汪 濤，周新群，孫君社，2，張志民，2，王民敬，2，胡雪芳，2，裴海生，2，*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計研究院 農(nóng)產(chǎn)品加工工程研究所， 北京 100121；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100121；3.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

黃精(Polygonatumsibiricum，PS)是我國首批進(jìn)入藥食同源目錄的中藥品種，富含多糖、黃酮、多酚、蒽醌、甾體皂苷、生物堿和人體所需的多種氨基酸等重要的活性成分[1]。黃精多糖(Polygonatumsibiricumpolysaccharides，PSPs)是黃精的主要活性成分之一，具有抗氧化[2]、抗衰老[3]、抗疲勞[4]、增強(qiáng)免疫[5]、治療糖尿病[6]和預(yù)防老年癡呆[7]等作用。Long等[8]用生理鹽水和PSPs溶液分別處理荷瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)PSPs通過激活TLR4受體來阻礙肺癌MAPK/NF-kB信號通路，發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用，表明PSPs未來有可能用于預(yù)防肺癌的發(fā)生。

目前，PSPs提取技術(shù)主要集中在熱水浸提、堿提、酶解、微波和超聲波輔助提取等，但美中不足的是這些技術(shù)存在能耗大、效率低、價格昂貴和污染環(huán)境等諸多問題，最關(guān)鍵的是它們很難應(yīng)用于大批量的工業(yè)化生產(chǎn)[9-10]。為了解決這些問題，需要開發(fā)一種新型的提取方法。低共熔溶劑(deep eutectic solvents，DESs)是由氫受體與氫供體按合適比例混合加熱形成的液態(tài)混合溶劑，其凝固點(diǎn)比任何一種配位劑都要低，具有不易揮發(fā)、價格低、毒性小、綠色環(huán)保、容易制備、不需要純化等優(yōu)勢，更重要的是它可以適用于工業(yè)化生產(chǎn)[11-14]。目前，DESs的應(yīng)用主要集中在化工方面，在藥食方面相對較少。Tang等[15]應(yīng)用DESs提取白柏中黃酮類化合物，與熱水浸提法相比較，黃酮類化合物槲皮素、楊梅素和穗花杉雙黃酮提取率分別增加了128.7%、111.7%和111.1%。Chanioti等[16]選取DESs中氯化膽堿- 檸檬酸(DES-CA)和膽堿氯化物- 乳酸(DES-LA)分別提取橄欖渣中酚類化合物，發(fā)現(xiàn)DES-CA提取的總酚含量和抗氧化活性均高于均質(zhì)化、微波、超聲波和高靜水壓力輔助等提取方法。DESs除了提取黃酮、酚類物質(zhì)的應(yīng)用外，已有提取多糖方面的相關(guān)報道，如Saravan等[17]利用DESs結(jié)合亞臨界水提取褐藻多糖，結(jié)果表明在150 ℃、1.99 kPa，含水量70%及液料比36.81 mL/g條件下，褐藻多糖的提取率為14.93%。DESs之所以能夠增加植物活性物質(zhì)溶出，可能與其自身的理化性質(zhì)有關(guān)，DESs黏度低且呈弱酸性；黏度低的溶液有很好的滲透能力，再者弱酸性溶液有輔助分解植物細(xì)胞壁木質(zhì)素及纖維素的作用[18]。但到目前為止，未見其應(yīng)用于提取PSPs的報道。因此，本研究利用DESs提取PSPs，通過響應(yīng)面分析優(yōu)化提取工藝，并通過總抗氧化能力試劑盒法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法和鄰苯三酚自氧化法對其抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為PSPs工業(yè)化提取和功能性研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精(Polygonatumsibiricum)，遼寧澳地森生物工程有限公司。

氯化膽堿，上海國藥控股化學(xué)試劑有限公司；乙二醇、檸檬酸、丙三醇、尿素、草酸、濃硫酸、苯酚、鄰苯三酚、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基、抗壞血酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；總抗氧化能力測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV- 1780型紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；GM- 0.5型隔膜真空泵，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HWS- 26型電熱恒溫水浴鍋，蘇州江東精密儀器有限公司；RE- 52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海上自儀轉(zhuǎn)速表儀表電機(jī)有限公司；AR223CN型電子天平，奧豪斯(常州)儀器有限公司；H1850型臺式離心機(jī)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1PSPs提取方法與測定

熱水浸提法[19]：稱取0.2 g黃精粉(80目)，在溫度80 ℃、液料比1.5 mL/g的條件下提取120 min，重復(fù)提取2次得到黃精多糖。

DESs提取法：稱取0.2 g黃精粉(80目)與DESs混勻，水浴提取。待提取結(jié)束后，加5.0 mL蒸餾水終止反應(yīng)。真空抽濾，收集濾液，蒸發(fā)濃縮，加入無水乙醇至最終含量為80%，靜置醇沉2 h，7 000 r/min離心8 min得到粗多糖。

提取實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用苯酚- 硫酸法[23]測定PSPs含量。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.008 2x+0.028 3，R2=0.999 1。按式(1)計算PSPs提取率:

(1)

式(1)中，ρ，PSPs水溶液質(zhì)量濃度，μg/mL；V，PSPs水溶液體積，mL；d，稀釋倍數(shù)；M1，樣品干質(zhì)量，g。

1.3.2DESs配位劑對PSPs提取率的影響

將乙二醇- 氯化膽堿(DES-EC)、檸檬酸- 氯化膽堿(DES-GC)、丙三醇- 氯化膽堿(DES-CC)、尿素- 氯化膽堿(DES-UC)、草酸- 氯化膽堿(DES-OC)分別按氫受體與氫供體物質(zhì)的量比2.0混勻，在100 ℃水浴至溶解。在溫度80 ℃、液料比20 mL/g、時間30 min條件下，按1.3.1實(shí)驗(yàn)步驟分別提取PSPs并計算提取率。

1.3.3單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計

在DESs配位劑篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別選取DESs配位劑物質(zhì)的量比(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0)、溫度(70、80、90、100、110 ℃)、時間(15、30、45、60、75 min)和液料比(10、20、30、40、50 mL/g)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察各因素對PSPs提取效果的影響，按1.3.1節(jié)實(shí)驗(yàn)步驟分別提取PSPs并計算提取率。

1.3.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定最適溫度，并利用響應(yīng)面分析法對其余3個因素進(jìn)一步優(yōu)化。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計原理，選取尿素- 氯化膽堿物質(zhì)的量比(A)、時間(B)及液料比(C)3個因素為自變量，以PSPs提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，優(yōu)化PSPs的提取工藝，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.5DESs重復(fù)利用實(shí)驗(yàn)

按照1.3.1節(jié)DESs提取PSPs方法，將醇沉離心得到的上清液真空蒸發(fā)至體積不變以回收DESs，根據(jù)1.3.4得到的優(yōu)化工藝條件重復(fù)利用DESs提取PSPs，按式(1)、式(2)計算PSPs提取率和含量。

(2)

式(2)中，ρ，PSPs水溶液含量，μg/mL；V，PSPs水溶液體積，mL；d，稀釋倍數(shù)；M2，粗多糖干質(zhì)量，g。

1.3.6PSPs抗氧化活性測定

(3)

式(3)中，A0，蒸餾水代替樣品的吸光度；Ax0，蒸餾水代替鄰苯三酚的吸光度；Ax，樣品的吸光度。

1.3.6.2 DPPH自由基清除率的測定

取2.0 mL不同質(zhì)量濃度的PSPs與2.0 mL 0.2 mmol/LDPPH溶液混勻，暗反應(yīng)30 min，蒸餾水調(diào)0，在波長517 nm處測定吸光度(Ax)；同樣測定2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液與2.0 mL 體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液的吸光度(A0)，以及2.0 mL不同質(zhì)量濃度的PSPs與70%乙醇溶液的吸光度(Ax0)[21]。按式(4)計算DPPH自由基清除率。

(4)

1.3.6.3 總抗氧化能力測定

根據(jù)總抗氧化能力測定試劑盒操作步驟測定不同質(zhì)量濃度的PSPs總抗氧化能力[22]。按式(5)計算PSPs的總抗氧化能力。

(5)

式(5)中，總抗氧化能力，μg/mL；V反，反應(yīng)液體積，mL；V樣，取樣液體積，mL；d，稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 8.0.6、Origin 2017和SPSS 19對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 DESs配位劑對PSPs提取率的影響分析

DESs選擇不同的配位劑結(jié)合，可以得到具有特定理化性質(zhì)的溶劑。根據(jù)配位劑的性質(zhì)可以將DESs分為3種類型：I類由季銨鹽和MClx形成，該類與金屬鹵化物/咪唑鹽體系類似；Ⅱ類由水合金屬鹵化物與氯化膽堿形成；Ⅲ類由氫受體與氯化膽堿組成，氫受體通常是酰胺、羧酸或醇[11,23]。Ⅰ、Ⅱ類具有金屬離子性質(zhì)，不適合在藥食方面的應(yīng)用，這里主要考察Ⅲ類DESs，在此基礎(chǔ)上選擇乙二醇- 氯化膽(DES-EC)、檸檬酸- 氯化膽堿(DES-GC)、丙三醇- 氯化膽堿(DES-CC)、尿素- 氯化膽堿(DES-UC)、草酸- 氯化膽堿(DES-OC)作為提取PSPs的研究對象。這5種DESs按物質(zhì)的量比2.0混合溶解，在溫度80 ℃、液料比20 mL/g條件下，提取PSPs 30 min，結(jié)果如圖1。DES-UC對PSPs提取效果最好，多糖提取率為15.11%。與熱水浸提得到的PSPs提取率(7.73%)進(jìn)行比較，PSPs提取率由大到小依次為DES-UC、 DES-OC、 DES-CC、 DES-GC、DES-EC、熱水浸提。引起PSPs提取效果差異的原因一方面可能是DESs的理化性質(zhì)，如黏度、極性和溶解度不同；另一方面可能是DESs與PSPs之間的鍵能和靜電作用[24]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇DES-UC作為后續(xù)的研究對象。

圖1 DESs配位劑對PSPs提取率的影響Fig.1 Effect of DESs complexing agent on extraction rate of PSPs

圖2 不同因素對PSPs提取率的影響Fig.2 Effect of different factors on extraction rate of PSPs

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PSPs的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。當(dāng)尿素- 氯化膽堿物質(zhì)的量比小于1.0時，液態(tài)DESs迅速凝固無法與黃精粉混合均勻，不利于PSPs的提取，所以選取物質(zhì)的量比1.0、1.5、2.0、2.5、3.0為研究參數(shù)。由圖2(a)可知，PSPs提取率隨物質(zhì)的量比的增加而減小，與DESs特定的理化性質(zhì)，如酸堿度、溶解度和黏度等對黃精細(xì)胞壁的影響有關(guān)[17,25]。所以本實(shí)驗(yàn)選取尿素- 氯化膽堿物質(zhì)的量比1.0作為后續(xù)研究參數(shù)。

當(dāng)溫度低于70 ℃時，DESs無法形成液態(tài)溶劑，所以選取溫度70、80、90、100、110 ℃為研究參數(shù)。由圖2(b)可知，PSPs提取率隨溫度的升高而降低，可能是溫度過高使PSPs發(fā)生了降解，而且溫度對DESs的黏度、導(dǎo)電率和酸堿度等性質(zhì)也有影響。所以本實(shí)驗(yàn)選取溫度70 ℃作為后續(xù)研究參數(shù)。

由圖2(c)可知在一定的時間范圍內(nèi)，PSPs提取率隨時間的增加而增加；當(dāng)達(dá)到一定時間后，反應(yīng)體系達(dá)到平衡，PSPs提取率隨之降低，可能是提取時間過長使多糖分子發(fā)生了過度降解。PSPs提取率在60 min時達(dá)到最大值，所以本實(shí)驗(yàn)選取時間60 min作為后續(xù)研究參數(shù)。

由圖2(d)可知，PSPs提取率隨液料比增加呈先增加后下降的趨勢，出現(xiàn)這種趨勢與DESs的作用程度、黏度有關(guān)。液料比過大時，物質(zhì)間相互作用力太小，使多糖溶出率降低，且過多的溶劑體積會對后續(xù)的處理造成困難，增加了工藝的成本；液料比過小使黏度增大，多糖分子截留在DESs中，降低了PSPs提取率。液料比為20 mL/g時，PSPs提取反應(yīng)體系達(dá)到平衡，提取率最大，所以本實(shí)驗(yàn)選取液料比20 mL/g作為后續(xù)研究參數(shù)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。17組試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

2.3.2模型建立與方差分析

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Design and results of response surface experiment

表3 回歸方程的方差分析Tab.3 Analysis of variance for regression equation

2.3.3響應(yīng)面分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面如圖3。等高線圖可以直觀地反映自變量交互作用的顯著性，圓形表示兩者交互作用不顯著，而橢圓形則表示顯著。

由圖3可知，時間和物質(zhì)的量比交互作用的等高線呈橢圓形，表明兩者交互作用對PSPs提取率有極顯著影響；從三維圖可以看出，隨物質(zhì)的量比和時間的增加，PSPs提取率呈先增大后減小的趨勢。物質(zhì)的量比與液料比相互作用的等高線呈橢圓形，表明兩者相互作用極顯著；從三維圖可以看出，隨物質(zhì)的量比和液料比的增加，PSPs提取率呈先增加后減小的趨勢。液料比與時間相互作用的等高線幾乎呈圓形，表明兩者相互作用不顯著，這與方差分析結(jié)果一致，從三維圖可以看出，響應(yīng)面曲線坡度較為陡峭，表明液料比和時間對PSPs提取率的影響均較大，隨液料比與時間的增加PSPs提取率呈先增加后減小的趨勢。

圖3 各因素交互作用對PSPs提取率的影響Fig.3 Effect of interaction of different factors on extraction rate of PSPs

2.3.4響應(yīng)面模型預(yù)測值驗(yàn)證

通過軟件Design Expert 8.0.6分析得到PSPs優(yōu)化提取工藝參數(shù)為物質(zhì)的量比1.19、提取時間42.30 min和液料比20.75 mL/g，在此條件下PSPs提取率的預(yù)測值為18.61%。為了驗(yàn)證響應(yīng)面結(jié)果的可靠性，對所得優(yōu)化條件進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，所得PSPs提取率平均值為18.55%，與預(yù)測值接近(相對誤差為2.69%)，說明該模型可以準(zhǔn)確預(yù)測PSPs提取率，優(yōu)化工藝條件可靠，較傳統(tǒng)的熱水浸提增加了139.97%。

2.4 DESs重復(fù)利用對PSPs提取率及含量的影響

DESs重復(fù)使用0～5次時，PSPs提取率分別為18.81%、23.22%、23.47%、34.60%、26.23、22.34%，呈先增加后降低的趨勢；在重復(fù)使用3次時PSPs提取率達(dá)到最大(見圖4)。PSPs含量分別為43.25%、55.79%、56.97%、58.97%、63.48%、64.12%，呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，說明PSPs純度越來越高，充分體現(xiàn)了DESs經(jīng)濟(jì)節(jié)約、綠色環(huán)保的特點(diǎn)。出現(xiàn)以上現(xiàn)象可能與DESs熱穩(wěn)定性差有關(guān)，不斷地高溫反復(fù)使用，使其黏度及微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。在實(shí)驗(yàn)過程也發(fā)現(xiàn)重復(fù)使用的DESs物理狀態(tài)發(fā)生了變化，在低溫下呈液體狀態(tài)，較新鮮溶劑流動性更大，但具體原因還需進(jìn)一步探究。

圖4 重復(fù)使用DESs對PSPs提取率及含量的影響Fig.4 Effect of reuse of DESs on extraction rate and content of PSPs

2.5 PSPs的抗氧化活性分析

圖5 PSPs對自由基清除率的影響Fig.5 Effects of PSPs on scavenging rate of free radical

2.5.2DPPH自由基清除能力分析

在測定的PSPs質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率與PSPs質(zhì)量濃度具有量效關(guān)系，隨質(zhì)量濃度的增加而增加，說明采用DESs提取的PSPs具有一定DPPH自由基清除能力，見圖6。經(jīng)擬合，PSPs曲線方程為y=15.13+23.86x+8.72x2+4.86x3，R2=0.998 1，IC50=0.951 mg/mL。比較IC50可知，DESs提取的PSPs的DPPH自由基清除能力低于抗壞血酸，但顯著高于傳統(tǒng)水提醇沉法提取的PSPs的DPPH自由清除能力(IC50=19.57 mg/mL)。Zhang等[29]研究發(fā)現(xiàn)微波輔助處理PSPs，使其DPPH自由基清除能力增強(qiáng)，主要原因是清除能力最低的組分發(fā)生了降解；而DESs的性質(zhì)類似于離子液，同樣具有降解活性物質(zhì)的能力。另外，當(dāng)PSPs質(zhì)量濃度為1 g/L時，DESs提取的PSPs的 DPPH自由基清除率為52.57%，而魏煒等[30]用超高壓提取的PSPs的DPPH自由基清除率為34.14%，說明DESs對PSPs抗氧化能力有一定的提高。

圖6 PSPs對DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effects of PSPs on scavenging rate of DPPH free radical

2.5.3總抗氧化能力分析

在測定的PSPs質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，總抗氧化能力與質(zhì)量濃度具有量效關(guān)系，見圖7。隨質(zhì)量濃度的增加，總抗氧化能力增加，0.2～1.0 mg/mL時總抗氧化能力增加較快；當(dāng)質(zhì)量濃度為1.4 mg/mL時，總抗氧化能力為241.2 μg/mL。PSPs的總抗氧化能力略低于同質(zhì)量濃度的抗壞血酸，但仍具有一定的抗氧化能力。

圖7 PSPs的總抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of PSPs

3 結(jié) 論