草莓枯萎病病株與健株根際基質(zhì)真菌群落組成分析

唐冬蘭 唐泉 蔣立奔 宋芹芹 曹榮祥

摘要：植物根際微生物群落在植物生長發(fā)育及病害發(fā)生防治方面具有重要作用。由尖孢鐮刀菌草莓專化型（Fusarium oxysporum f. sp. fragariae）引起的枯萎病是草莓生產(chǎn)中的典型土傳病害，危害極大。旨在揭示草莓植株根際枯萎病真菌群落結(jié)構(gòu)與枯萎病發(fā)生之間的關(guān)系，從微生物生態(tài)學角度對草莓枯萎病的生態(tài)防控提供理論依據(jù)。以南京地區(qū)草莓枯萎病病株和健株根際基質(zhì)為研究對象，用高通量測序技術(shù)檢測草莓根際基質(zhì)的真菌組成。結(jié)果表明，草莓枯萎病病株與健株根際基質(zhì)相比，真菌群落組成發(fā)生了顯著改變;病株根際基質(zhì)真菌多樣性指數(shù)較健株高;病株根際基質(zhì)中優(yōu)勢屬是刺孢菌屬，優(yōu)勢種是蚜蟲莫氏黑粉菌;健株根際基質(zhì)中優(yōu)勢屬是Pseudothielavia（暫無統(tǒng)一中文名），優(yōu)勢種是Paecilomyces tabacinus（暫無統(tǒng)一中文名）;病株根際基質(zhì)尖孢鐮刀菌相對豐度明顯高于健株根際基質(zhì)，提高了14.83倍，表明枯萎病的發(fā)生與尖孢鐮刀菌含量的大幅度增加密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：草莓;枯萎病;高通量測序;根際微生物;真菌群落多樣性

中圖分類號： S154.3;S436.68+4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）24-0110-04

收稿日期：2021-04-19

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（20）3017];亞夫科技服務項目[編號：KF（20）1021];江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（編號：JATS[2021]008）。

作者簡介：唐冬蘭（1983—），女，江蘇淮安人，博士，助理研究員，主要從事果樹病理學及生物技術(shù)研究。E-mail：dofthmlhm@163.com。

通信作者：曹榮祥，副研究員，主要從事草莓栽培與生理研究。E-mail：3060601887@qq.com。

草莓（Fragaria ananassa）素有“水果皇后”之稱，其產(chǎn)量在世界小漿果中居首位。近10年來，我國草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已經(jīng)成為世界草莓生產(chǎn)第一大國，是國內(nèi)農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的重要途徑之一。但是隨著草莓種植面積擴大、栽培年限增加，枯萎病已經(jīng)逐漸成為草莓生產(chǎn)上的重要病害，其病原菌為尖孢鐮刀菌草莓?；停‵usarium oxysporum f. sp. fragariae）[1]。在我國上海、臺灣、北京、江蘇、湖北等地均有關(guān)于草莓枯萎病發(fā)生的報道[2-6]。

目前，草莓枯萎病尚無有效防治藥物[7-8]，從土壤微生態(tài)平衡的角度進行防控應是未來的發(fā)展方向[9-10]。現(xiàn)有研究表明，土傳病害的發(fā)生與植物根際微生物區(qū)系的改變存在一定相關(guān)性[11-12]。趙衛(wèi)松等研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯黃萎病病株根際土壤中的真菌多樣性指數(shù)低于健康植株，且輪枝菌屬菌群的相對豐度顯著提高[13];余妙等研究發(fā)現(xiàn)，西洋參根腐病的發(fā)生可能與根際真菌多樣性指數(shù)的顯著降低和群落結(jié)構(gòu)失衡相關(guān)[14]。近年來，隨著測序技術(shù)的迅速發(fā)展，高通量測序技術(shù)能夠從微生物群落水平分析土傳病害發(fā)生的可能主導因子，該方法既可克服培養(yǎng)基類型和培養(yǎng)環(huán)境對結(jié)果的影響，也可檢測到無法離體培養(yǎng)的真菌類群，可以更好地揭示病株與健株根際生長介質(zhì)中真菌的組成及差異[15]，從而為草莓枯萎病的防治提供更好的思路和解決方法。

在生產(chǎn)上，為了減少土傳病害的發(fā)生，采用無土基質(zhì)進行草莓育苗及栽培的研究越來越多，但是關(guān)于無土基質(zhì)真菌群落結(jié)構(gòu)與草莓枯萎病發(fā)生之間關(guān)系的研究尚未見報道。因此，本研究以草莓健株和枯萎病病株根際基質(zhì)為對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)研究草莓根際基質(zhì)真菌群落結(jié)構(gòu)的變化，以期揭示枯萎病發(fā)生與真菌群落之間的互作關(guān)系，為草莓枯萎病的防治奠定基礎(chǔ)，并為篩選對草莓枯萎病有拮抗作用的有益微生物提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

本試驗于2020年10—12月在江蘇省南京市完成。

1.2 試驗材料

供試草莓品種為紅頰，草莓樣品采集于江蘇丘陵地區(qū)南京農(nóng)業(yè)科學研究所基地，位于江蘇省南京市江寧區(qū)銅山鎮(zhèn)。試驗分為2組：發(fā)病穴盤育苗基質(zhì)（SA）組、未發(fā)病穴盤育苗基質(zhì)（SB）組。每組取3個取樣點，每個取樣點選擇5株草莓的根際基質(zhì)混合而成。在草莓枯萎病發(fā)病期，選擇健康植株、病株作為研究對象。先將草莓植株的整個根系完整挖出，輕敲根系，將與根系結(jié)合較松的土壤棄去，再將與根系緊密結(jié)合的土壤用毛刷清理收集。將收集的樣品過2 mm篩后，裝入無菌自封袋內(nèi)，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)，用于真菌群落的高通量測序[16]。

1.3 DNA提取、真菌ITS1區(qū)擴增、Illumina文庫制備和高通量測序

由北京諾禾致源科技股份有限公司完成樣品的DNA提取、PCR擴增與產(chǎn)物純化、Illumina文庫的制備和高通量測序工作。使用的引物為ITS5F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）、ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′），采用Illumina HiSeq平臺進行雙末端測序。

1.4 原始數(shù)據(jù)處理、可操作分類單位劃分及多樣性分析

利用QIIME 1.8.0軟件對測序數(shù)據(jù)進行識別、拼接，并去除低質(zhì)量、非特異擴增序列及嵌合體，得到用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)，即Effective Tags。以97%的相似性將所有樣品的Effective Tags進行可操作性分類單位（OTU）聚類分析，并篩選出OTU的代表性序列;基于Unite數(shù)據(jù)庫，對OTU代表序列進行物種注釋分析，獲得每個OTU分類信息，統(tǒng)計樣品的物種構(gòu)成，并在各分類水平（門、綱、目、科、屬、種）上統(tǒng)計物種在每個樣品與分組中的相對豐度。通過α多樣性分析、β多樣性分析挖掘樣品內(nèi)和組間的真菌組成多樣性差異[17-18]。α多樣性分析用于分析樣品內(nèi)真菌群落多樣性，β多樣性分析用于分析樣品間真菌群落構(gòu)成的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓根際基質(zhì)真菌多樣性分析

從草莓病株基質(zhì)和健株基質(zhì)中獲得的平均有效序列數(shù)量分別為65 022、66 417條。由表1可以看出，與健株相比，病株根際基質(zhì)的真菌多樣性指數(shù)升高，除辛普森指數(shù)外，其他參數(shù)均表現(xiàn)出顯著差異。

2.2 草莓根際基質(zhì)真菌群落的特異性分析

在OTU水平上的特異性分析發(fā)現(xiàn)，草莓枯萎病病株和健株根際基質(zhì)共有的真菌OTU數(shù)量為415個，各自特有的OTU數(shù)量分別為676、268個（圖1）。

2.3 草莓根際基質(zhì)真菌在門、屬、種水平的結(jié)構(gòu)變化

將相對豐度<1%、未能鑒定、未培養(yǎng)及未能注釋到相應分類等級的菌群歸為其他。門水平上的真菌群落組成分析結(jié)果表明，草莓枯萎病病株及健株根際基質(zhì)中相對豐度最高的門均為子囊菌門（Ascomycota），其次為擔子菌門（Basidiomycota），其平均相對豐度分別為43.18%～77.46%、15.17%～37.32%。與健株根際基質(zhì)相比，枯萎病病株根際基質(zhì)中擔子菌門、被孢霉門（Mortierellomycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）、Aphelidiomycota（暫無統(tǒng)一中文名）、芽枝霉門（Blastocladiomycota）的相對豐度提高，分別是健株中的2.46、6.91、1.04、3.26、5.09倍;其他門真菌的相對豐度下降，枯萎病病株根際基質(zhì)中子囊菌門、壺霉門（Chytridiomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、捕蟲霉門（Zoopagomycota）的相對豐度分別為健株根際基質(zhì)中的55.75%、35.89%、21.04%、26.65%、20.92%（圖2）。

屬水平上的真菌群落組成研究結(jié)果表明，病株和健株根際基質(zhì)中相對豐度最高的屬分別是刺孢菌屬（Subulicystidium）和Pseudothielavia（暫無統(tǒng)一中文名）。與健株根際基質(zhì)相比，草莓枯萎病病株根際基質(zhì)相對豐度較高的12個屬中，除毛殼菌屬（Chaetomium）、曲霉屬（Aspergillus）、絲衣霉屬（Byssochlamys）、紅菇屬（Russula）和Pseudothielavia的相對豐度降低外，其他屬的相對豐度均表現(xiàn)為升高的趨勢，其中鐮刀菌屬（Fusarium）的相對豐度在病株根際基質(zhì)中較健株根際基質(zhì)中提高了10.87倍（圖3）。

種水平上的真菌群落組成研究結(jié)果表明，病株根際基質(zhì)中相對豐度最高的3個種依次是蚜蟲莫氏黑粉菌（Moesziomyces aphidis）、Paecilomyces tabacinus（暫無統(tǒng)一中文名）和綠豆黏帚霉（Scopulariopsis flava），健株根際基質(zhì)中相對豐度最高的3個種依次是P. tabacinus、瘤棒囊菌（Corynascus verrucosus）和土曲霉（Aspergillus terreus）。與健株根際基質(zhì)相比，草莓枯萎病病株根際基質(zhì)中相對豐度較高的12個種中，僅5個種的相對豐度降低，分別為P. tabacinus、黑曲霉（Aspergillus niger）、Phaeoacremonium krajdenii（暫無統(tǒng)一中文名）、瘤棒囊菌和土曲霉，其他真菌的相對豐度均升高，其中尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）的相對豐度在病株基質(zhì)中提高了14.83倍（圖4）。

采用獨立樣本t檢驗進一步對草莓根際基質(zhì)真菌種水平的物種差異進行分析。結(jié)果表明，在2種基質(zhì)中，有26個菌群在2種基質(zhì)中的分布存在顯著差異（P<0.05）。由圖5可以看出，在平均相對豐度較高的10個菌群中，尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）和旋柄腐霉（Phytopythium helicoides）等在病株中的含量較高，黑曲霉（A. niger）、土曲霉、P. krajdenii（暫無統(tǒng)一中文名）和煙曲霉（A. fumigatus）等在健株中的含量較高。

3 討論與結(jié)論

土壤微生物群落不僅是植物根系的重要組成部分，而且在植物生長發(fā)育及病害防治方面具有重要作用[19]。目前已有大量研究探討了土傳病害發(fā)病植株根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。涂祖新等對贛南臍橙黃龍病病株和健康土壤進行分析發(fā)現(xiàn)，病株根際土壤中真菌多樣性高于健株根際土壤[20]。趙衛(wèi)松等對馬鈴薯健株與黃萎病病株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，病株的根際土壤真菌多樣性較健株降低，群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變，其中黃萎病致病菌輪枝菌屬（Verticillium sp.）菌群的相對豐度顯著提高[13]。劉海洋等對棉花黃萎病不同發(fā)病程度植株根際土壤真菌群落的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)病程度較重的棉田，植株根際土壤中真菌多樣性低于健康及發(fā)病程度較輕的棉田[21]。也有研究發(fā)現(xiàn)，病株與健株根際土壤中真菌數(shù)量及組成沒有發(fā)生顯著變化。綜合分析可知，植物病害發(fā)生與根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系非常復雜，大部分研究認為病害的發(fā)生改變了土壤的微生物群落組成，尤其是病株根際土壤中病原菌的數(shù)量或相對豐度會增加。

本研究利用高通量測序技術(shù)對草莓枯萎病病株、健康植株根際的基質(zhì)進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)2種基質(zhì)中真菌多樣性存在顯著差異。健株根際中優(yōu)勢屬是Pseudothielavia（暫無統(tǒng)一中文名），優(yōu)勢物種是Paecilomyces tabacinus（暫無統(tǒng)一中文名）;病株根際中優(yōu)勢屬是刺孢菌屬，優(yōu)勢種是蚜蟲莫氏黑粉菌。尖孢鐮刀菌是引起草莓枯萎病的病原菌，本研究發(fā)現(xiàn)，枯萎病病株根際基質(zhì)中尖孢鐮刀菌的相對豐度明顯高于健株根際基質(zhì)，相對豐度是健株根際基質(zhì)的15.83倍，表明草莓枯萎病的發(fā)生與尖孢鐮刀菌含量的大幅度增加密切相關(guān)。此外，在健株根際基質(zhì)中多種曲霉屬真菌的相對豐度高于病株根際基質(zhì)，包括黑曲霉、土曲霉、煙曲霉，差異均達顯著水平（P<0.05），或許可以通過針對性地篩選曲霉屬菌群作為候選拮抗菌來抑制草莓枯萎病。

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