裴宏謙,占江凡,秦 玲,李科靜,皮 杰,曾 聰*,李德亮*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,中國(guó)湖南 長(zhǎng)沙 410128;2.湖南應(yīng)用技術(shù)學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院,中國(guó)湖南 常德 415000)

蜆屬(Corbicula)貝類隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、簾蛤目(Venaroida)、蜆科(Corbiculidae),原產(chǎn)于亞洲、非洲、澳洲和中東地區(qū)[1～2]。1924年首次在北美洲太平洋沿岸被發(fā)現(xiàn)[3～4]后,蜆迅速在北美、南美和歐洲大陸擴(kuò)散,目前已經(jīng)成為世界各地咸淡水水域的優(yōu)勢(shì)種群,且對(duì)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)和生態(tài)均造成嚴(yán)重威脅[5～7]。盡管如此,形態(tài)的高度可塑性和生殖方式的多樣性,導(dǎo)致蜆屬的分類尚未準(zhǔn)確厘定[8～11]。蜆因其豐富的營(yíng)養(yǎng)與藥用價(jià)值,一直深受我國(guó)東南沿海、日本和韓國(guó)民眾的喜愛,是重要的漁業(yè)資源[12～13]。近年來(lái),受過(guò)度捕撈及生境破壞等因素的影響,我國(guó)蜆屬貝類資源日益衰退,亟待加強(qiáng)保護(hù)[14～15]。

研究表明,蜆具有二倍體、三倍體及四倍體3種倍性[16～19],且不同倍性蜆的分布具有明顯區(qū)域性,入侵地的蜆均為三倍體[20],而原產(chǎn)地水域則多種倍性的蜆均有分布,但四倍體蜆目前僅在我國(guó)四川省安岳縣的溪流中有報(bào)道[21]。蜆存在雌雄同體和雌雄異體兩套性別系統(tǒng),其中雌雄同體和雌雄異體的蜆在原產(chǎn)地共存[22],而入侵地的蜆則均為雌雄同體[23～24]。染色體核型分析是倍性鑒定最傳統(tǒng)和經(jīng)典的方法,隨著技術(shù)的發(fā)展,基于DNA含量的顯微熒光法和流式細(xì)胞術(shù)也逐漸應(yīng)用于動(dòng)物倍性的鑒定[25～26]。黃勤[27]利用核型分析法鑒定福建閩江地區(qū)的河蜆(Corbicula fluminea)為二倍體;Qiu等[21]同時(shí)采用核型分析及顯微熒光法,證實(shí)四川安岳縣的溪流中共存有三倍體及四倍體河蜆。流式細(xì)胞術(shù)是在顯微熒光法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種細(xì)胞學(xué)分析方法,其可將4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染液與DNA特異性結(jié)合形成的特征熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的DNA 含量值[28～29]。該方法已被用于鮑[30]、牡蠣[31]等多種軟體雙殼類的倍性分析,但尚未見其在蜆屬貝類倍性鑒定中的應(yīng)用報(bào)道。

作為長(zhǎng)江流域僅存的兩大通江湖泊之一,洞庭湖蜆資源豐富[32],但尚未見其倍性報(bào)道。本文以洞庭湖支流——沅江常德鼎城區(qū)江段的蜆屬貝類為研究對(duì)象,在傳統(tǒng)染色體核型分析的基礎(chǔ)上,采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其倍性進(jìn)行鑒定,并探討其倍性與形態(tài)、性別的關(guān)系,以期為其種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年7月,利用手操網(wǎng)于沅江常德鼎城區(qū)江段(111.693°E,28.987°N)采集蜆樣品。采集的樣品被帶回實(shí)驗(yàn)室,置于曝氣水中暫養(yǎng)。

1.2 形態(tài)測(cè)量

將樣品置于吸水紙上吸干表面水分,用游標(biāo)卡尺測(cè)量樣品殼長(zhǎng)(shell length,SL)、殼寬(shell width,SW)及殼高(shell height,SH),用分析天平測(cè)量其濕重(wet weight,W)。

1.3 倍性鑒定

1.3.1 核型分析法

隨機(jī)選取性成熟個(gè)體,稱重后按4 μg/g濕重的劑量標(biāo)準(zhǔn),向活體斧足注射質(zhì)量濃度為5 mg/mL的植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA),處理24～25 h;同樣部位再以2 μg/g濕重劑量注射質(zhì)量濃度為10 mg/mL的秋水仙素,處理4～5 h。處理結(jié)束后,用剪刀撬開蜆殼,剪取鰓組織并剪碎,加1～2mL生理鹽水稀釋,在上清液中加入0.037 5 mol/L的KCl溶液,低滲處理30 min,再以2 500 r/min離心5 min,去除上清液后用卡諾式固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定鰓細(xì)胞30 min,以3 000 r/min離心5 min,去除上清液,重復(fù)固定兩次;熱滴片,10%Giemsa染液染色30 min,流水清洗玻片,風(fēng)干后顯微觀察[33]。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)

隨機(jī)選取蜆樣品,解剖并剪取閉殼肌組織,置于少量磷酸緩沖鹽溶液(pH 7.2～7.4)中用剪刀剪碎,過(guò)濾得到體細(xì)胞懸液,加入DAPI熒光染液;分別以二倍體太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)及二倍體泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)為參照,采用CyFlow?Space流式細(xì)胞儀(德國(guó)Partec公司生產(chǎn))測(cè)定體細(xì)胞的相對(duì) DNA 含量[34～36]。

1.4 性別鑒定

參照文獻(xiàn)[15]的方法,先剪取新鮮樣品的性腺組織,隨后采用Bouin’s組織固定液將其固定,固定的組織經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明等操作后制成石蠟切片,用蘇木精-伊紅染液染色后封片,最后將切片樣品置于奧林巴斯顯微鏡下鏡檢并確定其性別。

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

2 結(jié)果

2.1 倍性特征

此次分析的45個(gè)樣品中存在二倍體30個(gè),三倍體15個(gè)。傳統(tǒng)的核型分析結(jié)果顯示:二倍體蜆的體細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=36(圖1A),包括1對(duì)中部著絲粒染色體(metacentric,M)、1對(duì)亞中部著絲粒染色體(submetacentric,SM)以及16對(duì)近端著絲粒染色體(subtelocentric,ST)(圖1C);三倍體蜆的體細(xì)胞染色體數(shù)目為3n=54(圖1B),包括1對(duì)M染色體、5對(duì)SM染色體和12對(duì)ST染色體(圖1D)。

以二倍體太平洋牡蠣為參照,流式細(xì)胞儀所測(cè)二倍體蜆和三倍體蜆的DNA相對(duì)含量分別為12 921.82±217.43(圖 2A)和 19 041.39±375.31(圖2B)。以二倍體泥鰍為參照,流式細(xì)胞儀所測(cè)二倍體蜆和三倍體蜆的DNA相對(duì)含量分別為777.77±32.24(圖 2C)和 1 137.71±38.02(圖 2D)。

圖1 沅江蜆體細(xì)胞的染色體分裂相及核型(A)二倍體蜆的染色體分裂相;(B)三倍體蜆的染色體分裂相;(C)二倍體蜆的核型;(D)三倍體蜆的核型。Fig.1 Chromosome division and karyotype in somatic cells of Corbicula clams from the Yuan River(A)Chromosome division of diploid Corbicula clams;(B)Chromosome division of triploid Corbicula clams;(C)Karyotype of diploid Corbicula clams;(D)Karyotype of triploid Corbicula clams.

2.2 形態(tài)特征

45個(gè)蜆的濕重、殼長(zhǎng)、殼寬和殼高分別為(5.42±1.63)g、(24.73±2.87)mm、(15.68±1.39)mm、(23.47±2.56)mm(表1)。單因素方差分析顯示,兩種倍性蜆的濕重、殼長(zhǎng)、殼寬和殼高均無(wú)顯著性差異(P＞0.05),但二倍體蜆的SW/SL比值顯著大于三倍體(P＜0.05)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)的沅江蜆體細(xì)胞的相對(duì)DNA含量(A～B)以二倍體太平洋牡蠣為參照;(C～D)以二倍體泥鰍為參照。Fig.2 Relative DNA contents in somatic cells of Corbicula clams from the Yuan River detected by flow cytometry(A～B)Diploid Crassostrea gigas was used as reference;(C～D)Diploid Misgurnus anguillicaudatus was used as reference.

2.3 性別特征

45個(gè)蜆中有雌雄同體23個(gè)、雄性13個(gè)、雌性9個(gè)(圖3)。在30個(gè)二倍體蜆中,雌雄同體、雄性和雌性的個(gè)體數(shù)量分別為16、7、7;在15個(gè)三倍體中,雌雄同體、雄性和雌性的個(gè)體數(shù)量分別為 7、6、2(圖 4)。

表1 沅江不同倍性蜆的濕重和形態(tài)特征Table 1 Comparisons of wet weight and morphological characteristics of Corbicula clams with different ploidies from the Yuan River

3 討論

3.1 蜆的倍性特征

本研究首次采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)沅江蜆的倍性進(jìn)行分析。與傳統(tǒng)核型分析方法相比,利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定蜆的倍性,極大地降低了實(shí)驗(yàn)人員對(duì)細(xì)胞生物學(xué)分析技術(shù)的依賴,簡(jiǎn)化了倍性鑒定流程,提高了鑒定效率。研究表明,蜆屬貝類具有二倍體、三倍體、四倍體3種倍性,且不同倍性蜆的分布具有明顯區(qū)域性。通常,入侵地蜆均為三倍體,而原產(chǎn)地水域的蜆則是二倍體、三倍體及四倍體均有分布[20,22]。在我國(guó),福建閩江河蜆為二倍體[27],臺(tái)灣基隆河河蜆為二倍體和三倍體[17],四川安岳縣溪流中的河蜆為三倍體和四倍體[21]。本研究采用傳統(tǒng)核型分析法和流式細(xì)胞術(shù)均證實(shí)二倍體和三倍體的蜆共存于沅江常德鼎城區(qū)江段。其中,二倍體蜆的體細(xì)胞染色體有36條,三倍體有54條,但染色體的單倍體數(shù)均為n=18(圖1)。已有研究表明,蜆染色體的單倍體數(shù)存在n=18或n=19兩種類型,其中n=19的蜆多分布于海水水域,且以二倍體為主[18];n=18的蜆則分布于淡水水域,且為多倍體[19]。這種染色體數(shù)目的變化或許是蜆屬貝類空間入侵演化的結(jié)果,即蜆在從海水到淡水的入侵演化過(guò)程中[37～38],1號(hào)和2號(hào)染色體逐漸融合[20],使單倍體數(shù)逐漸由n=19演化為n=18[27]。

圖3 沅江蜆的性腺組織切片(A～B)雄性;(C)雌性;(D)雌雄同體。Fig.3 Gonad tissue sections of Corbicula clams from the Yuan River(A～B)Male;(C)Female;(D)Hermaphrodite.

圖4 沅江不同倍性蜆的性別比例Fig.4 Sex ratio of Corbicula clams with different ploidies from the Yuan River

沅江二倍體蜆和三倍體蜆的核型公式分別為2n=36=2M+2SM+32ST和3n=54=3M+15SM+36ST,兩種核型中均僅有1對(duì)M染色體,且該染色體在形態(tài)上明顯大于其他染色體,此結(jié)果與黃勤[27]、Papk等[39]的研究結(jié)果相似。此外,二倍體蜆的SM染色體和ST染色體分別為1對(duì)和16對(duì),而三倍體蜆則分別為5對(duì)和12對(duì)。福建閩江二倍體河蜆的M染色體、SM染色體和ST染色體分別為1對(duì)、13對(duì)和4對(duì);四川安岳縣三倍體河蜆的上述染色體分別為2對(duì)、13對(duì)和3對(duì),兩者均含有較多的SM染色體,而ST染色體相對(duì)較少。對(duì)比以上數(shù)據(jù)可知,沅江蜆的ST染色體數(shù)量高于福建閩江與四川安岳兩地的河蜆。有研究顯示,動(dòng)物在進(jìn)化過(guò)程中,體細(xì)胞核型將由含較多ST染色體逐漸向以M和SM染色體為主進(jìn)行演化[40～41],因此推測(cè)沅江蜆較福建閩江和四川安岳縣溪流中的河蜆更為原始。

3.2 蜆的倍性與形態(tài)

動(dòng)物的三倍體較其二倍體多一套染色體,且其個(gè)體一般較二倍體大,如三倍體太平洋牡蠣較二倍體表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)[42]。但本研究中的三倍體蜆較二倍體并無(wú)顯著的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),表現(xiàn)為不同倍性蜆的SL、SW、SH均無(wú)顯著差異,僅SW/SL的比值存在顯著差異(P＜0.05)(表1)。此外,大量研究顯示不同殼色蜆的外殼形態(tài)之間差異不顯著。Qiu等[21]利用殼色特征對(duì)蜆的倍性進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)黃殼河蜆均為三倍體,而棕殼河蜆均為四倍體,且兩種殼色蜆的SL、SW和SH沒有顯著差異,僅三倍體蜆的SW/SL和SW/SH比值顯著大于四倍體。Wang等[11]研究報(bào)道,大通湖白色和紫色殼蜆的SL、SW和SH也均無(wú)顯著差異。雖然本研究顯示二倍體蜆的SW/SL比值顯著大于三倍體蜆,但是否可利用該比值簡(jiǎn)便地判斷沅江蜆的倍性還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。盡管如此,洪澤湖棕殼河蜆的SL、SW、SH及濕重均大于黃殼河蜆,而SL/SH比值則小于黃殼群體[43]。相關(guān)研究對(duì)香港新界河蜆的4種等位酶(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和磷酸葡萄糖變位酶1/2)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示白殼和紫殼河蜆的4個(gè)等位基因均沒有顯著差異,且遺傳距離小[44～45]。Britton等[46]也認(rèn)為,蜆殼的顏色和大小的多樣性是環(huán)境作用的結(jié)果,而非遺傳差異所致。但也有研究表明,即使在同樣的環(huán)境條件下,蜆在殼色和形態(tài)特征方面也存在顯著差異,由此認(rèn)為形態(tài)差異為遺傳因素所致,而非環(huán)境條件不同造成[17]。因此,蜆屬貝類形態(tài)特征多樣性的形成原因值得深入研究。

3.3 蜆的倍性與性別

已有研究表明,洞庭湖蜆存在雌雄異體和雌雄同體兩種性別系統(tǒng),且以雌雄同體為主,雌雄同體、雌性及雄性的個(gè)體比例約為16∶5∶4[47]。本研究結(jié)果顯示,沅江蜆中雌雄同體的個(gè)體共占51.1%,其次為雄性個(gè)體,占28.9%,雌性個(gè)體占20.0%(圖4),再次證實(shí)洞庭湖流域的蜆以雌雄同體為主,雌雄異體并存。相關(guān)研究報(bào)道,二倍體蜆均為雌雄異體,而多倍體蜆均為雌雄同體[48～49]。比如:中國(guó)福建閩江的二倍體河蜆[27]、日本琵琶湖的二倍體蜆C.sandai[50]、韓國(guó)二倍體蜆C.japonica[18]均為雌雄異體,入侵地蜆均為三倍體且雌雄同體[19],中國(guó)四川安岳縣溪流中的三倍體和四倍體蜆C.fluminea也均為雌雄同體。但是,本研究結(jié)果顯示沅江蜆的倍性與性別之間沒有顯著的相關(guān)性,即二倍體蜆中雌雄同體共占53.4%,雄性與雌性各占23.3%;三倍體蜆中雌雄同體占46.7%,雄性占40.0%,雌性僅占13.3%。Okamoto等[50]認(rèn)為蜆在從沿海到內(nèi)陸的入侵演化過(guò)程中,染色體的單倍體數(shù)目減少,由n=19演化為n=18,但倍性逐漸多倍化,且性別也由雌雄異體逐步向雌雄同體為主演化[51]。因此,有必要從大尺度上分析鹽度等環(huán)境因子對(duì)蜆屬貝類倍性和性別特征的影響,從而全面解析蜆屬貝類倍性和生殖特征的空間演化機(jī)制。