侯永翔，李宇飛，王 敏，千葉秀幸，范驍凌

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2 西安交通大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，陜西 西安 710061；3 檀香山畢肖普博物館，美國 夏威夷 96817 - 0916)

弄蝶科Hesperiidae昆蟲是一類色澤比較單一，翅面斑紋變化較大的蝴蝶，其種間、屬間，甚至亞科間有模擬現(xiàn)象，表現(xiàn)出翅面斑紋的高度相似性，而有的種類雌、雄或種下存在明顯的差異。越來越多的研究表明，僅依據(jù)成蟲的形態(tài)特征，尤其過分依賴翅面斑紋的傳統(tǒng)分類導(dǎo)致的誤判與分類地位的混亂普遍存在[1-10]。

銀弄蝶屬CarterocephalusLederer, 1852 隸屬于弄蝶科鏈弄蝶亞科Heteropterinae，目前已知約19種，分布于亞洲、歐洲和北美洲，在中國均有分布，其中12種為我國特有。成蟲活躍于高山草甸及林窗地帶，喜訪花和在潮濕地面吸水；幼蟲以雀麥屬Bromus、洋狗尾草屬Cynosurus等禾本科植物為食[11]。

醒斑銀弄蝶C.alcina是Evans于1939年以產(chǎn)自云南騰沖的標(biāo)本為模式描述的[12]。李傳隆[13]以產(chǎn)自云南昆明西山的標(biāo)本為模式描述了黃斑銀弄蝶C.alcinoides，之后的多數(shù)研究中僅有黃斑銀弄蝶的記錄[11, 14-21]；另外，將其他種誤定為該種的也不少見[11, 22]。近來我們?cè)谘芯裤y弄蝶時(shí)發(fā)現(xiàn)，2頭產(chǎn)自北京的標(biāo)本與醒斑銀弄蝶非常相似，但又存在明顯差異，有研究將其誤定為黃斑銀弄蝶[18-19, 23-24]。

本研究的目的旨在系統(tǒng)研究銀弄蝶形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上，以醒斑銀弄蝶及相近物種為主要研究對(duì)象，綜合其形態(tài)特征、COI序列和地理分布等信息，厘清它們之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

根據(jù)Evans[25]、武春生等[11]的分類結(jié)果，本研究以醒斑銀弄蝶、黃斑銀弄蝶為主要研究對(duì)象，為了更好地解決疑難種的分類及近似種的關(guān)系問題，研究材料包括這2個(gè)種不同分布地，同一分布地斑紋變異的不同個(gè)體以及近似斑紋的其他種，共9種，32 個(gè)個(gè)體 (表 1)，根據(jù)近年弄蝶科系統(tǒng)發(fā)育研究[10, 26-27]，選取鏈弄蝶亞科Heteropterinae中4個(gè)不同屬的物種：鏈弄蝶Heteropterusmorpheus(Genebank 序列號(hào)：KF881050)、小弄蝶Leptalinaunicolor(Genebank序列號(hào)：AB192500)、糜弄蝶Metisellametis(Genebank序列號(hào)：KY019796)、膽弄蝶Dardarinadardaris(Genebank 序列號(hào)：GU161460)為外群。除GeneBank下載的序列外，其余均為本研究測(cè)序結(jié)果，并已上傳NCBI，具有標(biāo)本編號(hào)的材料均保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)系昆蟲標(biāo)本館(表1)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)研究 選取代表性標(biāo)本展翅后用SONY DSC - RX100 拍照，將其腹部完整取下，用100 g/L的NaOH溶液加熱處理，檢視其外生殖器，采用Keyence VHX-5000超景深三維顯微系統(tǒng)拍照。穩(wěn)定的斑紋、外生殖器特征是鑒定種的標(biāo)準(zhǔn)，采用Fan等[3]的形態(tài)術(shù)語。

1.2.2 COI序列的獲取 總 DNA 的提取使用天根生化科技(北京)有限公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒 (DP304)。COI序列 (658 bp)擴(kuò)增與測(cè)序引物多為L(zhǎng)CO1490和HCO2198[28]，部分?jǐn)U增困難的標(biāo)本，根據(jù)黃翅銀弄蝶C.silvicola[29]、醒斑銀弄蝶C.alcina[27]全線粒體基因組及本研究已獲得的序列，采用新設(shè)計(jì)的1對(duì)引物(CarF：5′-CGCGCTACTAATCATAAAGATATTG G-3′ 和CarR：5′- CTTCAGGGTGTCCAAAAAATCA-3′)。PCR 擴(kuò)增采用 20 μL 體系，包括 1 μL DNA 模板，各 0.8 μL(10 μmol/L)的上、下游引物，10 μL 的 2 ×EasyTaqPCR superMix(北京，全式金生物技術(shù)有限公司)。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃ 預(yù)變性 4 min；94 ℃變性 30 s、48 或 49 ℃ 退火 45 s，72 ℃ 延伸 1.5 min，循環(huán)35或40次；72 ℃延伸7 min。測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 序列檢查、拼接及遺傳距離的計(jì)算使用MAGE 7.0軟件[30]。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用最大似然法 (Maximum likelihood，ML)和貝葉斯分析法 (Bayesian inference，BI)。其中 ML 使用 RAxMLHPC2 on XSEDE 8.2.12 軟件[31]，選擇 GTR+G 模型，重復(fù)抽樣 1 000 次，以自展值 (Bootstrap support values, BS)評(píng)估其節(jié)點(diǎn)的穩(wěn)定性；BI使用MrBayes on XSEDE 3.2.7a 軟件[32]，采用可逆跳躍馬爾可夫鏈蒙特卡羅 (Reversible-jump markov chain monte carlo，MCMC)策略，運(yùn)行 5×106代，每 1 000 代抽樣 1 次，用后驗(yàn)概率 (Posterior probabilities, PP)評(píng)估其分支的穩(wěn)定性。2種分析均在CIPRES 線上服務(wù)平臺(tái)上完成(https://www.phylo.org/)[33]。

表 1 本研究銀弄蝶屬Carterocephalus的標(biāo)本信息1)Table 1 The specimen information of Carterocephalus in this study

采用 Fig Tree 1.4.4 和 Photoshop CS5 軟件顯示與編輯系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ML、BI構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹基本一致，僅部分節(jié)點(diǎn)的支持值存在差異(圖1)。系統(tǒng)樹顯示銀弄蝶屬Carterocephalus單系并得到較強(qiáng)支持(BS=91, PP=1)；研究材料聚為明顯的 9 支，分別對(duì)應(yīng)形態(tài)上的基點(diǎn)銀弄蝶C.argyrostigma、射線銀弄蝶C.abax、銀線銀弄蝶C.patra、前進(jìn)銀弄蝶C.avanti、白斑銀弄蝶C.dieckmanni、愈斑銀弄蝶C.houangty、黃翅銀弄蝶C.silvicola與銀弄蝶C.palaemon、Clade A 和醒斑銀弄蝶C.alcina。其中射線銀弄蝶與銀線銀弄蝶，前進(jìn)銀弄蝶與白斑銀弄蝶的姐妹關(guān)系得到強(qiáng)烈支持；黃翅銀弄蝶、銀弄蝶、Clade A和醒斑銀弄蝶聚為高度支持的單系支(BS＝98, PP=1)。在這一支中，銀弄蝶C.palaemon非單系，并與黃翅銀弄蝶C.silvicola聚為有強(qiáng)烈支持的一支(BS=98, PP=1)；昆明西山的2個(gè)樣本，即黃斑銀弄蝶C.alcinoides沒有獨(dú)立成支，而是嵌套于醒斑銀弄蝶C.alcina中，結(jié)合形態(tài)特征與地理分布，提出黃斑銀弄蝶C.alcinoidesLee, 1962是醒斑銀弄蝶C.alcinaEvans, 1939 的異名；北京產(chǎn)的 2 個(gè)個(gè)體獨(dú)立聚成一支(Clade A)，綜合形態(tài)特征及遺傳距離，Clade A應(yīng)該是1個(gè)新種，即長(zhǎng)斑銀弄蝶CarterocephaluslongimaculatusHou, Fan & Li sp.nov.。

2.2 長(zhǎng)斑銀弄蝶Carterocephalus longimaculatus Hou, Fan & Li sp.nov.

http://zoobank.org/A68ADACD-5893-41F1-AED8-00F72BE5995B

圖 1 基于COI條形碼以最大似然法構(gòu)建的銀弄蝶屬的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Carterocephalus based on COI barcodes using Maximum likelihood analysis

Carterocephalussp.Yangetal., 1994: 54[34].

Carterocephalusalcinus: Seto, 2013: Plate37[24].

Carterocephalusalcinoides: Wangetal., 1998:188[18]; Wang, 1999: 277[19].

鑒別特征：外觀與醒斑銀弄蝶C.alcina相似，其主要不同在于前翅中室基部具有1個(gè)三角形小斑；后翅Sc+R1室具有1個(gè)不規(guī)則方斑，端部M1-M2室具有1個(gè)長(zhǎng)斑，延伸至亞緣。

圖 2 2種銀弄蝶成蟲Fig.2 Adults of two Carterocephalus species

雄性 (圖 2A、2B)：觸角長(zhǎng)約 7 mm；下唇須第2節(jié)粗、腹面被黃色長(zhǎng)毛，第3節(jié)尖細(xì)、前伸。前翅長(zhǎng)13～14 mm，前緣中部沒有明顯凹入；翅正面深褐色，斑紋橙黃色；中室端斑大，近方形，前緣具有1個(gè)較寬條狀斑紋，與中室斑相連，終止于R2室基部，中室基部有1個(gè)三角形斑，與前緣斑相連或不相連，翅端部R3-R5室、M1-M2室2個(gè)方形大斑相連，R4、R5外緣常有 2 個(gè)小斑，M3、CuA1、CuA2室斑相連呈1條寬短帶，CuA2室近基部有1個(gè)水滴狀黃斑，向基部漸窄；反面除外緣具有1列淺黃色小斑、中室端脈淡黃外，與正面基本相同。后翅正面底色、斑紋顏色同前翅，端部分別于M1、M2，CuA1和CuA2室有3個(gè)黃斑，其中M1、M2室的最大并延伸近外緣，并在外1/3處有縊縮狀，M3室有時(shí)可見1個(gè)極小斑，Sc+R1室具有1個(gè)不規(guī)則的方斑，中室基部具有1個(gè)水滴形斑，向基部漸窄；反面底色淺褐色，與正面斑對(duì)應(yīng)位置的斑淺黃色，其余奶白色，外緣及亞緣具有2列小斑，Sc+R1室、CuA2室基部均具有1個(gè)長(zhǎng)斑，中室斑與M1、M2斑之間具不規(guī)則的條形斑。前翅緣毛深褐色，后翅外緣毛橙黃色。

雄性外生殖器(圖3A、3B)：鉤形突狹長(zhǎng)漸細(xì)，端部?jī)闪眩活€形突左右愈合，漸窄，末端稍短于鉤形突端；囊形突很長(zhǎng)，占基腹弧的一半以上；陽莖很長(zhǎng)，長(zhǎng)于整個(gè)基腹弧的骨環(huán)結(jié)構(gòu)，陽莖端膜被小刺；陽基軛片環(huán)狀且沿陽莖背腹面突出；抱器端兩裂，其中背端突鈍圓，腹端突末端突出，被小刺。

圖 3 2種銀弄蝶的外生殖器Fig.3 Genitalia of two Carterocephalus species

雌性：未見標(biāo)本。根據(jù)北京蝶類原色圖鑒118頁圖24a[34]，前翅前緣橙黃長(zhǎng)條及R4、R5室外緣的小斑缺如，中室基部斑小；后翅M1、M2室大斑不向外延伸、Sc+R1斑小，其余似雄性。

模式標(biāo)本：正?！?，北京靈山，2017-Ⅵ-3，李鵬采；副模♂，北京小龍門，2014-Ⅴ-25。模式標(biāo)本保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲系昆蟲標(biāo)本室。

詞源：學(xué)名longimaculatus源于 longi+maculatus，意為后翅正面M1、M2室的長(zhǎng)斑。

主要分布于中國遼寧(建平)、北京(靈山)、天津(八仙山)、河南(濟(jì)源)等地。該種在北京地區(qū)的生境為林間空地及草地，成蟲常被目擊訪花，發(fā)生期為5月初至7月中下旬。

2.3 黃斑銀弄蝶是醒斑銀弄蝶的異名

Evans[12]描述醒斑銀弄蝶Carterocephalus alcina時(shí)除檢視了騰沖的標(biāo)本外，同時(shí)還檢視了產(chǎn)自麗江與昆明的雌、雄標(biāo)本共19頭。李傳隆[13]依據(jù)產(chǎn)自昆明西山的2雄1雌標(biāo)本及河口的1雄標(biāo)本描述了黃斑銀弄蝶C.alcinoides。根據(jù)原描述后者與前者極為相似，但又不同，表現(xiàn)在“前翅正面前緣橙黃色長(zhǎng)條斑粗且中部膨大；前翅反面4、5(M1、M2)室的斑相連，且內(nèi)緣略成一條直線；雄性外生殖器鉤形突左右分叉，互相緊貼，形似鋼筆尖；顎形突左右連成一體，尖長(zhǎng)略等于鉤形突；雌蝶前緣長(zhǎng)條斑缺如”[13]。事實(shí)上，與二者的模式種(圖2C、2D)相比較，前翅前緣橙黃長(zhǎng)條斑僅端部寬窄稍有差異，前翅反面M1、M2斑基本一致，而雌性根據(jù)Evans的描述[25]和黃斑銀弄蝶一樣，前翅前緣條缺如。另外通過檢視15雄6雌標(biāo)本，其中包括騰沖標(biāo)本2頭、昆明標(biāo)本2頭，發(fā)現(xiàn)不同分布地，甚至同一分布地的不同個(gè)體，雄性前翅前緣橙黃長(zhǎng)條斑端部的寬窄有變異，M1、M2室斑的內(nèi)緣成直線是不穩(wěn)定的 (圖 2E、2F、2G、2I、2J、2L、2M)；雌性前緣條斑缺如 (圖 2H、2K、2N)；前翅端部 R3-R5室和 M1-M2室2個(gè)大斑通常雌性不相連(圖2H、2K、2N)，雄性有變異，有相連的、有稍微分離的，甚至有左右翅連接不一致的(圖2E)。通過對(duì)斑紋有變異的外生殖器解剖發(fā)現(xiàn)，雄性外生殖器除分布于四川格西溝的抱器瓣腹端突稍鈍外，騰沖、昆明及其他分布地的基本一致(圖3C、3D)。雌性外生殖器基本一致，前后陰片對(duì)稱，前陰片上緣淺的小V型，后陰片稍弧形凹入(圖3E、3F)，與袁峰等[35]所描述存在一定差異。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，昆明、騰沖及其他分布地的21個(gè)個(gè)體交織成高度支持的一支，且遺傳距離為0～0.60%，其中，昆明與騰沖樣本間遺傳距離僅為0.15%；格西構(gòu)分支與其余個(gè)體間遺傳距離為0.60%，形態(tài)特征上，除了上述變異外中室基部有的個(gè)體可見小黃色斑紋(圖2J、2L、2M)，外生殖器無明顯不同(圖3C、3D)。綜合形態(tài)特征、分子系統(tǒng)發(fā)育分析、遺傳距離及地理分布信息，我們認(rèn)為黃斑銀弄蝶C.alcinoidesLee, 1962是醒斑銀弄蝶C.alcinaEvans, 1939 的新異名 (syn.nov.)。

3 討論與結(jié)論

銀弄蝶屬已知19種20余亞種，本文僅包括醒斑銀弄蝶C.alcina及其近似種且無涉及亞種的材料，因此該屬的單系性仍需增加物種數(shù)和分子數(shù)據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)。

根據(jù)翅面斑紋，以前的研究認(rèn)為醒斑銀弄蝶C.alcina與銀弄蝶C.palaemon、黃翅銀弄蝶C.silvicola、愈斑銀弄蝶C.houangty、射線銀弄蝶C.abax(2亞種：指名亞種與銀線亞種C.abaxpatra)、美麗銀弄蝶C.pulchra相似，其中與射線銀弄蝶C.abax的關(guān)系最近[12, 25]。Sugiyama[36]將銀線亞種提升為種級(jí)分類單元，即銀線銀弄蝶C.patra。本研究結(jié)果支持該亞種的提升，同時(shí)顯示銀弄蝶C.palaemon、黃翅銀弄蝶C.silvicola、長(zhǎng)斑銀弄蝶C.longimaculatussp.nov.與醒斑銀弄蝶C.alcina為高度支持的單系群，且后翅具大而醒目的淡黃斑，M1、M2室斑與Sc+R1中部斑遠(yuǎn)離是其共同特征?；诨蚪M的研究也發(fā)現(xiàn)銀弄蝶C.palaemon、黃翅銀弄蝶C.silvicola和醒斑銀弄蝶C.alcina成單系[10]。遺傳距離分析顯示文中銀弄蝶種間的平均遺傳距離為1.2%～10%，長(zhǎng)斑銀弄蝶C.longimaculatussp.nov.與其他種的平均遺傳距離為3.9%～10%，其中與醒斑銀弄蝶的遺傳距離為3.9%。系統(tǒng)發(fā)育樹中長(zhǎng)斑銀弄蝶C.longimaculatussp.nov.獨(dú)立成支，盡管支持值不高，但2種方法均顯示其在已知種中與醒斑銀弄蝶的關(guān)系更近。黃翅銀弄蝶C.silvicola與銀弄蝶C.palaemon在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一支，其平均遺傳距離為1.2%，但產(chǎn)自日本的銀弄蝶C.palaemon并沒有與歐洲的聚在一起，其是亞種還是種？銀弄蝶C.palaemon已知有近10余亞種。Cong等[10]基于基因組數(shù)據(jù)認(rèn)為C.palaemon mandan為獨(dú)立種。因此這2個(gè)種及種下問題的澄清需要更廣泛的取材進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

致謝：衷心感謝標(biāo)本采集及提供者：李鵬、張瓏，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院何成興研究員，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)黃珍富、紀(jì)樹欽、湯靜、魏福宏、韓雨珂、繆志鵬、莫世芳、曹成龍和譚舜云。感謝華南農(nóng)業(yè)大學(xué)洞穴生物實(shí)驗(yàn)室提供Keyence VHX-5 000超景深三維顯微系統(tǒng)以完成外生殖器拍照。感謝倫敦英國自然歷史博物館Blanca Huertas博士，中國科學(xué)院動(dòng)物研究所的武春生研究員與姜楠博士在模式標(biāo)本檢視過程中給予的熱情幫助與大力支持。