張林，侯艷紅，李春梅，劉浩潤(rùn)

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心，北京 100091

近年胰腺癌發(fā)病率及病死率呈快速上升趨勢(shì)[1]，加之治療效果差，臨床5年生存率在各種惡性腫瘤中最低，急需治療效果更好且毒性更小的治療方法。隨著分子靶向治療的迅速興起，目前部分分子靶向治療的效果顛覆了人類過去的認(rèn)知，針對(duì)胰腺癌的分子靶向治療研究也成為了新的熱點(diǎn)。我們前期研究顯示[2-3]，表面偶聯(lián)抗表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體以及黏性蛋白1(MUC1)單抗的載吉西他濱聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒對(duì)裸鼠胰腺癌種植瘤均有一定的靶向性和抑瘤作用。糖類抗原199(CA199)是目前針對(duì)胰腺癌特異性最好的血清腫瘤標(biāo)志物，國(guó)內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)、預(yù)后判斷[4-5]，也有研究將其作為治療的靶向分子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。CA199本身就是由MUC1分子部分糖蛋白變異形成的，其中一些脫落入血，便可在血清中檢測(cè)到而成為腫瘤標(biāo)志抗原[6]。胰腺癌患者血清CA199升高明顯，且隨病情變化而發(fā)生變化，提示CA199可能成為治療的靶標(biāo)。2019年8—11月，我們將MUC1與CA199單克隆抗體偶聯(lián)吉西他濱聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒(MUC1-GEM-PBCA-NP、CA199-GEM-PBCA-NP)注入胰腺癌種植瘤裸鼠體內(nèi)，比較兩者抑制胰腺癌種植瘤的作用，旨在比較MUC1和CA199單克隆抗體修飾載藥納米粒的再導(dǎo)向治療作用強(qiáng)弱。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c裸鼠65只，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)條件：實(shí)驗(yàn)室溫度(22～25)℃，相對(duì)濕度40%～70%RH，相對(duì)空氣壓力10～20 Pa，空氣交換頻率10～15次/小時(shí)，備有中央空調(diào)和空氣過濾機(jī)械設(shè)備，動(dòng)物籠具、飲水、墊料、飲用水等均經(jīng)高壓蒸汽消毒，每籠3只鼠，飼以SPF級(jí)專用顆粒飼料，自由飲水。

1.2 抗體、試劑及儀器 MUC1單克隆抗體(Abnova公司)，CA199單克隆抗體(Abcam公司)，α-氰基丙烯酸正丁酯(BCA，北京瞬康醫(yī)用膠有限公司)；人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1(北京富眾科技發(fā)展有限公司)，細(xì)胞培養(yǎng)于含胎牛血清、青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中；85-2恒溫加熱磁力攪拌器(上海志威電器有限公司)，Dextran-70、PluronicF-127(德國(guó)BASF公司)，吲哚菁綠(Cy3，上海晶純生化科技股份有限公司)，微孔濾膜(欣惠澤奧有限公司)，Zetasizer-Nano ZS90型激光粒徑分析儀(英國(guó)馬爾文公司)，IX71熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 CA199-GEM-PBCA-NP、MUC1-GEM-PBCA-NP及相應(yīng)熒光納米粒子的制備 GEM-PBCA-NP的具體制備方法參考本研究組李春梅等[3]的實(shí)驗(yàn)方法。制備完成后用激光散射粒度分析儀來觀察微球粒徑的大小及分布，并計(jì)算包封率及載藥率。熒光納米粒子的制備同樣參考本研究組李春梅等[3]的實(shí)驗(yàn)方法：滅菌水溶解Dxtran-70、PluronicF-127及Cy3作為水相，余制備方式同GEM-PBCA-NP的制備，制備備用含熒光Cy3-PBCA-NP(0.5 mg/mL)，抗MUC1及抗修飾的熒光納米粒方式同MUC1-GEM-PBCA-NP的制備。按前述方法所得到的納米粒電鏡下觀察形態(tài)表現(xiàn)為光滑的球形，藥物均勻地分散在聚合物基質(zhì)中。GEM-PBCA-NP、MUC1-GEM-PBCA-NP和CA199-GEM-PBCA-NP納米粒的平均尺寸分別為(48.80±5.64)、(56.37±5.66)、(57.25±5.81)nm。GEM的包封率和載藥量在GEM-PBCA-NP、MUC1-GEM-PBCA-NP、CA199-GEM-PBCA-NP納米粒分別為47.35%±5.14%、46.22%±4.13%、45.57%±4.96%，8.15%±0.84%、6.96%±0.76%、7.05%±0.69%，表面修飾后納米粒子并無明顯變化。成功制備了MUC1-GEM-PBCA-NP和CA199-GEM-PBCA-NP靶向載藥納米粒子。

1.4 裸鼠胰腺癌種植瘤模型制備 參照李春梅等[3]的方法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞，PBS洗滌3次，重懸于PBS中并調(diào)整濃度為6×107/mL。于每只裸鼠右側(cè)腋部皮下注射0.2 mL細(xì)胞懸液，觀察成瘤情況。7～10 d成瘤(瘤體直徑>0.5 cm為制備成功的標(biāo)準(zhǔn))，分組治療前統(tǒng)一建模，建模不成功者直接剔除。制備成功55只裸鼠(實(shí)驗(yàn)分組共需51只，另4只用于抵補(bǔ)到出現(xiàn)觀察期中死亡及其他原因退出實(shí)驗(yàn)的裸鼠)，而后按下述分組情況開始分組治療。

1.5 裸鼠分組及MUC1-GEM-PBCA-NP、CA199-GEM-PBCA-NP靜注方法和腫瘤體積測(cè)量、抑瘤率計(jì)算 ①腫瘤體積測(cè)量：將制模成功的裸鼠隨機(jī)分為6組各7只。A組：按吉西他濱2.5 mg/kg等劑量的MUC1-GEM-PBCA-NP經(jīng)尾靜脈注射；B組：按吉西他濱2.5 mg/kg等劑量的CA199-GEM-PBCA-NP經(jīng)尾靜脈注射；C組：等量GEM-PBCA-NP經(jīng)尾靜脈注射；D組：吉西他濱2.5 mg/kg量經(jīng)尾靜脈注射；E組：等量PBCA-NP經(jīng)尾靜脈注射；F組：等量生理鹽水經(jīng)尾靜脈注射為空白對(duì)照。每5 d重復(fù)治療1次，每3 d測(cè)量每只動(dòng)物腫瘤長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，腫瘤體積V=a×b2/2。②移植瘤抑瘤率計(jì)算：若實(shí)驗(yàn)過程中有荷瘤鼠死亡，及時(shí)估計(jì)并記錄死亡時(shí)間、解剖以進(jìn)行尸檢。如果不能及時(shí)解剖，則先放入-20 ℃冰箱以減少組織自溶；至藥物治療開始第35 d實(shí)驗(yàn)終末，根據(jù)動(dòng)物福利，應(yīng)實(shí)行安樂死，每組7只動(dòng)物均處死。剝離瘤體稱重，抑瘤率=[(對(duì)照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重)/對(duì)照組瘤重]×100%。

1.6 裸鼠分組及MUC1-GEM-PBCA-NP、CA199-GEM-PBCA-NP靜注方法和移植瘤熒光納米粒子分布檢測(cè) 另取9只荷瘤裸鼠分為3組各3只。a組：尾靜脈注射MUC1-Cy3-PBCA-NP溶液(10 mg/kg)；b組：尾靜脈注射CA199-Cy3-PBCA-NP溶液(10 mg/kg)；c組：注射等量Cy3-PBCA-NP。于注射后5 h處死裸鼠，取腫瘤組織，用生理鹽水充分沖洗避免殘留血液及組織液影響熒光檢測(cè)，濾紙吸干多余水分，迅速放入液氮中冷凍、隨后將冰凍組織切片，將組織切片貼于載玻片后，用P0126封片，置于倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)激發(fā)Cy3所發(fā)的熒光，軟件測(cè)定熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 各組腫瘤體積、抑瘤率比較 腫瘤體積、抑瘤率比較見表1。

表1 各組腫瘤體積、抑瘤率比較

2.2 各組Cy3熒光信號(hào)強(qiáng)度比較 a、b、c三組的熒光強(qiáng)度分別為34.92±4.41、17.15±2.6、4.82±0.73，a組與其余兩組比較，a、b組比較，P均<0.05。a組主要定為于細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)中；b組Cy3熒光信號(hào)強(qiáng)度弱于a組，且主要定為于細(xì)胞胞膜，胞質(zhì)中熒光信號(hào)較弱；c組Cy3熒光信號(hào)微弱，僅部分細(xì)胞胞膜的可見。詳見圖1。

注：a為a組，b為b組，c為c組。

3 討論

胰腺癌是目前世界范圍內(nèi)預(yù)后及治療效果最差的惡性腫瘤[7-8]。盡管廣大臨床和醫(yī)學(xué)科研工作者通過無數(shù)次的嘗試改善胰腺癌患者的預(yù)后，但結(jié)果仍然令人沮喪。為了建立更有效的治療方法，現(xiàn)在全世界范圍內(nèi)也正在進(jìn)行著大量的研究[9]。隨著藥物治療研究的進(jìn)展，對(duì)胰腺癌治療采用新穎的傳統(tǒng)細(xì)胞毒性化療的組合以及配合最新的靶向藥物成為主要方向。五氟類、鉑類、紫杉醇類等已經(jīng)成為世界上廣泛使用的細(xì)胞毒性藥物用于治療泛癌，在臨床證據(jù)確定后這些藥物廣泛用于可切除或不能切除的胰腺癌，但目前輔助化療效果均不佳[10-12]。在靶向藥物方面，除了厄洛替尼，目前還沒有針對(duì)胰腺癌的靶向治療策略。隨著近年來研究者對(duì)藥物的開發(fā)，已經(jīng)做出了積極的嘗試，并開發(fā)出新的治療策略，包括對(duì)可切除或邊界可切除的胰腺癌患者進(jìn)行新輔助化療，多藥聯(lián)合治療晚期胰腺癌患者的姑息化療，以及新的靶向藥物、載藥納米或免疫細(xì)胞治療等多種治療策略[13-15]。

在諸多的研究中，靶向納米載藥系統(tǒng)近年成為一個(gè)主要的方向，已經(jīng)有多項(xiàng)采用納米載藥系統(tǒng)進(jìn)行胰腺癌治療的研究[16]。目前選擇適合的靶向分子是影響治療效果的一個(gè)關(guān)鍵問題，MUC1是胰腺癌靶向治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。研究報(bào)道[17]，MUC1引導(dǎo)的納米粒子在胰腺癌中具有良好的再導(dǎo)向作用。CA199是胰腺癌最為敏感和特異的血清腫瘤標(biāo)志物，與MUC1為同源蛋白。GIRGIS等[18]證實(shí)，CA199修飾的納米粒對(duì)于胰腺癌同樣具有良好的再導(dǎo)向作用。為進(jìn)一步明確這兩種分子作為靶向治療胰腺癌納米粒子靶標(biāo)效果的差異，本研究在控制同等實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行了CA199與MUC1作為靶向分子對(duì)于胰腺癌種植瘤模型動(dòng)物的抑瘤效果比較。我們制備的MUC1-GEM-PBCA-NP和CA199-GEM-PBCA-NP為粒徑<100 nm的載吉西他濱微粒，前期研究[3]發(fā)現(xiàn)這些納米粒已經(jīng)在動(dòng)物體內(nèi)呈良好的組織分布。本研究顯示，MUC1-GEM-PBCA-NP對(duì)于裸鼠胰腺癌種植瘤的抑制作用明顯優(yōu)于CA199-GEM-PBCA-NP，而CA199-GEM-PBCA-NP抑瘤效果也明顯優(yōu)于無靶向性的GEM-PBCA-NP和吉西他濱原料藥物。這一結(jié)果也與我們前期體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致，表明抗MUC1與抗CA199修飾的載藥納米粒對(duì)于模型動(dòng)物體內(nèi)的胰腺癌細(xì)胞均具有一定的殺傷作用，可抑制瘤體生長(zhǎng)，均可作為胰腺癌納米藥物的候選靶向分子；抗MUC1修飾的載藥納米粒對(duì)于動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的抑制作用強(qiáng)于抗CA199，在靶向納米粒的設(shè)計(jì)中可被優(yōu)先選擇。本研究中采用靶向納米粒的熒光示蹤法評(píng)估其再導(dǎo)向作用，抗MUC1修飾的熒光納米粒子可較為高效的結(jié)合于種植瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜并進(jìn)入胞質(zhì)中，體現(xiàn)了較強(qiáng)的熒光信號(hào)，而抗CA199修飾的熒光納米粒子也在種植瘤細(xì)胞細(xì)胞膜上檢測(cè)到一定的熒光信號(hào)，胞質(zhì)中有較弱的信號(hào)，但強(qiáng)度顯著低于抗MUC1修飾組，這一結(jié)果表明抗CA199再導(dǎo)向納米粒結(jié)合到種植瘤細(xì)胞上并進(jìn)入胞內(nèi)發(fā)揮作用的能力較弱。可能的重要原因是由于腫瘤細(xì)胞中的CA199大量分泌入血，在血液中可與抗CA199修飾的納米粒子結(jié)合起到了類似抗原封閉的作用，導(dǎo)致大量納米粒子表面的抗CA199因結(jié)合血清游離抗原而失效，進(jìn)而大大削弱了其再導(dǎo)向作用。

總之，抗MUC1修飾的納米粒具有更強(qiáng)的再導(dǎo)向作用和腫瘤抑制能力。MUC1可能將是針對(duì)胰腺癌開發(fā)納米藥物的重要靶向分子。