外泌體在膿毒癥器官功能障礙中的研究進展

張冬靜, 翟 哲, 高 巖

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院 重癥醫(yī)學科, 黑龍江 哈爾濱, 150000)

外泌體作為細胞間信號轉導的重要介質(zhì)，在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展及繼發(fā)器官功能障礙中發(fā)揮著重要作用。本文針對外泌體在炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)功能及其在繼發(fā)器官功能障礙中的影響進行闡述，以期為外泌體在膿毒癥及器官功能障礙中的研究提供新的思路。

1 外泌體概述

根據(jù)生物合成和釋放途徑可以將細囊泡胞外分為微囊泡、外泌體和凋亡小體。外泌體是由直徑30～150 nm的具有雙層脂質(zhì)膜結構的囊狀小泡組成，內(nèi)部包含多種生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、微小RNA(miRNA)及信使RNA(mRNA)等[1]。人體幾乎所有細胞均可分泌外泌體，不同來源的外泌體所含內(nèi)容物與親本細胞的種類及狀態(tài)密切相關。外泌體通過激活靶細胞上的表面受體或與之融合，將囊泡內(nèi)物質(zhì)轉運至細胞質(zhì)中，通過傳遞各種信號分子或調(diào)節(jié)多種信號通路發(fā)揮細胞間信息交換作用，以此來改變靶細胞的表型及功能，從而在細胞增殖、分化中發(fā)揮重要作用[2]。

外泌體主要通過2種途徑產(chǎn)生: ① 細胞膜內(nèi)陷形成早期胞內(nèi)體，早期內(nèi)涵體通過與高爾基體及其他在其胞內(nèi)體相互作用形成包含有許多腔內(nèi)囊泡(ILVs)的晚期胞內(nèi)體，晚期胞內(nèi)體與細胞質(zhì)膜融合釋放ILVs, 即外泌體。② 細胞膜以出芽的方式直接形成并釋放外泌體，該方式主要見于經(jīng)免疫缺陷病毒激活的T細胞及白細胞。外泌體內(nèi)容物根據(jù)親本細胞及親本細胞狀態(tài)的不同有較大變化，當前已識別的成分包括組織相容性復合體(MCH)、熱休克蛋白、四分子交聯(lián)體蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)等。

對外泌體進行準確高效的分離、提取及鑒別是了解其結構及功能的前提。當前，外泌體分離的“金標準”是基于外泌體質(zhì)量密度進行的差速超速離心技術，該方法因操作簡單、純度高、樣本預處理簡單而被廣泛應用于研究中[3]。需要通過3個方面對分離獲得的外泌體進行鑒別[4-6]: ① 形態(tài)學。利用掃描電鏡或者透視電鏡直接對外泌體的形態(tài)進行觀察，外泌體呈30～200 nm的類球形結構。② 外泌體粒子大小: 利用納米顆粒示蹤分析技術直接檢測外泌體直徑。③ 外泌體標志蛋白: 采用蛋白質(zhì)印跡法或流式細胞術對外泌體的蛋白標記物進行檢測，如表面蛋白(CD9、CD61和CD81)、合成相關蛋白TSG101和VPS4等。

2 外泌體與膿毒癥

2016年，膿毒癥被定義為由感染引起的失調(diào)的宿主反應而導致的危及患者生命的器官功能障礙。流行病學調(diào)查[7]顯示，全球每年約有超過3 000萬人的健康及生命受到膿毒癥的威脅，且膿毒癥的高致死率和致殘率給個人、家庭及社會造成了沉重負擔。外泌體作為細胞間信息傳遞重要介質(zhì)，通過炎癥反應及免疫調(diào)節(jié)在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

2.1 外泌體與炎癥

外泌體在炎癥疾病的發(fā)生、發(fā)展及調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著關鍵作用。膿毒癥期間，多種炎癥細胞如巨噬細胞、肥大細胞及中性粒細胞均可分泌外泌體。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體既是促進炎癥反應的重要介質(zhì)，也可以發(fā)揮炎癥抑制作用，這主要取決于外泌體的來源及其所處的微環(huán)境狀態(tài)。ESSANDOH K等[8]發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞在上皮細胞來源的外泌體刺激下，可以釋放更多的炎癥因子。經(jīng)外泌體抑制劑GW4869處理后巨噬細胞分泌的外泌體數(shù)量明顯減少，同時可以觀察到促炎細胞因子水平下降[9]。CAO L等[10]研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可以通過調(diào)控let-7b/tLR4信號通路誘導M1型促炎巨噬細胞向M2型抗炎巨噬細胞分化，從而抑制多種炎癥因子如白細胞介素-12(IL-12)、白細胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達。傅小媚等[11]研究認為，骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可以降低心肌梗死后小鼠的炎癥因子表達。以上研究說明，外泌體在炎癥反應的調(diào)節(jié)中的作用是復雜的，這是否與外泌體作用靶點或激活的信號通路不同有關，仍需要進行更進一步的研究。

2.2 外泌體與免疫

免疫功能紊亂是膿毒癥患者病情進展及預后不良的另一個重要因素，也是治療的重點和難點。早期研究顯示，外泌體參與固有免疫的應答[12]。隨著研究的逐漸深入，研究人員發(fā)現(xiàn)，除了固有免疫，外泌體在適應性免疫的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用。SMITH V L等[13]研究顯示，經(jīng)結核桿菌感染的巨噬細胞來源的外泌體可在體內(nèi)激活抗原特異性的CD4+及CD8+調(diào)節(jié)性T細胞，并促進體外培養(yǎng)的骨髓來源的樹突狀細胞成熟。此外，外泌體不僅參與了機體的免疫激活，還具有其他功能。研究[14]顯示，腫瘤來源的外泌體通過抑制T細胞的增殖、Th1和Th17細胞的分化及誘導Treg的產(chǎn)生從而損傷T細胞的功能，是腫瘤免疫逃逸的新興介質(zhì)。

2.3 外泌體在膿毒癥診斷中的價值

外泌體廣泛分布于各種體液中，因其易于獲取，內(nèi)容物可靈敏地反映親本細胞的病理生理狀態(tài)，被認為是疾病診斷的潛在生物標志物。WU S C等[15]研究結果表明, 6種miRNA(miR-16、miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-26a和miR-26b)在膿毒癥小鼠血清外泌體中表達明顯增高。REITHMAIR M等[16]對血清中的外泌體miRNA進行對比分析發(fā)現(xiàn), miR-21-5p及miR-193a-5p可將膿毒癥、膿毒癥休克患者及健康人群區(qū)分開，可作為診斷膿毒癥的標志物。進一步實驗還證實，外泌體miR30a-5p和miR-125b-5p是預測患者預后的良好標志物。其他研究[17-18]顯示，外泌體CD105、CD31及細胞因子信號轉導抑制因子-1(SOCS-1)等也可用于膿毒癥的診斷。

2.4 外泌體在膿毒癥治療中的價值

外泌體在膿毒癥治療中也有較高的價值。一些外泌體亞群，如內(nèi)皮祖細胞衍生的外泌體可通過抑制血漿炎癥細胞因子和趨化因子水平減輕膿毒癥器官功能障礙，并降低患者病死率[19]。張國虎等[20]進行的一項研究顯示，富含miR-126的間充質(zhì)干細胞外泌體可以抑制膿毒癥小鼠的炎癥反應，減輕器官功能障礙程度并明顯提高生存率。外泌體由于其具有低毒性、低免疫原性及高耐受性被認為是藥物遞送的理想載體。有學者通過給膿毒癥小鼠注射含有外源性姜黃素的外泌體發(fā)現(xiàn)，小鼠炎癥反應明顯下降，小鼠的存活率提升[21]。

3 外泌體與多器官功能障礙

3.1 外泌體與膿毒癥腦損傷

膿毒癥相關性腦病(SAE)是指大腦在未發(fā)生直接感染的前提下，因全身感染引起的彌漫性腦功能障礙，是導致患者死亡和預后不良的重要原因，而幸存患者可能長期存在認知功能障礙。當前研究[22]顯示，膿毒癥相關腦病的發(fā)生與感染引起的全身炎癥反應并作用于大腦導致腦內(nèi)炎癥反應、微循環(huán)功能障礙、血腦屏障功能受損及神經(jīng)遞質(zhì)傳導異常有關。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的多種細胞均可產(chǎn)生外泌體。相關動物實驗[23]發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)外周注射脂多糖(LPS)構建的膿毒癥小鼠模型中可以觀察到，小鼠腦脊液中的外泌體數(shù)量明顯升高。近期研究[24]顯示，幾種類型的外泌體miRNA, 如miR-155、miR-146a、miR-21及l(fā)et-7在神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關鍵作用。另一項研究[25]發(fā)現(xiàn)，在接受了LPS刺激小鼠血清源性外泌體的受體小鼠中可以觀察到小膠質(zhì)細胞的激活，星形膠質(zhì)細胞的增生以及全身促炎細胞因子的增多，并且發(fā)現(xiàn)促炎細胞因子mRNA及炎癥相關microRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達增高。近期研究[26]也顯示，外泌體不僅僅在膿毒癥腦病中發(fā)揮作用，也可能是導致神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡紊亂從而引起全身免疫功能崩潰，造成患者認知功能障礙的主要原因。

3.2 外泌體與膿毒癥肺損傷

外泌體與膿毒癥肺損傷(ALI)的發(fā)生、發(fā)展密切相關。膿毒癥期間，多種炎癥細胞激活并釋放大量炎癥介質(zhì)，導致肺泡-毛細血管內(nèi)皮細胞屏障結構完整性被破壞，中性粒細胞浸潤和彌漫性肺水腫。陳文濤等[27]在研究膿毒癥大鼠時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)尾靜脈注入純化的膿毒癥患者血清外泌體后，與單純膿毒癥組和假手術組大鼠比較，實驗組大鼠血清中的炎癥細胞因子的濃度更高，支氣管肺泡灌洗液中所含的白細胞計數(shù)明顯增高，肺損傷程度更為嚴重，呼吸功能障礙更加嚴重，推測外泌體可能是通過促進肺部炎癥反應進一步加重膿毒癥肺損傷程度。

研究[28]顯示, ALI小鼠外周血中的外泌體水平顯著增高，且正常小鼠在經(jīng)尾靜脈注射了從ALI小鼠血清中純化出的外泌體后，其肺內(nèi)M1型巨噬細胞的數(shù)量明顯增多。進一步體外實驗發(fā)現(xiàn), ALI小鼠血清中分離出的外泌體內(nèi)富含miR-155, 而外泌體miR-155可激活巨噬細胞從而刺激NF-κB活化，并誘導TNF-α和白細胞介素-6(IL-6)的產(chǎn)生。以上實驗結果均證實，外泌體通過介導炎癥反應參與膿毒癥肺損傷的發(fā)生。但是，另一些研究[29]則發(fā)現(xiàn)，上皮細胞來源于干細胞的外泌體對肺損傷起保護作用。

ZHOU Y 等[30]研究結果表明，內(nèi)皮祖細胞來源的外泌體可以通過抑制髓過氧化物酶(MPO)的活性，從而減輕ALI小鼠肺水腫、內(nèi)皮細胞損傷和中性粒細胞浸潤，從而起到改善肺功能的作用。研究[29]提示，間充質(zhì)干細胞(MSC)可以通過調(diào)節(jié)宿主對損傷的感染的免疫應答促進組織損傷后的修復。LI J等[31]研究證實, MSC來源的外泌體可以通過Nrf-2/ARE和NF-κB信號通路逆轉LPS誘導的ALI, 外泌體在抑制炎癥細胞因子產(chǎn)生及減輕炎癥反應的作用也得到了證實。

3.3 外泌體與膿毒癥心臟損傷

膿毒癥引起的心肌功能障礙是患者預后不良的主要原因，發(fā)病機制可能與炎癥反應、線粒體功能障礙、氧化應激、鈣調(diào)節(jié)改變、自主神經(jīng)紊亂和內(nèi)皮功能障礙有關。研究[14]證實，膿毒癥患者的血液樣本中分離出的外泌體還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性升高，同時氧化應激標志物水平明顯升高。研究[32-33]結果證明，膿毒癥患者外泌體可以增高活性氧和活性氮，從而損傷線粒體膜的完整性，使線粒體結構和功能受損，引起心肌細胞能量代謝障礙。同時，外泌體也參與了心肌保護和損傷修復。KERVADEC A等[34]研究顯示，小鼠胚胎干細胞來源的外泌體可促進心肌梗死后新生血管的產(chǎn)生并減少纖維化的發(fā)生，這與胚胎干細胞促進心肌細胞增殖的作用相吻合。研究[35]進一步顯示，外泌體miR-21-5p可以抑制心肌細胞的凋亡并促進心臟血管的生成，改善心肌梗死小鼠模型的心臟功能，也進一步支持了外泌體miR-21-5p在介導心肌修復中發(fā)揮著重要作用這一結論。

3.4 外泌體與膿毒癥肝損傷

肝臟是膿毒癥期間最常受累的器官之一，肝臟功能不全往往預示著患者預后不良，是患者死亡的獨立危險因素。研究[24]顯示，外泌體可以通過誘導免疫功能失調(diào)及促進炎癥反應導致膿毒癥期間的肝臟損傷，說明外泌體可能是抑制全身炎癥反應及改善肝功能的潛在治療靶點[36]。研究[37]顯示，巨噬細胞來源的外泌體可以通過激活肝臟細胞中的NLRP3炎癥小體促使白細胞介素(IL)和其他細胞因子成熟，從而導致肝臟細胞的凋亡。肝細胞自噬缺陷細胞釋放的外泌體中含有多種損傷相關模式分子(DAMPs), 例如HMGB1及HSP90等，可以促進庫普弗細胞促炎基因的表達，從而促使炎癥相關因子包括IL-1α、IL-1β、IL-6、趨化因子配體2(CCL2)和環(huán)氧化酶-2(COX2)的釋放，增加局部炎癥反應[38]。近期研究[39]顯示，外泌體不僅能夠導致膿毒癥期間肝細胞的損傷，還能促進肝臟的纖維化，導致肝臟血管重構，從而導致患者后期慢性肝功能障礙?？傊?，外泌體能夠引起局部炎癥反應和肝臟纖維化，最后導致肝臟的急性和慢性功能障礙。

3.5 外泌體與膿毒癥腎損傷

當前，隨著對急性腎損傷研究的深入，越來越多研究證實，外泌體參與了各種腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展。LV L L等[40]研究顯示，腎小管上皮細胞來源的外泌體miR-19b-3p在LPS誘導的AKI小鼠模型中明顯升高。SONODA H等[41]研究也表明，外泌體miRNA在缺血再灌注AKI的早期即升高，且濃度與AKI的嚴重程度相關。 APPIAH M G等[42]對注射LPS后的小鼠腎臟組織進行組織學觀察發(fā)現(xiàn)，膿毒癥AKI小鼠腎小管上皮細胞所產(chǎn)生外泌體中富含miRNA-19b-3p, 該外泌體可以激活M1巨噬細胞，從而激活NF-κB信號通路，促進炎癥因子基因轉錄增強，進而引起局部及全身的炎癥反應，并最終引起腎小管細胞損傷。

3.6 外泌體與膿毒癥胃腸功能障礙

膿毒癥期間，局部炎癥反應失調(diào)導致毛細血管滲透性增加，腸上皮供氧減少，最終導致腸道黏膜屏障損傷，促進腸道細菌及其產(chǎn)物移位，進一步加重膿毒癥嚴重程度。研究[43]證實，膿毒癥小鼠腸道中的外泌體濃度明顯升高，且腸上皮細胞來源的外泌體在調(diào)節(jié)腸道黏膜炎癥反應中發(fā)揮著促進和抑制的雙重作用。然而，腸道中除上皮細胞可以分泌外泌體外，腸道內(nèi)共生的細菌及其他微生物也可分泌。動物實驗表明，腸道細菌來源的外泌體可以誘導局部及全身的炎癥反應，這一過程可能是通過對Toll樣受體2(TLR2)及Toll樣受體4(TLR4)進行調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的[44]。

膿毒癥期間，胃腸道的微生物組成會發(fā)生較大改變，而腸道上皮細胞釋放的外泌體可以通過向靶組織傳遞細胞因子或DAMPs的方式誘發(fā)局部炎癥反應[45], 這表明外泌體可能通過直接或間接釋放相關生物活性物質(zhì)，例如炎癥因子及miRNA等來影響腸道菌群的組成。當前研究僅局限于外泌體在腸道炎癥反應中的作用，為了詳細了解外泌體誘導腸道微生物群落改變與病理生理結果間的關系，需要進行進一步深入研究。

4 展 望

膿毒癥的發(fā)病機制極為復雜，涉及多種細胞因子及信號傳導途徑。了解多種細胞間相互交流的機制及調(diào)控機制對于膿毒癥的診斷及治療具有重要意義。外泌體作為細胞間信息交流的重要介質(zhì)，在多種細胞生理過程發(fā)揮著重要作用，并參與機體炎癥反應及免疫調(diào)節(jié)。外泌體根據(jù)親本細胞來源及細胞微環(huán)境狀態(tài)不同發(fā)揮的功能也不盡相同，在膿毒癥中主要通過調(diào)控炎癥反應、纖維化、細胞凋亡等途徑介導多種器官的損傷。由于缺乏高效及特異性高的分離和鑒定方法，外泌體在臨床應用上受到了極大限制。因此，研究外泌體的結構及其在疾病中的作用靶點及信號通路有助于深入了解膿毒癥及其繼發(fā)器官功能障礙的發(fā)生、發(fā)展機制，并發(fā)現(xiàn)更多作用靶點，并為膿毒癥的治療提供依據(jù)及新策略。