鄒杰，劉媛

水稻基因逆境表達(dá)特征及其啟動子的克隆與分析

鄒杰1,2，劉媛3

(1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000；2.江西省作物生長發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 宜春 336000；3.宜春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西 宜春 336000)

采用qRT-PCR技術(shù)分析水稻在高溫(42 ℃)、低溫(4 ℃)、10%聚乙二醇(PEG)6000模擬干旱、高鹽(100 mmol/L NaCl)和脫落酸(ABA)處理(100 μmol/L)下的表達(dá)模式；克隆基因啟動子，并利用在線軟件New PLACE和PlantCARE對其序列進(jìn)行順式作用元件分析；構(gòu)建OsRZFP34pro::GUS表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化水稻；通過組織化學(xué)染色和GUS酶活性檢測，分析在不同脅迫處理?xiàng)l件下啟動子驅(qū)動基因表達(dá)的活性。qRT-PCR分析結(jié)果表明，上述5種處理均能不同程度地誘導(dǎo)的表達(dá)，其中高溫脅迫對其表達(dá)的誘導(dǎo)程度最強(qiáng)，而ABA對其表達(dá)只有微弱的誘導(dǎo)。順式作用元件分析結(jié)果表明，該啟動子上包含有多個與逆境響應(yīng)、激素響應(yīng)以及Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)元件。GUS組織化學(xué)染色和熒光分析結(jié)果顯示，基因啟動子的活性受到高溫、低溫、PEG、鹽和ABA的調(diào)控，表明該啟動子是受多種逆境誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型啟動子。

水稻；基因；逆境誘導(dǎo)；表達(dá)特征；啟動子；順式作用元件

環(huán)鋅指蛋白(RING zinc finger protein，RZFP)是一類在植物的非生物逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子[1-2]。沙蒿()的過表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因煙草對干旱脅迫的耐受性[3]。玉米ZmXerico1通過調(diào)節(jié)脫落酸(abscisic acid, ABA)的穩(wěn)態(tài)，賦予轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性[4]。水稻的過表達(dá)，通過提高游離脯氨酸含量和抗氧化酶活性來增強(qiáng)植物的抗寒性[5]。也有一些環(huán)鋅指蛋白負(fù)調(diào)控植物的非生物脅迫抗性。相對野生型而言，擬南芥突變體降低了植物對干旱的敏感性，而過表達(dá)提高了植株對干旱的敏感性[6]。的過表達(dá)削弱了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗鹽能力[7]。

啟動子是基因上游重要的DNA序列，其類型包括組成型、組織特異型和誘導(dǎo)型3種[8]。在植物的抗逆基因功能研究中，由于使用組成型啟動子會連續(xù)驅(qū)動下游基因(包括外源基因)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，可能會導(dǎo)致植物生長速度過快、植株矮小、早花、遲花和減產(chǎn)等不良性狀，而使用誘導(dǎo)型啟動子則能有效改善或規(guī)避這些不良性狀[9-10]。因此，誘導(dǎo)型啟動子的開發(fā)利用在植物抗逆基因的功能研究和應(yīng)用中具有重大意義。

有研究[11]表明，是1個環(huán)鋅指蛋白編碼基因，其表達(dá)受到高溫脅迫和ABA處理的誘導(dǎo)；OsRZFP34可能通過參與調(diào)控ABA、Ca2+和K+信號相關(guān)基因的表達(dá)，介導(dǎo)氣孔張開，參與水稻葉片的蒸騰冷卻。本研究中，采用qRT-PCR技術(shù)分析了在高溫(42 ℃)、低溫(4 ℃)、10% PEG6000、100 mmol/L NaCl和100 μmol/L ABA處理下的表達(dá)模式；克隆啟動子并進(jìn)行了順式作用元件分析；通過GUS組織染色和GUS酶活性定量檢測，分析了該啟動子在不同脅迫下的表達(dá)活性，旨在為進(jìn)一步研究基因在非生物脅迫應(yīng)答中的功能，以對逆境誘導(dǎo)型啟動子的改良和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材料與試劑

水稻材料‘日本晴’(Lspp.cv. ‘Nipponbare’)、大腸埃希菌() Top10感受態(tài)細(xì)胞、根癌農(nóng)桿菌() EHA105感受態(tài)細(xì)胞和表達(dá)載體pCAMBIA-1305.1為江西省作物生長發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

RNA提取試劑RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser及qRT-PCR 試劑盒TB Green? Premix DimerEraser? 購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；限制性內(nèi)切酶購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DNA Marker、超強(qiáng)高保真PCR試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、Universal DNA純化回收試劑盒及EasyGeno快速重組克隆試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；GUS染色試劑盒、4-甲基傘形酮(4-MU)和4-甲基傘形酮--D-葡萄糖醛酸苷(4-MUG)購于中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。

1.2　方法

1.2.1水稻基因表達(dá)特征的分析

基因部位表達(dá)和逆境響應(yīng)表達(dá)分析參考鄒杰等[12]的方法進(jìn)行。脅迫處理樣品的取樣時間點(diǎn)為0、0.5、1、2、4、8、24 h。試驗(yàn)所用引物如表1所示。

表1　本研究所用引物

序列中的小寫字母部分為載體同源序列。

試驗(yàn)設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，采用2?ΔΔCt法[13]計算基因相對表達(dá)量。試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計分析；采用Tukey多重比較檢驗(yàn)(＜0.05)進(jìn)行差異顯著性分析；利用GraphPad Prism 8.0繪圖。

1.2.2啟動子的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(http://plants. ensembl.org/index.html)中基因(Transcript ID:Os01t0719100-04)上游啟動子序列，設(shè)計特異的PCR引物-P F/R (表1)，以水稻基因組DNA為模板，使用超強(qiáng)高保真PCR試劑盒擴(kuò)增基因起始密碼子上游1 951 bp啟動子區(qū)域。PCR反應(yīng)體系為30 μL，含DNA模板0.5 μL, 15 μL 2×UltraHiFi Mix，上、下游引物-P F/R各0.75 μL，ddH2O 13 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，68 ℃延伸30 s，34個循環(huán)；68 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收。

利用EasyGeno快速重組克隆試劑盒將回收的PCR產(chǎn)物與經(jīng)Ⅰ和Ⅰ線性化的pCAMBIA- 1305.1載體進(jìn)行基因重組，用啟動子替換35S啟動子，構(gòu)建OsRZFP34pro::GUS植物表達(dá)載體(圖1)。重組子分別用Ⅰ+Ⅱ和Ⅰ+Ⅰ雙酶切驗(yàn)證后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

圖1　OsRZFP34pro::GUS植物表達(dá)載體構(gòu)建示意結(jié)果

1.2.3啟動子序列分析

運(yùn)用數(shù)據(jù)庫New PLACE (https://www.dna.affrc. go.jp/PLACE/?action=newplace)和PlantCARE(http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析PCR擴(kuò)增的啟動子區(qū)域存在的順式作用元件。

1.2.4GUS組織化學(xué)染色分析和GUS酶活性檢測

為進(jìn)一步研究啟動子在不同組織中的表達(dá)活性，以及在不同脅迫處理下的誘導(dǎo)活性，對正常生長條件下T1代OsRZFP34pro::GUS轉(zhuǎn)基因水稻的根、莖、葉片、葉枕、幼穗和谷粒等組織進(jìn)行GUS染色分析；OsRZFP34pro::GUS轉(zhuǎn)基因水稻種子萌芽后在培養(yǎng)箱中用Yoshida營養(yǎng)液培養(yǎng)7 d，參照1.2.1的處理方法處理4 h后，進(jìn)行GUS染色分析和GUS酶活性檢測。GUS組織染色參照中科瑞泰GUS染色試劑盒的使用說明進(jìn)行。37 ℃保溫過夜后，用75%的乙醇脫色3~5次，至陰性對照材料無綠色、脫色液無色為止，觀察并拍照記錄結(jié)果。稱取逆境處理4 h后的水稻幼苗100 mg樣品(地上部分)，于GUS提取液中研磨勻漿，離心收集上清液，上清液即為GUS蛋白粗提取液。GUS活性測定參照文獻(xiàn)[14]的方法，以4-MUG為底物，進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定反應(yīng)產(chǎn)物在激發(fā)光365 nm、發(fā)射光455 nm、狹縫10 nm條件下的熒光值。GUS活性以生成的4-MU的量與總蛋白的量和時間的比值表示。檢測設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；顯著性差異檢測采用Tukey法進(jìn)行多重比較(＜0.05)；使用GraphPad Prism 8.0繪圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　OsRZFP34基因在水稻不同組織和脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)模式

本研究中，利用qRT-PCR檢測了在三葉期水稻的根和苗(地上部分)以及孕穗期水稻的根、莖、葉、葉鞘、幼穗組織中的相對表達(dá)量。qRT-PCR的結(jié)果顯示，在葉片和幼苗中表達(dá)較強(qiáng)，其次是在幼根中，在其他部位的表達(dá)較弱，在莖中的表達(dá)量最低(圖2-A)。

利用qRT-PCR檢測了受不同脅迫處理誘導(dǎo)表達(dá)的情況。結(jié)果顯示，高溫(42 ℃)、低溫(4 ℃)、模擬干旱(10% PEG6000)、高鹽(100 mmol/L NaCl)和ABA (100 μmol/L) 處理均能不同程度地誘導(dǎo)的表達(dá)，其中，高溫脅迫對的誘導(dǎo)程度最強(qiáng)，在處理0.5 h后其表達(dá)水平即升高至處理前的10.5倍左右，并在4 h內(nèi)保持較高水平(＞7倍)，8 h后與初始水平無顯著差異(圖2-B)。在低溫處理的24 h內(nèi)，的表達(dá)均上調(diào)，上調(diào)幅度為2～4倍(圖2-C)。在PEG處理的前2 h，的表達(dá)水平上調(diào)，在0.5 h時達(dá)到最高值，為初始值的2.6倍(圖2-D)。在100 mmol/L NaCl 處理的0.5 h和1 h,的表達(dá)分別上調(diào)3.8倍和3.4倍，2 h后其表達(dá)水平恢復(fù)到初始值(圖2-E)。經(jīng)100 μmol/L ABA的處理，的表達(dá)水平在24 h內(nèi)呈微弱上調(diào)，上調(diào)幅度小于初始值的2倍(圖2-F)。

A 在不同水稻組織中的表達(dá)情況；B、C、D、E、F 分別表示在高溫、低溫、模擬干旱、高鹽、ABA處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況。不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

2.2　OsRZFP34啟動子克隆和植物表達(dá)載體的構(gòu)建

以水稻基因組DNA為模板，OsRZFP34-P F/R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果顯示，在接近2 000 bp區(qū)域出現(xiàn)單一清晰條帶，大小與預(yù)期一致(圖3-A)。采用無縫重組試劑盒(EasyGeno)將純化的目的片段連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA-1305.1上。重組質(zhì)粒分別用Ⅰ+Ⅱ和Ⅰ+Ⅰ雙酶切驗(yàn)證，電泳結(jié)果(圖3-B)顯示，可以切出預(yù)期大小的片段，初步判斷啟動子已替換了pCAMBIA-1305.1載體中的35S啟動子。測序證明啟動子成功替換了載體中的35S啟動子，構(gòu)建成功的植物表達(dá)載體命名為OsRZFP34pro::GUS。通過凍融法將OsRZFP34pro:: GUS載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻‘日本晴’，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

M　DNA Marker；1　OsRZFP34啟動子擴(kuò)增產(chǎn)物；2　OsRZFP34pro::GUS載體經(jīng)Kpn Ⅰ和Bgl Ⅱ雙酶切產(chǎn)生的條帶；3　OsRZFP34pro::GUS載體經(jīng)Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切產(chǎn)生的條帶。

2.3　OsRZFP34啟動子順式作用元件分析

通過New PLACE和PlantCARE在線分析啟動子區(qū)域1 951 bp序列，發(fā)現(xiàn)該啟動子區(qū)域包含了大量與脅迫響應(yīng)、激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件(表2)。這些元件主要包括參與熱激響應(yīng)和調(diào)控的元件CCAAT-box(CCAAT)10個和GATA-motif(WGATAR)6個；參與低溫脅迫響應(yīng)的相關(guān)元件MYCCONSENSUSAT(CANNTG)6個、LTRECOREATCOR15(CCGAC)和CBFHV (RYCGAC)各1個；參與干旱/脫水脅迫響應(yīng)的元件MYB1AT (WAACCA)6個，ACGT元件(ACGT)和MYBCORE (CNGTTR)各5個，CRT/DRE(RCCGAC)和MYCATERD1(CATGTG)各1個；參與ABA響應(yīng)的元件ABRE(ACGTG)3個和DPBFCOREDCDC 3(ACACNNG)4個；參與病菌和鹽脅迫響應(yīng)的元件GT1GMSCAM4(GAAAAA)6個；與茉莉酸響應(yīng)相關(guān)的順式元件CGTCA-motif(CGTCA)4個、GCCCORE(GCCGCC)和T/GBOXATPIN2(AACGTG)各2個；與生長素響應(yīng)相關(guān)的元件AuxRR-core (GGTCCAT)、CATATGGMSAUR(CATATG)、TGA- element(AACGAC)各1個；GA響應(yīng)相關(guān)元件CAREOSREP1(CAACTC)1個和GARE-motif (TCTGTTG)2個；參與Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的元件CGCG-box(VCGCGB)5個和ABRERATCAL(MAC GYGB)2個；此外，還存在1個損傷脅迫響應(yīng)相關(guān)元件W-box (TGACY)和1個脅迫響應(yīng)元件STRE (AGGGG)。

表2　OsRZFP34啟動子上與逆境響應(yīng)相關(guān)的主要順式作用元件

核心序列中B代表C、G、T；N代表A、C、G、T；M代表A、C；R代表A、G；V代表A、C、G；W代表A、T；Y代表C、T?！?”表示正鏈；“-”表示負(fù)鏈。

2.4　轉(zhuǎn)基因水稻GUS組織表達(dá)分析

取非脅迫條件下生長的OsRZFP34pro::GUS轉(zhuǎn)基因水稻的根、莖、葉片、葉枕、穎花和種子進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果(圖4-G、H、I、J、K、L)顯示，只在葉片和葉枕部能夠觀察到微弱的藍(lán)色，說明在非脅迫條件下啟動子活性很弱，在大多數(shù)組織中不表達(dá)。此結(jié)果和基因qRT-PCR表達(dá)分析的結(jié)果(圖2-A)相印證。

A、B、C、D、E、F分別示野生型水稻根、莖、葉片、葉枕、穎花和種子的GUS染色結(jié)果；G、H、I、J、K、L分別示OsRZFP34pro::GUS轉(zhuǎn)導(dǎo)水稻的根、莖、葉片、葉枕、穎花和種子的GUS染色結(jié)果。

2.5　不同脅迫處理對OsRZFP34啟動子活性的影響

OsRZFP34pro::GUS轉(zhuǎn)基因水稻幼苗在不同脅迫條件下處理4 h后，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色和GUS酶活性定量檢測。結(jié)果(圖5)顯示：對照組(28 ℃)水稻幼苗經(jīng)GUS染色后，僅在幼苗葉片、葉鞘和胚芽鞘中呈現(xiàn)較弱的淺藍(lán)色，而經(jīng)脅迫處理的幼苗地上部分均呈現(xiàn)較深的藍(lán)色，其中高溫(42 ℃)處理的幼苗呈現(xiàn)的藍(lán)色最深，ABA處理的幼苗呈現(xiàn)的藍(lán)色最淺。GUS酶活性定量檢測的結(jié)果(圖6)與GUS染色結(jié)果一致，高溫處理后的GUS酶活性最高，約為對照組(136.273)的3.3倍，經(jīng)低溫、PEG、高鹽和ABA處理的轉(zhuǎn)基因幼苗的GUS酶活性分別為對照組的2.6倍、2.2倍、2.4倍和1.7倍，并具有顯著性差異。以上結(jié)果表明，啟動子是受多種脅迫誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型啟動子。

A　WT野生型；B CK(28 ℃)；C 42 ℃高溫處理；D 4 ℃處理；E 10% PEG6000處理；F 100 mmol/LNaCl處理；G 100 μmol/L ABA處理。

圖6　OsRZFP34pro::GUS轉(zhuǎn)基因水稻幼苗在不同脅迫處理下的GUS酶活性

3　結(jié)論與討論

研究表明，許多環(huán)鋅指蛋白基因受逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，并通過ABA依賴的途徑在植物的逆境脅迫響應(yīng)過程中起重要作用[15-16]。白菜()的表達(dá)受到低溫、鹽和ABA的誘導(dǎo)，過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草提高了對低溫、鹽和脫水脅迫的耐受力[17]。前人[11]研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫和ABA處理均能誘導(dǎo)的表達(dá)，的過表達(dá)是通過增大高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻植株氣孔的張開程度來降低葉片溫度。本研究中，的表達(dá)不但受高溫和ABA誘導(dǎo)，也能被低溫、PEG和高鹽誘導(dǎo)，說明是多逆境誘導(dǎo)基因，可能通過ABA依賴途徑在植物多種逆境響應(yīng)的過程中發(fā)揮作用，這為后續(xù)的研究提供了參考方向。

HSE是熱激轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件，調(diào)控植物的熱激響應(yīng)。在熱激響應(yīng)基因的啟動子上可能存在完美型的HSE元件，也可能存在非完美型的HSE元件[18-19]。在一些高溫誘導(dǎo)基因的啟動子上，CCAAT- box與HSEs協(xié)同作用，增強(qiáng)啟動子的活性[20-21]。在嗜熱四膜蟲()-啟動子上，除了存在2個常規(guī)的HSEs外，還存在GATA- motif簇，后者對該基因的熱激響應(yīng)至關(guān)重要[22]。本研究中，GUS組織染色分析和GUS酶活性檢測的結(jié)果顯示，啟動子活性受高溫的誘導(dǎo)。但序列分析結(jié)果顯示，啟動子上不存在上述形式的HSE元件，可能在其啟動子上存在某種尚未鑒定的非完美形式的HSE元件。此外，的啟動子上存在10個CCAAT-box和6個GATA- motif，可能與其高溫誘導(dǎo)性密切相關(guān)。

本研究結(jié)果表明，低溫、干旱和鹽脅迫能夠提高啟動子調(diào)控的GUS酶活性，可能與其序列上存在多種與逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件(CRT/DRE、MYCCONSENSUSAT、ACGT- element、MYB1AT、MYBCORE和MYCATERD1)相關(guān)。CRT/DRE元件是CBFs轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，在植物的低溫響應(yīng)中起重要作用[23-26]。此外，CRT/DRE元件也參與植物的干旱/脫水響應(yīng)[25]。MYCCONSENSUSAT元件與玉米啟動子的低溫誘導(dǎo)相關(guān)[27]。MYBCORE基序參與白樺的鹽滲透脅迫響應(yīng)[28]。MYCCONSENSUSAT和MYB1AT元件與白樺啟動子的干旱誘導(dǎo)活性相關(guān)[29]。此外，啟動子上存在有6個GT1GMSCAM4元件，可能對在鹽脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)起到調(diào)控作用。研究表明，GT1GMSCAM4元件在甜瓜[30]和白樺[29]啟動子鹽脅迫條件下誘導(dǎo)GUS報告基因的表達(dá)中起作用。

ABA、茉莉酸(JA)、赤霉素(GAs)和生長素是調(diào)控植物逆境脅迫響應(yīng)的重要植物激素[31-35]，并且各種植物激素之間還存在相互聯(lián)系和制約，產(chǎn)生交叉效應(yīng)，共同調(diào)控植物的逆境脅迫響應(yīng)[36-37]?；騿幼由戏植加信cABA信號、JA信號、GA響應(yīng)和生長素響應(yīng)相關(guān)的元件，意味著可能通過參與這些激素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)植物的非生物脅迫響應(yīng)，這還需要后續(xù)的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

此外，STRE[18,38]、W-box[39-40]、CGCG-box[41]和ABRERATCAL[42]都是與植物逆境應(yīng)答相關(guān)的重要順式作用元件，可能對基因啟動子在逆境脅迫下活性的誘導(dǎo)起作用。

綜上，是多逆境誘導(dǎo)基因，其啟動子是受多種逆境脅迫誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型啟動子，在正常條件下只有微弱活性，可作為誘導(dǎo)型啟動子用于科研與生產(chǎn)實(shí)踐。

[1] 陸瑜．植物中RING型鋅指蛋白研究進(jìn)展[J]．安徽農(nóng)學(xué)通報，2017，23(8)：36-39． LU Y．Research progress of RING-type zinc finger protein in plants[J]．Anhui Agricultural Science Bulletin，2017，23(8)：36-39．

[2] SUN J H，SUN Y H，AHMED R I，et al．Research progress on plant RING-finger proteins[J]．Genes，2019，10(12)：973．

[3] YANG X H，SUN C，HU Y L，et al．Molecular cloning and characterization of a gene encoding RING zinc finger ankyrin protein from drought-tolerant[J]. Journal of Biosciences，2008，33(1)：103-112．

[4] BRUGIèRE N，ZHANG W J，XU Q Z，et al. Overexpression of RING domain E3 ligase ZmXerico1 confers drought tolerance through regulation of ABA homeostasis[J]．Plant Physiology，2017，175(3)：1350-1369．

[5] FANG H M，MENG Q L，ZHANG H S，et al. Knock- down of a RING finger gene confers cold tolerance[J]. Bioengineered，2016，7(1)：39-45．

[6] JU H W，MIN J H，CHUNG M S，et al．Themutation of the novel RING-type E3 ubiquitin ligase increases proline contents and enhances drought tolerance in[J]．Plant Science，2013，203/204：1-7．

[7] PARK Y C，CHAPAGAIN S，JANG C S．A negative regulator in response to salinity in rice：salt-，ABA- and drought-induced RING finger protein 1(OsSADR1)[J]．Plant and Cell Physiology，2018，59(3)：575-589．

[8] 李田，孫景寬，劉京濤．植物啟動子研究進(jìn)展[J]．生物技術(shù)通報，2015(2)：18-25． LI T，SUN J K，LIU J T．Research advances on plant promoter[J]．Biotechnology Bulletin，2015(2)：18-25．

[9] LI F，HAN Y Y，F(xiàn)ENG Y N，et al．Expression of wheat expansin driven by the RD29 promoter in tobacco confers water-stress tolerance without impacting growth and development[J]．Journal of Biotechnology，2013，163(3)：281-291．

[10] PINO M T，SKINNER J S，PARK E J，et al．Use of a stress inducible promoter to drive ectopicexpression improves potato freezing tolerance while minimizing negative effects on tuber yield[J]．Plant Biotechnology Journal，2007，5(5)：591-604．

[11] HSU K H，LIU C C，WU S J，et al．Expression of a gene encoding a rice RING zinc-finger protein，OsRZFP34，enhances stomata opening[J]．Plant Molecular Biology，2014，86(1/2)：125-137．

[12] 鄒杰，李生強(qiáng)，劉顯軍，等．水稻基因生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析 [J] 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2019，27(12)：2130-2139．ZOU J，LI S Q，LIU X J，et al．Bioinformatics analysis，subcellular localization and expression analysis ofgene in rice()[J]．Journal of Agricultural Biotechnology，2019，27(12)：2130-2139．

[13] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D．Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCtmethod[J]．Methods，2001，25(4)：402-408．

[14] 黃真池，盧向陽，曾富華，等．受病原物誘導(dǎo)的植物啟動子在轉(zhuǎn)基因辣椒中的活性[J]，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2008，34(3)：270-273．

HUANG Z C，LU X Y，ZENG F H，et al．Activation of pathogen-inducible plant promoters () in transgenic pepper[J]．Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences)，2008，34(3)：270-273．

[15] RYU M Y，CHO S K，KIM W T．TheC3H2C3-type RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP1 is a positive regulator of an abscisic acid-dependent response to drought stress[J]．Plant Physiology，2010，154(4)：1983-1997．

[16] XIA Z L，LIU Q J，WU J Y，et al．ZmRFP1，the putative ortholog of，encodes a RING-H2 E3 ubiquitin ligase and responds to drought stress in an ABA- dependent manner in maize[J]．Gene，2012，495(2)：146-153．

[17] JUNG Y J，LEE I H，NOU I S，et al．BrRZFP1 aC3HC4-type RING zinc finger protein involved in cold，salt and dehydration stress[J]．Plant Biology，2013，15(2)：274-283．

[18] GUO L H，CHEN S N，LIU K H，et al．Isolation of heat shock factor HsfA1a-binding sites in vivo revealed variations of heat shock elements in[J]．Plant & Cell Physiology，2008，49(9)：1306-1315．

[19] MITTAL D，ENOKI Y，LAVANIA D，et al．Binding affinities and interactions among different heat shock element types and heat shock factors in rice (L.)[J]．The FEBS Journal，2011，278(17)：3076-3085．

[20] KHURANA N，CHAUHAN H，KHURANA P．Wheat chloroplast targeted sHSP26 promoter confers heat and abiotic stress inducible expression in transgenicplants[J]．PLoS One，2013，8(1)：e54418．

[21] RIEPING M，SCH?FFL F．Synergistic effect of upstream sequences，CCAAT box elements，and HSE sequences for enhanced expression of chimaeric heat shock genes in transgenic tobacco[J]．Molecular & General Genetics，1992，231(2)：226-232．

[22] BARCHETTA S，LA TERZA A，BALLARINI P，et al. Combination of two regulatory elements in theHSP70-1 gene controls heat shock activation[J]．Eukaryotic Cell，2008，7(2)：379-386．

[23] WANG P J，CHEN X J，GUO Y C，et al．Identification of CBF transcription factors in tea plants and a survey of potential CBF target genes under low temperature[J]. International Journal of Molecular Sciences，2019，20(20)：5137．

[24] LI M, XIE C H, SONG B T, et al. Construction of efficient, tuber-specific, and cold-inducible promoters in potato[J]. Plant Science, 2015, 235: 14-24.

[25] JIN R，KIM B H，JI C Y，et al．Overexpressingincreases low temperature and drought stress tolerance in transgenic sweetpotato[J]．Plant Physiology and Bio- chemistry，2017，118：45-54．

[26] LI M，XIE C H，SONG B T，et al．Construction of efficient，tuber-specific，and cold-inducible promoters in potato[J]．Plant Science，2015，235：14-24．

[27] LIU J L，WANG F T，YU G，et al．Functional analysis of the maize C-repeat/DRE motif-binding transcription factor CBF3 promoter in response to abiotic stress[J]. International Journal of Molecular Sciences，2015，16(6)：12131-12146．

[28] WANG Y M，WANG C，GUO H Y，et al．BplMYB46 fromcan form homodimers and heterodimers and is involved in salt and osmotic stresses[J]. International Journal of Molecular Sciences，2019，20(5)：1171．

[29] 秦琳琳，張曦，姜騁，等．白樺基因啟動子克隆和逆境響應(yīng)元件功能分析[J]．植物研究，2019，39(6)：917-926． QIN L L，ZHANG X，JIANG C，et al．Cloning and functional analysis ofpromoter from birch ()[J]．Bulletin of Botanical Research，2019，39(6)：917-926．

[30] WANG C，GAO G，CAO S，et al．Isolation and functional validation of the CmLOX08 promoter associated with signalling molecule and abiotic stress responses in oriental melon，var．Makino[J]. BMC Plant Biology，2019，19(1)：75．

[31] ULLAH A，MANGHWAR H，SHABAN M，et al. Phytohormones enhanced drought tolerance in plants：a coping strategy[J]．Environmental Science and Pollution Research International，2018，25(33)：33103-33118.

[32] COLEBROOK E H，THOMAS S G，PHILLIPS A L，et al．The role of gibberellin signalling in plant responses to abiotic stress[J]．The Journal of Experimental Biology，2014，217(Pt 1)：67-75．

[33] BLAKESLEE J J，SPATOLA ROSSI T，KRIECHBAU- MER V．Auxin biosynthesis：spatial regulation and adaptation to stress[J]．Journal of Experimental Botany，2019，70(19)：5041-5049．

[34] RUAN J J，ZHOU Y X，ZHOU M L，et al．Jasmonic acid signaling pathway in plants[J]．International Journal of Molecular Sciences，2019，20(10)：2479．

[35] AGARWAL P K，JHA B．Transcription factors in plants and ABA dependent and independent abiotic stress signalling[J]．Biologia Plantarum，2010，54(2)：201-212．

[36] VERMA V，RAVINDRAN P，KUMAR P P．Plant hormone-mediated regulation of stress responses[J]. BMC Plant Biology，2016，16：86．

[37] KU Y S，SINTAHA M，CHEUNG M Y，et al．Plant hormone signaling crosstalks between biotic and abiotic stress responses[J]．International Journal of Molecular Sciences，2018，19(10)：3206．

[38] WATANABE M，TAMURA K，MAGBANUA J P，et al. Elevated expression of genes under the control of stress response element (STRE) and Msn2p in an ethanol- tolerance sake yeast Kyokai no．11[J]．Journal of Bioscience and Bioengineering，2007，104(3)：163-170．

[39] JIANG J J，MA S H，YE N H，et al．WRKY transcription factors in plant responses to stresses[J]．Journal of Integrative Plant Biology，2017，59(2)：86-101．

[40] SHI W Y，DU Y T，MA J，et al．The WRKY transcription factor GmWRKY12 confers drought and salt tolerance in soybean[J]．International Journal of Molecular Sciences，2018，19(12)：4087．

[41] YANG T B，POOVAIAH B W．A calmodulin-binding/ CGCG box DNA-binding protein family involved in multiple signaling pathways in plants[J]．Journal of Biological Chemistry，2002，277(47)：45049-45058．

[42] KAPLAN B，DAVYDOV O，KNIGHT H，et al．Rapid transcriptome changes induced by cytosolic Ca2+transients reveal ABRE-related sequences as Ca2+-responsive cis elements in[J]．The Plant Cell，2006，18(10)：2733-2748．

Expression patterns ofunder diverse stress treatments and its promoter’s cloning and characterization

ZOU Jie1,2, LIU Yuan3

(1.College of Life Science and Environmental Resources, Yichun University, Yichun, Jiangxi 336000, China; 2.Jiangxi Provincial Key Laboratory of Crop Growth and Development Regulation, Yichun, Jiangxi 336000, China; 3.Yichun Vocational Technical College, Yichun, Jiangxi 336000, China)

In this study, qRT-PCR was used to analyze the expression patterns ofunder various conditions including the high temperature (42 ℃), low temperature (4 ℃), simulated drought with 10% polyethylene glycol (PEG) 6000, salt (100 mmol/L NaCl) and ABA (100 μmol/L) treatments. The promoter ofwas cloned and its sequence was analyzed using online software New PLACE and PlantCARE; The OsRZFP34pro::GUS expression vector was constructed and transformed into rice; The activities ofpromoter drivinggene expression under different stress conditions were analyzed by histochemical assay and GUS enzyme detection. The results of qRT-PCR showed that the expression ofcould be induced by the above treatments. High temperature stress had the strongest induction on the expression of, while ABA had only a weak induction on its expression. The results of the-regulatory element analysis show that, the promoter sequence contains a number of elements related to stress response, hormone response and Ca2+signal transduction. The results of histochemical assay and quantitative GUS fluorescence analysis showed that the activity ofpromoter was regulated by high temperature, low temperature, PEG, salt and ABA treatments, which indicated thatpromoter was a multi-stress-inducible promoter.

rice;; stress inducible; expression pattern; promoter;-regulatory elements

S511；Q786

A

1007-1032(2020)06-0670-09

鄒杰，劉媛．水稻基因逆境表達(dá)特征及其啟動子的克隆與分析[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2020，46(6)：670-678．

ZOU J, LIU Y. Expression patterns ofunder diverse stress treatments and its promoter’s cloning and characterization[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(6): 670-678.

http://xb.hunau.edu.cn

2019-11-26

2020-01-08

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460061)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20142BAB214014)

鄒杰(1981—)，男，廣西賀州人，博士，講師，主要從事作物分子遺傳育種和抗逆生理研究，jetzou@126.com

10.13331/j.cnki.jhau.2020.06.006

責(zé)任編輯：毛友純

英文編輯：柳正