-Es、rDEV-pSV40-Es、rDEV-pRSV- Es、rDEV-pgB（MDV）-Es、rDEV-p1.8k（MDV）-Es、rDEV-Es及rDEV-EF1病毒液稀釋接種于單層CEFs上，90 min后用PBS（pH7.2）洗滌一次，鋪上1.5%的甲基纖維素，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，在熒光顯微鏡下將每種病毒熒光蝕斑各拍100張，用Image J軟件測(cè)量病毒的蝕斑面積，并計(jì)算出平均值，以rDEV-EF1病毒株蝕斑面積為參考，將其面積設(shè)定為100%，以之為標(biāo)準(zhǔn)將其他株病毒蝕斑面積換算成百分比。用SPSS11.5軟件對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.10 TUMV E蛋白DIII和DEV UL44多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

經(jīng)間接ELISA法測(cè)得兔抗TUMV E蛋白DIII結(jié)構(gòu)域多克隆抗體效價(jià)和小鼠抗DEV UL44多克隆抗體效價(jià)皆為1﹕64 000。

1.11 蛋白表達(dá)分析

分別接種rDEV-pCAG-Es、rDEV-pSV40-Es、rDEV-pRSV-Es、rDEV-pgB（MDV）-Es、rDEV-p1.8k （MDV）-Es和rDEV-Es及對(duì)照毒株rDEV-EF1[2]于CEFs細(xì)胞中，培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)90%以上熒光，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，同時(shí)用PBS（pH7.2）洗滌細(xì)胞，收獲細(xì)胞沉淀。收集的培養(yǎng)液上清采用millipore的蛋白超濾管（30k）進(jìn)行100倍濃縮，將收集的細(xì)胞及上清樣品用上樣緩沖液處理后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素NC膜上，轉(zhuǎn)膜樣品制備3份。取出NC膜，放入含10%脫脂牛奶的封閉液中4 ℃過(guò)夜。一份以兔抗TUMV E蛋白DIII結(jié)構(gòu)域多克隆抗體（1﹕500稀釋）和鼠源GFP單抗（1﹕1 000稀釋）作為一抗，一份以小鼠抗DEV UL44多克隆抗體（1﹕500稀釋），另一份以小鼠抗beta-actin單克隆作為一抗（1﹕1 000稀釋）；二抗對(duì)應(yīng)的采用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1﹕5 000稀釋）和HRP標(biāo)記的山羊抗兔（1﹕5 000稀釋）于37℃孵育1 h，最后用Western BLoT Chemiluminescence HRP Substrate化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色，并置于凝膠成像儀進(jìn)行條帶曝光。

2 結(jié)果

2.1 重組鴨瘟病毒BAC突變體克隆的鑒定

分別提取各重組鴨瘟病毒BAC突變體克隆及Kan中間體，用I酶切，電泳鑒定（圖 1）。結(jié)果表明DNA電泳圖譜和以GenBank（登錄號(hào)KF487736.1）收錄的鴨瘟病毒參考序列進(jìn)行預(yù)測(cè)的基本一致。電泳及測(cè)序結(jié)果也表明，以DEV-tk-F和DEV-tk-R、JD-F和JD-R引物對(duì)擴(kuò)出的PCR片段（電泳圖見(jiàn)圖2）與預(yù)期一致，說(shuō)明外源基因已按照預(yù)期插入鴨瘟病毒疫苗株基因組中。

1: pDEV-EF1; 2: pDEV-Es; 3: pDEV-kan. pRSV. Es; 4: pDEV-pRSV. Es; 5: pDEV-kan.pSV40. Es; 6: pDEV-pSV40. Es; 7: pDEV-kan.pCAG. Es; 8: pDEV-pCAG. Es; 9: pDEV-kan.p1.8k(MDV). Es; 10: pDEV-p1.8k (MDV). Es; 11: pDEV-kan.pgB(MDV). Es; 12: pDEV-pgB(MDV). Es

泳道1—6 是以DEV-tk-F和DEV-tk-R引物對(duì)擴(kuò)增片段；7—12 是以JD-F和JD-R引物對(duì)擴(kuò)增片段。M1：DL2000(2000，1000, 750, 500, 250, 100 bp); 1. pDEV-EF1 (553 bp); 2. pDEV-pSV40. Es (553 bp); 3. pDEV- pRSV. Es (553 bp); 4. pDEV-pCAG. Es(553 bp); 5. pDEV-p1.8k (MDV). Es (553 bp); 6. pDEV-pgB(MDV). Es (553 bp); M2: 250 bp marker(4500, 3000, 2250, 1500, 1000, 750, 500, 250 bp); 7. pDEV-EF1(641 bp); 8. pDEV-pSV40. Es(2747 bp); 9. pDEV-pRSV. Es(2745 bp); 10. pDEV- pCAG. Es(3989 bp); 11. pDEV-p1.8k(MDV). Es (2687 bp);12. pDEV-pgB (MDV). Es (3037 bp)

2.2 重組病毒的拯救

轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染孔內(nèi)出現(xiàn)熒光蝕斑，繼續(xù)培養(yǎng)至70%—80%細(xì)胞出現(xiàn)熒光蝕斑之后收集細(xì)胞和上清，即為拯救重組病毒（圖3）。

2.3 病毒蝕斑面積測(cè)定

病毒蝕斑面積測(cè)定表明，與rDEV-EF1相比，rDEV- Es、rDEV-pCAG-Es、rDEV-pSV40-Es、rDEV-pRSV-Es蝕斑面積分別較rDEV-EF1減少了35.26%、15.61%、10.22%、11.41%，而rDEV-p1.8k（MDV）-Es 和rDEV- pgB（MDV）-Es蝕斑面積分別較rDEV-EF1增加了21%和35.66%（圖4）。

圖3 拯救重組病毒

圖4 各重組病毒在細(xì)胞上的蝕斑面積測(cè)定和比較

2.4 外源蛋白Es表達(dá)分析

將各重組毒株感染CEFs，分別收集細(xì)胞和50倍濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)液上清，將細(xì)胞樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜，做3份重復(fù)，分別以兔抗TUMV E蛋白DIII結(jié)構(gòu)域多克隆抗體、小鼠抗GFP單克隆抗體和小鼠抗DEV UL44多克隆抗體、小鼠抗beta-actin單克隆抗體作為一抗，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果表明以小鼠抗GFP單克隆抗體和小鼠抗DEV UL44多克隆抗體作為一抗檢測(cè)的膜在進(jìn)rDEV-Es、rDEV- pRSV-Es、rDEV-pCAG-Es感染的細(xì)胞樣品在約49—52kD處顯出特異性目的蛋白條帶（圖5-A），在28 kD處顯示出內(nèi)參GFP條帶，與預(yù)測(cè)基本一致，說(shuō)明蛋白獲得了表達(dá)。其他參考蛋白beta-actin、UL44皆在相應(yīng)位置顯出了條帶。以beta-actin為內(nèi)參，用Image J軟件分析各樣品表達(dá)條帶灰度值比值（Es/beta-actin），結(jié)果表明含pCMV、pCAG、pRSV所表達(dá)的蛋白強(qiáng)度比值分別是1.367、0.698和3.679，說(shuō)明pRSV啟動(dòng)子活性最強(qiáng)，rDEV-pRSV- Es感染細(xì)胞中Es蛋白表達(dá)量較rDEV-Es提高了169.12%（圖5-A）。細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品中明顯檢測(cè)到GFP的表達(dá)，但未檢測(cè)到目的蛋白和病毒蛋白UL44（圖5-B）。

1: rDEV-Es; 2: rDEV-pSV40-Es; 3: rDEV-pCAG-Es; 4: rDEV-pRSV-Es; 5: rDEV-p1.8(MDV) -Es; 6: rDEV-pgB(MDV)-Es; M: EasySee Western Marker (90, 75, 60,40, 25 kD); 7: rDEV-EF1

3 討論

感染性細(xì)菌染色體克?。˙ACs）是皰疹病毒基因組操作的最主要的平臺(tái)，基于該平臺(tái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛開(kāi)展了皰疹病毒基因缺失疫苗和重組活載體疫苗的研究，目前馬立克氏病毒（MDV）和偽狂犬病毒（PRV）的基因缺失疫苗和重組活載體疫苗已經(jīng)獲得了成功，并廣泛用于實(shí)際生產(chǎn)中。課題組曾將鴨瘟病毒疫苗株基因組插入到BAC質(zhì)粒構(gòu)建了鴨瘟病毒全基因組的感染性克隆，獲得了DEV疫苗株的反向遺傳系統(tǒng)[24]，嘗試將以雞為宿主進(jìn)行密碼子優(yōu)化的DTMUV E基因插入到DEV的反向遺傳系統(tǒng)，但外源基因E的表達(dá)水平不高[25]。之后又摸索了E基因的表達(dá)形式，包括是否前綴信號(hào)肽、是否去掉跨膜區(qū)、是否進(jìn)行基因優(yōu)化和以哪個(gè)宿主密碼子為參考進(jìn)行基因優(yōu)化效果最佳都進(jìn)行了摸索，篩選到了一種E蛋白表達(dá)量較高的E基因的表達(dá)形式（即去掉跨膜區(qū)、以鴨為宿主進(jìn)行密碼子優(yōu)化的E451基因）[30]。

本研究中選用了幾種常用的啟動(dòng)子：巨細(xì)胞病毒CMV早期啟動(dòng)子（pCMV）、猿猴病毒SV40的早期啟動(dòng)子（pSV40）、Rous肉瘤病毒RSV啟動(dòng)子（pRSV）、復(fù)合啟動(dòng)子pCAG、雞源病毒MDV 1.8k基因（p1.8k（MDV））和gB基因啟動(dòng)子（pgB（MDV）），其中，pCMV和pRSV調(diào)控E蛋白表達(dá)的效果最佳，究其原因，可能CMV與DEV同屬皰疹病毒科；RSV天然宿主為雞，因此更適合。本研究中幾株病毒的蝕斑面積較親本毒株或多或少都有些波動(dòng)，說(shuō)明啟動(dòng)子影響了病毒在細(xì)胞間的傳播能力，但啟動(dòng)子的替換不影響病毒在細(xì)胞上的增殖及在細(xì)胞間的傳播。

是否外源基因的表達(dá)水平與抗體生成水平有關(guān)，目前存在著一定的爭(zhēng)議。LI等[27]、TSUKAMOTO等[35]的研究表明強(qiáng)啟動(dòng)子更有利于外源基因的表達(dá)，且外源基因的表達(dá)量與誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平成正相關(guān)性，高水平的抗體更利于機(jī)體對(duì)強(qiáng)毒株的免疫保護(hù)。但也有相反的研究結(jié)論，MA等的研究表明外源蛋白表達(dá)水平過(guò)高，會(huì)與母源抗體發(fā)生中和，從而使得外源蛋白抗體水平下降，反而導(dǎo)致免疫保護(hù)效果不佳[36]。綜上，以DEV作為載體表達(dá)外源蛋白需要維持外源蛋白表達(dá)量到一個(gè)度，太低不足以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，太高要么會(huì)有毒性要么會(huì)和抗體相中和。此外，本研究選用的是去除跨膜區(qū)的E基因的截短形式，最新的研究表明截短形式的E蛋白依然能保護(hù)青年鴨免受DTMUV強(qiáng)毒的攻擊[37]。DEV和DTMUV共同的自然宿主是鴨和鵝，而本試驗(yàn)是在雞源細(xì)胞上開(kāi)展的，是否在其他宿主細(xì)胞或者宿主體內(nèi)蛋白表達(dá)量會(huì)有差異，需要進(jìn)一步研究。至于重組病毒rDEV- pRSV-Es以及其他幾株病毒免疫效果如何最終需要通過(guò)后續(xù)的動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

4 結(jié)論

本研究成功篩選獲得了一種調(diào)控鴨坦布蘇病毒Es在重組鴨瘟病毒載體中高效表達(dá)的啟動(dòng)子pRSV。同時(shí)也獲得了一株高效表達(dá)鴨坦布蘇病毒外源基因Es的重組鴨瘟病毒rDEV-pRSV-Es。該研究為鴨瘟病毒—坦布蘇病毒二聯(lián)苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

[1] KALODIMOU G, VEIT S, JANY S, KALINKE U, BRODER C C, SUTTER G, VOLZ A. A soluble version of nipah virus glycoprotein G delivered by vaccinia virus MVA activates specific CD8 and CD4 T cells in mice., 2020, 12(1): 26.

[2] BERTRAN K, CRIADO M F, LEE D H, KILLMASTER L, Sà E SILVA M, LUCIO E, WIDENER J, PRITCHARD N, ATKINS E, MEBATSION T, SWAYNE D E. Protection of White Leghorn chickens by recombinant fowlpox vector vaccine with an updated H5 insert against Mexican H5N2 avian influenza viruses., 2020, 38(6):1526-1534.

[3] KIM J W, MORSHED R A, KANE J R, AUFFINGER B, QIAO J, LESNIAK M S. Viral vector production: adenovirus., 2016,1382:115-130.

[4] LAROCCA R A, MENDES E A, ABBINK P, PETERSON R L, MARTINOT A J, IAMPIETRO M J, KANG Z H, AID M, KIRILOVA M, JACOB-DOLAN C, TOSTANOSKI L, BORDUCCHI E N, De La BARRERA R A, BAROUCH D H. Adenovirus vector- based vaccines confer maternal-fetal protection against Zika virus challenge in pregnant IFN-αβR-/- mice., 2019, 26(5): 591-600.

[5] CHANG P, AMEEN F, SEALY J E, SADEYEN J R, BHAT S, LI Y, IQBAL M. Application of HDR-CRISPR/Cas9 and erythrocyte binding for rapid generation of recombinant turkey herpesvirus-vectored avian influenza virus vaccines., 2019, 7(4): E192.

[6] ?MIETANKA K, TYBOROWSKA J, OLSZEWSKA-TOMCZYK M, DOMAńSKA-BLICHARZ K, MINTA Z, RABALSKI L, CZARNOTA A, KUCHARCZYK K, SZEWCZYK B. A Recombinant turkey herpesvirus expressing F and HN genes of avian avulavirus-1 (AAvV-1) genotype VI confers cross-protection against challenge with virulent AAvV-1 genotypes IV and VII in chickens., 2019,11(9): E784.

[7] KAMEL M, El-SAYED A. Utilization of herpesviridae as recombinant viral vectors in vaccine development against animal pathogens., 2019, 270: 197648.

[8] LEMIALE F, ASEFA B, YE D, CHEN C, KOROKHOV N, HUMEAU L. An HIV-based lentiviral vector as HIV vaccine candidate: immunogenic characterization., 2010, 28(8): 1952-1961.

[9] LIN A, BALAZS A B. Adeno-associated virus gene delivery of broadly neutralizing antibodies as prevention and therapy against HIV-1., 2018,15(1):66.

[10] 展小過(guò)，喬傳玲，楊煥良，陳艷，孔維，辛?xí)怨?，陳化蘭. 表達(dá)H3N2亞型豬流感病毒HA基因重組腺病毒對(duì)小鼠免疫原性的研究. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010,43(6):1235-1241.

ZHAN X G, QIAO C L, YANG H L, CHEN Y, KONG W, XIN X G, CHEN H L. Immunogenicity of a recombinant adenovirus expressing HA gene of H3N2 subtype swine influenza virus in mice., 2010, 43(6): 1235-1241. (in Chinese)

[11] 陳化蘭, 馬文軍, 于康震. 表達(dá)禽流感病毒血凝素基因的重組禽痘病毒的構(gòu)建, 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2000, 33( 5): 1-7.

CHEN H L, MA W J, YU K Z. Construction of a recombinant fowlpox virus expressing hemagglutinin gene of avian influenza virus., 2000, 33( 5): 1-7. (in Chinese)

[12] CHEN P, DING L, JIANG Y, ZENG X, DENG G, SHI J, LI Y, LIU L, ZHAO Y, HU Y, LIU J, CHEN H. Protective efficacy in farmed ducks of a duck enteritis virus-vectored vaccine against H5N1, H5N6, and H5N8 avian influenza viruses., 2019, 37(40): 5925-5929.

[13] DING L, CHEN P, BAO X, LI A, JIANG Y, HU Y, GE J, ZHAO Y, WANG B, LIU J, CHEN H. Recombinant duck enteritis viruses expressing the Newcastle disease virus (NDV) F gene protects chickens from lethal NDV challenge., 2019, 232:146-150.

[14] CHANG P, YAO Y, TANG N, SADEYEN J R, SEALY J, CLEMENTS A, BHAT S, MUNIR M, BRYABT J E, IQBAL M. the application of nhej-crispr/cas9 and cre-lox system in the generation of bivalent duck enteritis virus vaccine against avian influenza virus., 2018, 10(2): E81.

[15] ZOU Z, HUANG K, WEI Y, CHEN H, LIU Z, JIN M. Construction of a highly efficient CRISPR/Cas9-mediated duck enteritis virus- based vaccine against H5N1 avian influenza virus and duck Tembusu virus infection., 2017,7(1):1478.

[16] ZOU Z, MA J, HUANG K, CHEN H, LIU Z, JIN M. Live attenuated vaccine based on duck enteritis virus against duck hepatitis a virus types 1 and 3., 2016, 7:1613.

[17] SUN Y, YANG C, LI J, LI L, CAO M, LI Q, LI H. Construction of a recombinant duck enteritis virus vaccine expressing hemagglutinin of H9N2 avian influenza virus and evaluation of its efficacy in ducks., 2017, 162(1):171-179.

[18] LI H, WANG Y, HAN Z, WANG Y, LIANG S, JIANG L, HU Y, KONG X, LIU S. Recombinant duck enteritis viruses expressing major structural proteins of the infectious bronchitis virus provide protection against infectious bronchitis in chickens., 2016, 130:19-26.

[19] WANG J, GE A, XU M, WANG Z, QIAO Y, GU Y, LIU C, LIU Y, HOU J. Construction of a recombinant duck enteritis virus (DEV) expressing hemagglutinin of H5N1 avian influenza virus based on an infectious clone of DEV vaccine strain and evaluation of its efficacy in ducks and chickens., 2015, 12:126.

[20] ZOU Z, HU Y, LIU Z, ZHONG W, CAO H, Chen H, JIN M. Efficient strategy for constructing duck enteritis virus-based live attenuated vaccine against homologous and heterologous H5N1 avian influenza virus and duck enteritis virus infection., 2015, 46: 42.

[21] WANG J, OSTERRIEDER N. Generation of an infectious clone of duck enteritis virus (DEV) and of a vectored DEV expressing hemagglutinin of H5N1 avian influenza virus., 2011, 159(1): 23-31.

[22] LIU J, CHEN P, JIANG Y, WU L, ZENG X, TIAN G, GE J, KAWAOKA Y, BU Z, CHEN H. A duck enteritis virus-vectored bivalent live vaccine provides fast and complete protection against H5N1 avian influenza virus infection in ducks., 2011, 85(21): 10989-10998.

[23] LIU X, WEI S, LIU Y, FU P, GAO M, MU X, LIU H, XING M, MA B, WANG J. Recombinant duck enteritis virus expressing the HA gene from goose H5 subtype avian influenza virus., 2013, 31(50): 5953-5959.

[24] CHEN P, LIU J, JIANG Y, ZHAO Y, LI Q, WU L, HE X, CHEN H. The vaccine efficacy of recombinant duck enteritis virus expressing secreted E with or without PrM proteins of duck Tembusu virus., 2014, 32(41): 5271-5277.

[25] ZOU Z, LIU Z, JIN M. Efficient strategy to generate a vectored duck enteritis virus delivering envelope of duck Tembusu virus., 2014, 6(6): 2428-2443.

[26] 陳柳，余斌，倪征，華炯鋼，葉偉成，云濤，張存. 表達(dá)小鵝瘟病毒VP2蛋白重組鴨瘟病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(14): 2813-2821.

CHEN L, YUN B, NI Z, HUA J G, YE W C, YUN T, ZHANG C. Construction and characterization of a recombinant duck enteritis virus expressing VP2 gene of goose parvovirus.2016, 49(14): 2813-2821. (in Chinese)

[27] LI K, LIU Y, LIU C, GAO L, ZHANG Y, GAO Y, CUI H, QI X, ZHONG L, WANG X. Effects of different promoters on the protective efficacy of recombinant Marek's disease virus type 1 expressing the VP2 gene of infectious Bursal disease virus., 2016, 34(47): 5744-5750.

[28] CHEN L, YU B, HUA J, et al. Construction of a full-length infectious bacterial artificial chromosome clone of duck enteritis virus vaccine strain., 2013,10:328.

[29] 陳柳，余斌，倪征，華炯鋼，葉偉成，云濤，張存. 表達(dá)鴨坦布蘇病毒E 蛋白的重組鴨瘟病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015, 27(11): 1889-1895.

CHEN L, YU B, NI Z, HUA J G, YE W C, YUN T, ZHANG C. Construction and characterization of a recombinant duck enteritis virus expressing E protein of duck Tembusu virus. A, 2015, 27(11): 1889-1895.(in Chinese)

[30] CHEN L, YU B, HUA J, NI Z, YE W, YUN T, ZHANG C. Optimized expression of duck Tembusu virus e gene delivered by a vectored duck enteritis virus., 2019, 61(10): 783-790.

[31] 馬興樹(shù). 禽傳染病試驗(yàn)診斷技術(shù). 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

MA X S.. Beijing:Chemical Industry Press, 2006.(in Chinese)

[32] 余斌，華炯鋼，劉躍生，趙靈燕，倪征，葉偉成，云濤，陳柳，徐輝，張存. 鴨坦布蘇病毒抗體間接ELISA 檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用. 浙江畜牧獸醫(yī), 2014, 5 : 1-6．

YU B, HUA J G, LIU Y S, ZHAO L Y, NI Z, YE W C, YUN T, CHEN L, XU H, ZHANG C. Establishment and application of indirect ELISA for detection of duck Tembusu virus antibody., 2014, 5: 1-6. (in Chinese)

[33] TISCHER B K, von EINEM J, KAUFER B, OSTERRIEDER N. Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in., 2006, 40(2): 191-197.

[34] TISCHER B K, SMITH G A, OSTERRIEDER N. En passant mutagenesis: a two step markerless red recombination system. Jeff Braman(ed.),:, 2010, 634: 421-430.

[35] TSUKAMOTO K, SAITO S, SAEKI S, SATO T, TANIMURA N, ISOBE T, MASE M, IMADA T, YUASA N, YAMAGUCHI S. Complete, long-lasting protection against lethal infectious bursal disease virus challenge by a single vaccination with an avian herpesvirus vector expressing VP2 antigens., 2002, 76(11): 5637-5645.

[36] MA C, ZHANG Z, ZHAO P, DUAN L, ZHANG Y, ZHANG F, CHEN W, CUI Z. Comparative transcriptional activity of five promoters in BAC-cloned MDV for the expression of the hemagglutinin gene of H9N2 avian influenza virus., 2014, 206: 119-127.

[37] LI L, ZHANG Y, DONG J, ZHANG J, ZHANG C, SUN M, CAO Y. The truncated E protein of DTMUV provide protection in young ducks., 2020, 240: 108508.

Optimized Promoter Regulating of Duck Tembusu Virus E Protein Expression Delivered by a Vectored Duck Enteritis Virus

CHEN Liu, NI Zheng, YU Bin, HUA JiongGang, YE WeiCheng, YUN Tao, LIU KeShu, ZHU YinChu, ZHANG Cun

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021)

【】 Duck enteritis virus (DEV) and duck Tembusu virus (DTMUV) are considered to be two of the important viruses that infected ducks. DEV is classified into the familywhich has the characterization of live viral vector. 【】In our previous study, a recombinant DEV delivering optimized DTMUV E451 gene (E451-dk) referring to duck’s codon usage bias has been selected. In this study, the promoter regulating E451-dk (Es in short) in rDEV-EF1 was also evaluated for enhancing E451-dk expression level. 【】The transfer vector pEP-BGH-pro-Es were constructed by separately substituted pCMV (cytomegalovirus major immediate-early promoter) on the vector pEP-BGH-Es with pCAG (human cytomegalovirus enhancer and chicken-actin promoter), pSV40 (the simian virus 40 promotor), pRSV(Rous sarcoma virus (RSV) promoter), pgB（MDV）(marek's disease virus (MDV) gB gene promoter) and p1.8k（MDV）(MDV 1.8k gene promoter). The recombinant DEV BAC clone pDEV-pro-Es carrying pro-Es genes were generated by two-step Red E/T recombination in. pDEV-pro-Es were constructed by inserting pro-Es expression cassette between DEV US7 and US8 genes on the infectious clone of DEV (pDEV-EF1). The recombinant virus rDEV-pro-Es (rDEV-pCAG-Es, rDEV-pSV40-Es, rDEV-pRSV-Es, rDEV-pgB(MDV)-Es and rDEV-p1.8k(MDV)-Es) were rescued from chicken embryo fibroblasts (CEFs) by calcium phosphate precipitation. The plaque size and expression of DTMUV Es in recombinant virus-infected CEFs were analyzed. 【】 All viruses were successfully rescued from CEFs. Western blot analysis showed that the expression level of Es in rDEV-pRSV-Es -infected cells was increased 169.12% compared to that of rDEV-Es -infected cells. 【】pRSV was the highest effective promoter chosen in this study which regulating Es expression on recombinant DEV genome backbone. These studies laid a foundation for developing bivalent vaccine controlling DEV and DTMUV infection.

duck enteritis virus; duck Tembusu virus; E protein; bacterial artificial chromosome; viral vector; promoter

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.24.015

2020-01-17；

2020-07-29

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31670150）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0500107）、浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目（2016C32070）

陳柳，Tel：0571-86404257；E-mail：haoliuzi@126.com。通信作者張存，Tel：0571-86404182；E-mail：zhangcun@aliyun.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）