NF-κB表達(dá)在胰腺癌的診斷和預(yù)后中的價(jià)值*

郭江福，范偉，張瑩

(貴州省人民醫(yī)院 急診外科，貴州 貴陽 550002)

研究報(bào)道，我國(guó)消化道惡性腫瘤發(fā)生率逐年上升，胰腺癌發(fā)生率也逐年上升[1-2]，其5年生存率僅1%～3%。與其他惡性腫瘤一樣，腫瘤的預(yù)后與腫瘤細(xì)胞的分期、組織免疫以及生物化學(xué)特征有關(guān)[3-4]。研究認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄因子B(nuclearfactor kappa B，NF-κB)在人體固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)上發(fā)揮重要作用，是引起人體炎癥、腫瘤的關(guān)鍵點(diǎn)[5-7]。最新的研究也顯示NF-κB在胰腺炎等胰腺疾病中也發(fā)揮重要作用[8-10]。本研究選擇2014年4月—2016年7月收集的胰腺癌樣本及相應(yīng)癌旁組織各67例、良性胰腺腫瘤樣本45例，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)NF-κB在3組標(biāo)本中的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)其對(duì)胰腺癌診斷、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中的評(píng)估價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料、主要試劑及儀器

1.1.1臨床資料 2014年4月—2016年7月進(jìn)行手術(shù)、2018年7—12月復(fù)診隨訪患者(≥24個(gè)月)的保存完好的胰腺癌樣本67例、相應(yīng)病例癌旁樣本67例，另選擇同期良性胰腺囊腫及胰腺炎等手術(shù)患者的標(biāo)本45例。要求所有的組織標(biāo)本保存完好、患者和(或)家屬知情同意、病理診斷明確和臨床確診，胰腺癌患者為原發(fā)胰腺癌、術(shù)后隨訪時(shí)間≥24個(gè)月。胰腺癌組(含癌旁組織)男44例、年齡女23例，41～89歲、平均(61.4±9.6)歲，高分化16例、中分化34例、低分化17例；同期手術(shù)的良性胰腺疾病手術(shù)標(biāo)本45例，男30例、女15例，年齡37～88歲、平均(58.4±12.4)歲；2組患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2主要試劑與儀器 兔抗人多克隆抗體(上海信裕生物科技有限公司，Abcam)、PBS沖洗液(北京百靈克生物科技有限公司，博士德，AR0194-10)、RM2235石蠟切片機(jī)(瑞沃德生命科技有限公司，Leica)、BX51型顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司，Olympus)、HGPN-II,HGPF隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 方法

組織標(biāo)本采用4%中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋，4 μm切片、HE染色。采用高溫高壓法進(jìn)行抗原修復(fù)、DAB顯色，采用NF-KF即用型抗體，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。主要步驟：(1)石蠟切片脫蠟、水化，PBS沖洗3次，每次4～5 min；(2)每張切片滴加3%過氧化氫，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下孵育10～15 min，PBS沖洗3次、每次3～5 min；(3)切片加入抗原修復(fù)液、微波爐加熱，92～97 ℃持續(xù)10～15 min；(4)室溫冷卻20～30 min、PBS沖洗，滴加一抗、室溫孵育60 min，PBS沖洗3次、每次3～5 min；(5)每張切片滴加二抗、室溫下孵育30～60 min，PBS沖洗3次、每次3～5 min；(6)滴加新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察，蒸餾水沖洗，蘇木素染色，梯度酒精脫水，中性樹膠固定。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察胰腺癌癌組織、相應(yīng)癌旁組織及胰腺良性疾病組織標(biāo)本中NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度(Uc)、計(jì)算NF-κB陽性細(xì)胞百分率、制作受試者工作特征(ROC)曲線及計(jì)算截?cái)嘀?，分析NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)水平對(duì)胰腺癌診斷的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值及符合率；胰腺癌患者術(shù)后隨訪24個(gè)月，觀察胰腺癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)水平的關(guān)系。NF-κB陽性細(xì)胞Uc：NF-κB染色定位于癌細(xì)胞的胞漿、胞核，呈棕黃色或棕褐色，細(xì)胞著色越深，則蛋白表達(dá)越強(qiáng)；40×10倍顯微鏡計(jì)算5 mm×10 mm網(wǎng)絡(luò)微格中的陽性細(xì)胞百分率，陽性細(xì)胞數(shù)<25或不著色為影響(-)、陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%或胞漿染色棕黃色為弱陽性(+)、陽性細(xì)胞數(shù)50%～70%或胞漿棕黃色為中等陽性(++)、陽性細(xì)胞數(shù)70%以上或胞漿棕褐色為強(qiáng)陽性(+++)。NF-κB陽性細(xì)胞的分級(jí)采用積分制度:“-”、“+”、“++”、“+++”分別計(jì)作為1、2、3、4分。陽性細(xì)胞百分率=所有的陽性細(xì)胞積分/(陽性細(xì)胞數(shù)×4)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，NF-κB陽性細(xì)胞采用中位數(shù)與四分位距M(P25～P75)表示，不同樣本的NF-κB表達(dá)分級(jí)比較采用秩和檢驗(yàn)，鑒別診斷效用采用描述性分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)

胰腺癌組織NF-κB表達(dá)強(qiáng)度(++～+++)高于癌旁組織(Uc=2.866，P<0.05)、良性胰腺疾病(Uc=4.330 1，P<0.001)，癌旁組織的Uc值高于良性胰腺疾病(Uc=2.278，P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 胰腺癌及相應(yīng)癌旁組織、胰腺良性疾病組織NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)Fig.1 NF-κB expression levels in pancreatic cancer tissues, their corresponding adjacent tissues，and pancreatic benign tissues

表1 胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織、良性胰腺疾病組織標(biāo)本中NF-κB陽性細(xì)胞[n(%)]Tab.1 Expression intensity of NF-κB in pancreatic cancer tissues, their corresponding adjacent tissues，and pancreatic benign tissues[n(%)]

2.2 NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)水平對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值

胰腺癌組織與良性胰腺疾病的NF-κB表達(dá)水平截?cái)嘀禐?2%，ROC下曲線面積為0.842。見圖2。置信區(qū)間(0.769～0.915，P<0.001)，診斷靈敏度91.0%(61/67)，特異度75.6%(34/45)，陽性預(yù)測(cè)值84.7%(61/72)，符合率84.8%(95/112)。

圖2 胰腺癌患者NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)水平的ROC曲線Fig.2 ROC curve analysis of the diagnosis value of NF-κB expression levels in patients with pancreatic cancer

2.3 胰腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)與NF-κB陽性細(xì)胞的表達(dá)

胰腺癌患者確診時(shí)，已經(jīng)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，NF-κB陽性細(xì)胞分級(jí)為(NF-κB陽性細(xì)胞百分比)44%(38～64)，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者[43例，NF-κB陽性細(xì)胞分級(jí)29%(16～41)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.445，P<0.001)；術(shù)后隨訪24個(gè)月，胰腺癌患者發(fā)生腫瘤擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)40例，NF-κB陽性細(xì)胞百分比42%(36～62)，高于無瘤生存的患者[27例，NF-κB陽性細(xì)胞百分率30%(17～42)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.412，P<0.05)。

3 討論

NF-κB是一種具有多方向性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的蛋白子因子，參與了機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)及細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡等重要病理生理過程，NF-κB在肺非小細(xì)胞癌、前列腺癌、胰腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)[11-12]。有研究表明，NF-κB在胰腺癌組織中高表達(dá)，但其在胰腺癌組織種所起作用尚未明確[13-16]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)組織及細(xì)胞發(fā)生炎癥等改變時(shí)會(huì)持續(xù)激活NF-κB促細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變，而NF-κB信號(hào)通路的持續(xù)激活會(huì)抑制細(xì)胞凋亡、刺激細(xì)胞的突變，其中NF-κB p65可能在胰腺癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用[17-19]。另一方面，當(dāng)NF-κB被激活后，可以促進(jìn)多種炎癥因子、抗凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄，影響下游IL-6、IL-8、TNF-α、BCL-xL等蛋白的表達(dá)，這些蛋白表達(dá)異常將會(huì)增加細(xì)胞的突變率[20-21]，促使胰腺癌發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果提示：胰腺癌組織NF-κB表達(dá)強(qiáng)度分級(jí)以及表達(dá)水平高于癌旁組織、良性胰腺疾病，而癌旁組織高于良性胰腺疾?。籒F-κB在胰腺良性疾病中亦有表達(dá)，認(rèn)為這可能與胰腺疾病時(shí)存在炎癥反應(yīng)有關(guān)，且表達(dá)水平也明顯低于胰腺癌。

本實(shí)驗(yàn)ROC結(jié)果顯示，胰腺癌組織與良性胰腺疾病的NF-κB表達(dá)水平截?cái)嘀禐?2%，以此作為鑒別診斷依據(jù)，其中診斷胰腺癌靈敏度91.0%、特異度75.6%、符合率84.8%，高于其他文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果[22-23]，這可能與診斷的依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差異有關(guān)，本次研究中采用積分截?cái)嘀颠M(jìn)行診斷，而其他文獻(xiàn)單純的采用陽性表達(dá)進(jìn)行鑒別診斷。NF-κB在腫瘤發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞因子分析中屬于中間段，其在炎癥、惡性病變中均發(fā)揮作用，良性胰腺病變也會(huì)出現(xiàn)較高的NF-κB表達(dá)[24-25]。因此，單純根據(jù)陽性表達(dá)鑒別診斷胰腺癌容易導(dǎo)致假陽性。因此，欲提高診斷效用，可聯(lián)合NF-κB上下游蛋白的檢測(cè)。

本研究中，確診時(shí)胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的NF-κB表達(dá)水平高于無轉(zhuǎn)移患者，術(shù)后隨訪24個(gè)月時(shí)胰腺癌出現(xiàn)擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)患者NF-κB表達(dá)水平高于無瘤生存患者(P<0.05)，提示NF-κB表達(dá)水平可作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的輔助判斷依據(jù)，還可用于判斷患者的預(yù)后，NF-κB高表達(dá)的患者出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)更高。有學(xué)者認(rèn)為NF-κB表達(dá)可能與急性胰腺炎癥關(guān)系更為密切，即胰腺炎癥病情越嚴(yán)重，胰腺中NF-κB表達(dá)也越較高[26-27]。因此，檢測(cè)組織標(biāo)本的NF-κB表達(dá)水平時(shí)，還應(yīng)考慮患者的病史。