劉亭亭 曾隕濤 汪漢成 蔡劉體 張長(zhǎng)青

摘 要：為了解不同成熟度煙葉葉際微生物在代謝功能與群落組成上的差異，采用Biolog ECO代謝表型及高通量測(cè)序技術(shù)研究了赤星病發(fā)生期不同成熟度（成熟、適熟、未熟）煙葉葉際微生物代謝功能與群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，3種成熟度煙葉葉際微生物在代謝功能上存在較大差異，成熟煙葉葉際微生物代謝活性最強(qiáng)，其次依次為適熟、未熟煙葉，其中均能高效代謝的碳源為L(zhǎng)-天冬酰胺酸，均一般或弱代謝的碳源為2-羥基苯甲酸、L-苯基丙氨酸、α-環(huán)式糊精、γ-羥基丁酸和苯乙基胺。3種煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌、細(xì)菌菌門(mén)均分別為子囊菌門(mén)和變形菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)真菌屬均為鏈格孢屬、枝孢霉屬、亞隔孢殼屬和Symmetrospora，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬均為假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬。3種煙葉葉際真菌中，成熟煙葉葉際子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度最高，且均顯著高于未熟煙葉;3種煙葉葉際細(xì)菌中，未熟煙葉的變形菌門(mén)相對(duì)豐度最高，且顯著高于適熟煙葉。3種成熟度煙葉真菌群落和細(xì)菌群落在多樣性（Shannon、Simpson）上均無(wú)顯著性差異，但成熟煙葉葉際真菌群落豐富度（ACE）最高，其次依次為適熟、未熟煙葉，且成熟煙葉顯著高于未熟煙葉。

關(guān)鍵詞：成熟度;群落結(jié)構(gòu);代謝功能;Biolog ECO;高通量測(cè)序

Abstract： This study was conducted to investigate the differences of metabolic function and community composition in the phyllosphere of tobacco brown spot leaves at different maturity stages. The technologies of Biolog ECO metabolic phenotype and high-throughput sequencing were used to analyze three different maturity level tobacco leaves （mature， proper， immaturate） during brown spot occurring season. The results showed there were significant differences in the metabolic functions of tobacco phyllosphere microorganisms from three different maturity tobacco leaves. The highest metabolic activity was found in phyllosphere miroorganism from mature tobacco leaves， followed by the proper and immaturate tobacco leaves. L-Asparagine was the only carbon source that could be effectively metabolized in all three kinds leaf samples， while 2-Hydroxybenzoic Acid， L-Phenylalanine， α-Cyclodextrin， γ-Hydroxybutyric Acid and Phenylethylamine were all moderately or poorly metabolized in the three maturity leaves samples. The dominant phyla of fungi and bacterium of tobacco leaves at three maturity stages were Ascomycota and Proteobacteria， respectively. The dominant fungal genera were Alternaria， Cladosporium， Didymella and Symmetrospora， and the dominant bacterial genera were Pseudomonas and Sphingomonas. Among the three kinds of tobacco phyllosphere fungi， the relative abundance of Ascomycota and Basidiomycota in mature tobacco leaves was the highest， and the relative abundance of mature tobacco leaves was significantly higher than that of immature tobacco leaves. Among the three kinds of tobacco phyllosphere bacteria， the relative abundance of Proteobacteria in immature tobacco leaves was the highest and significantly higher than that in proper tobacco leaves. There were no significant differences in fungal community diversity and bacterial community diversity （Shannon， Simpson） for phyllosphere microorganisms between tobacco leaves at different maturity stages. However， the phyllosphere fungal community richness （ACE） of mature tobacco leaves was the highest， followed by that of proper and immaturate tobacco leaves， and the ACE of mature tobacco leaves was significantly higher than that of immature tobacco leaves.

Keywords： maturity; community structure; metabolic function; Biolog ECO; high-throughput sequencing

煙草（Nicotiana tabacum L.）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，我國(guó)每年種植面積約100萬(wàn)hm2，產(chǎn)銷量均約占世界總量的1/3[1-2]。該作物在煙葉成熟期分層落黃，下部葉片先成熟，其后為中部葉和上部葉，成熟煙葉在化學(xué)成分協(xié)調(diào)性、物理感官質(zhì)量及煙葉品質(zhì)上均優(yōu)于適熟和未熟葉片[3]。生產(chǎn)上需要根據(jù)煙葉成熟度分次逐批采烤，整個(gè)采烤期可持續(xù)約50 d左右。在煙葉采烤期，常有多種真菌性和細(xì)菌性病害發(fā)生。其中，最普遍和嚴(yán)重的為煙草赤星病（Tobacco brown spot）。該病害在煙葉打頂前少有發(fā)生，主要發(fā)生于煙葉成熟期，常先侵染底部腳葉，再逐步向中上部葉片擴(kuò)展，成熟期有多次侵染循環(huán)[4]。

煙葉葉際存在大量微生物[5]，已有研究發(fā)現(xiàn)煙葉葉際真菌有鏈格孢屬（Alternaria）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）等菌屬[6];葉際細(xì)菌有泛菌屬（Pantoea）、假單孢菌屬（Pseudomonas）等菌屬[7]。然而，這些微生物在葉際的代謝功能和種群結(jié)構(gòu)是否與煙葉成熟度及病害發(fā)生間存在聯(lián)系，尚缺乏了解。Biolog ECO代謝表型技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)是微生物生態(tài)學(xué)研究的主要技術(shù)，可揭示生態(tài)環(huán)境下微生物的代謝功能與群落結(jié)構(gòu)，正被廣泛用于包括土壤[8]、水體[9]等多個(gè)生態(tài)環(huán)境的研究，也曾被用于揭示烘烤期煙葉霉?fàn)€病的發(fā)生災(zāi)變機(jī)制[10]。因此，本文以赤星病發(fā)生期田間不同成熟度健康煙葉為研究對(duì)象，采用這2種技術(shù)，研究成熟、適熟及未熟煙葉葉際微生物代謝功能與群落結(jié)構(gòu)特征，以期揭示大田赤星病發(fā)生流行季節(jié)煙葉葉際微生物生態(tài)學(xué)規(guī)律，為赤星病發(fā)生的微生態(tài)災(zāi)變機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為云煙87（赤星病中抗品種[11]）。Biolog ECO代謝板（貨號(hào)：#1056），購(gòu)自美國(guó)Biolog公司（USA，CA，Hayward），GeneJET膠回收試劑盒和Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒，均購(gòu)自Thermo Scientific公司。

1.2 樣品采集

于2020年7月15日，在貴州省晴隆縣赤星病發(fā)病煙田取不同成熟度健康煙葉（肉眼可見(jiàn)無(wú)葉斑部分，但是植株有感赤星病）樣品15 g，裝入50 mL無(wú)菌離心管中，3組樣品分別編號(hào)為QL1（成熟，從下向上第3葉位）、QL2（適熟，第6葉位）、QL3（未熟，第9葉位），每處理3次重復(fù)，成熟度的劃分參照生產(chǎn)實(shí)踐和文獻(xiàn)[12-13]。成熟煙葉樣品編號(hào)為QL11、QL12、QL13，適熟樣品編號(hào)為QL21、QL22、QL23，未熟樣品編號(hào)為QL31、QL32、QL33。樣品采集后放入低溫保存箱，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。5 g煙葉樣品用于Biolog ECO代謝功能研究;10 g樣品保藏于?80 ℃冰箱，用于葉際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究。

1.3 不同成熟度煙葉葉際微生物代謝功能分析

分別取3種成熟度煙葉混合樣1 g，置于盛有50 mL 0.8%無(wú)菌生理鹽水的100 mL三角瓶中，28 ℃下180 r/min振蕩搖培2 h，靜置30 min，取100 μL上清液依次加入到ECO代謝板[14]。接菌后的ECO代謝板置于OmniLog恒溫培養(yǎng)箱，28 ℃培養(yǎng)7 d，采用Biolog D5E_OKA_data.exe軟件收集葉際微生物代謝孔內(nèi)顏色變化值，根據(jù)顏色變化值，分析其代謝功能。

1.4 不同成熟度煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析

采用CTAB法[15]進(jìn)行微生物基因組DNA的提取，樣品DNA純度和濃度用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將提取的DNA置于離心管中，并用無(wú)菌水稀釋至濃度為1 ng/μL，以此為模板，使用引物ITS1-5F-F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）、ITS1-1F-R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）與515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）、806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）分別對(duì)真菌ITS1區(qū)域與細(xì)菌V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。參照文獻(xiàn)[7，10]的方法進(jìn)行多樣性測(cè)序與分析，真菌和細(xì)菌分別通過(guò)Unit（7.2）和SILVA132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋，分析在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用DPS 7.5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用LSD（Least Significant Difference）法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同成熟度煙葉葉際微生物代謝功能

不同成熟度煙葉葉際微生物代謝活性間有較大差異，葉際微生物高效代謝碳源種類數(shù)量最多的為成熟煙葉（QL1，25種），其次依次為適熟煙葉（QL2，17種）和未熟煙葉（QL3，1種）（表1）。3種成熟度煙葉葉際微生物均能強(qiáng)代謝的碳源有1種，為氨基酸類的L-天冬酰胺酸（L-Asparagine）;代謝活性一般或弱的碳源有5種，分別為酚類的2-羥基苯甲酸（2-Hydroxy Benzoic Acid）、氨基酸類的L-苯基丙氨酸（L-Phenylalanine）、聚合物類的α-環(huán)式糊精（α-Cyclodextrin）、羧酸類的γ-羥基丁酸（γ-Hydroxybutyric Acid）、胺類的苯乙基胺（Phenylethyl-Amine）。成熟煙葉（QL1）葉際微生物特有的代謝活性強(qiáng)的碳源有9種，包括L-精氨酸（L-Arginine）、D-木糖（D-Xylose）與I-赤蘚糖醇（I-Erythritol）等;適熟煙葉（QL2）葉際微生物特有的代謝活性強(qiáng)的碳源有1種，為D，L-α-甘油（D，L-α-Glycerol）;未熟煙葉（QL3）無(wú)特有代謝活性強(qiáng)的碳源。

2.2 不同成熟度煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性

2.2.1 測(cè)序深度分析 采用隨機(jī)的方式抽取數(shù)據(jù)，以隨機(jī)抽取的有效序列數(shù)（Sequences Number）為橫坐標(biāo)，以O(shè)TU數(shù)目（OTU Number）為縱坐標(biāo)，構(gòu)建稀釋曲線，從圖1中可以看出隨著測(cè)序數(shù)目的增加，所有樣品的稀釋曲線漸漸趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序深度已充足，測(cè)序數(shù)可以覆蓋樣品里的大部分真菌、細(xì)菌。

2.2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控分析 以97%一致性（Identity）將測(cè)序序列聚類成OTUs，分別與數(shù)據(jù)庫(kù)Unit和數(shù)據(jù)庫(kù)SSUrRNA比對(duì)，進(jìn)行物種注釋，能夠注釋到真菌數(shù)據(jù)庫(kù)的OTUs數(shù)目為49（100.00%），注釋到界、門(mén)、綱、目、科、屬、種水平的比例分別為100.00%、55.10%、55.10%、55.10%、50.00%、46.90%、30.60%，共鑒定出真菌的2個(gè)門(mén)、21個(gè)屬和15個(gè)種。能夠注釋到細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)的OTUs數(shù)目為115（96.6%），注釋到界、門(mén)、綱、目、科、屬、種水平的比例分別為96.60%、81.50%、75.60%、71.40%、64.70%、58.00%、27.70%，共鑒定出細(xì)菌的10個(gè)門(mén)、47個(gè)屬和33個(gè)種。

2.2.3 不同成熟度煙葉葉際微生物群落Alpha多樣性 結(jié)果表明（表2），真菌和細(xì)菌群落的覆蓋度指數(shù)均達(dá)到0.85以上，表明測(cè)序數(shù)據(jù)合理，可以真實(shí)、合理地反映微生物群落多樣性。ACE指數(shù)反映群落豐富度，成熟煙葉（QL1）真菌群落ACE指數(shù)顯著高于未熟煙葉（QL3）（p<0.05）;不同成熟度煙葉細(xì)菌群落ACE指數(shù)間無(wú)顯著性差異。Simpson和Shannon指數(shù)反映群落多樣性，不同成熟度煙葉葉際真菌群落、細(xì)菌群落間均無(wú)顯著性差異（p>0.05）。

2.2.4 不同成熟度煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu) 在門(mén)水平，不同成熟度煙葉真菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為子囊菌門(mén)（Ascomycota），其中成熟煙葉（QL1）的子囊菌門(mén)相對(duì)豐度顯著高于適熟（QL2）與未熟煙葉（QL3），成熟煙葉（QL1）的擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度顯著高于未熟煙葉（QL3）（表3）。在屬水平，3種成熟度煙葉均有的主要菌屬有亞隔孢殼屬（Didymella）、鏈格孢屬、枝孢霉屬（Cladosporium）及Symmetrospora。莖點(diǎn)霉屬、尾孢屬（Cercospora）及Symmetrospora，其豐度隨著成熟度增加而增加。成熟煙葉優(yōu)勢(shì)真菌屬（≥1.00%）有Albifimbria（7.81%）與小不整球殼屬（4.69%）等10種菌屬;適熟煙葉的優(yōu)勢(shì)菌屬（≥1.00%）有亞隔孢殼屬（5.21%）與鏈格孢屬（3.13%）等7種菌屬;未熟煙葉的優(yōu)勢(shì)菌屬（≥1.00%）有亞隔孢殼屬（5.73%）與鏈格孢屬（1.56%）等6種菌屬。成熟煙葉獨(dú)有的菌屬有Albifimbria（7.81%）與小不整球殼屬（4.69%）等5種，適熟煙葉獨(dú)有的菌屬有派倫霉屬（Peyronellaea，1.04%）、Paraphaeosphaeria（1.04%）、蒼白尾孢屬（Pallidocercospora，0.52%）;未熟煙葉無(wú)特有菌屬真菌。除莖點(diǎn)霉屬、小不整球殼屬（Plectosphaerella）外，其余菌屬豐度在不同成熟度煙葉間無(wú)顯著性差異。原始測(cè)序數(shù)據(jù)均上傳至GenBank（BioProject ID：PRJNA783754;Biosample accession：SUB10724066）。

在門(mén)水平，不同成熟度煙葉細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為變形菌門(mén)（Proteobacteria），未熟煙葉（QL3）變形菌門(mén)相對(duì)豐度顯著高于適熟煙葉（QL2）（表4）。成熟煙葉（QL1）樣品特有菌門(mén)有7種，為擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes，0.16%）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi，0.11%）等，適熟煙葉QL2和未熟煙葉QL3無(wú)特有菌門(mén)。在屬水平，不同成熟度煙葉均有的優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）。成熟煙葉QL1優(yōu)勢(shì)菌屬（≥0.50%）為假單孢菌屬（1.17%）、鞘氨醇單胞菌屬（1.00%）和Romboutsia（0.88%）等5種菌屬;適熟煙葉QL2優(yōu)勢(shì)菌屬（≥0.50%）為鞘氨醇單胞菌屬（0.93%）和假單孢菌屬（0.52%）;未熟煙葉QL3優(yōu)勢(shì)菌屬（≥0.50%）為未分類的根瘤菌科（unidentified Rhizobiaceae，2.46%）與假單孢菌屬（2.34%）等6種菌屬。成熟煙葉特有菌屬為Romboutsia（0.88%）、Ammoniphilus（0.53%）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter，0.39%）等14種菌屬;適熟、未熟煙葉無(wú)特有菌屬。在3種成熟度煙葉中，未熟煙葉（QL3）未分類的根瘤菌科、泛菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）和黃桿菌屬（Xanthomonas）的相對(duì)豐度顯著高于適熟煙葉（QL2）和成熟煙葉（QL1），其中假單胞菌屬相對(duì)豐度顯著高于適熟煙葉（QL2）。原始測(cè)序數(shù)據(jù)均上傳至GenBank（BioProject ID：PRJN697842;Biosample accession：SAMN17673832）。

3 討 論

碳源是微生物生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，利用Biolog ECO代謝表型技術(shù)可以反映生態(tài)環(huán)境中所有微生物對(duì)31種常見(jiàn)碳源的代謝能力，進(jìn)而反映環(huán)境微生物定殖的營(yíng)養(yǎng)需求特性。本文發(fā)現(xiàn)赤星病發(fā)生期不同成熟度健康煙葉葉際微生物均可高效代謝L-天冬酰胺酸，均較弱代謝2-羥基苯甲酸和L-苯基丙氨酸等碳源。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)2-羥基苯甲酸可誘導(dǎo)植物激活抗病基因，提高植株的抗真菌、細(xì)菌能力[16]。為此，推測(cè)L-天冬酰胺酸為有利于健康煙葉葉際微生物定殖的有益碳源，2-羥基苯甲酸等碳源則與之相反，為非有益碳源。這些能被高效代謝的碳源是否存在于葉際，是否為煙葉葉際分泌物，與葉際微生物間定殖的關(guān)系如何，是否可以通過(guò)添加有益碳源或非有益碳源來(lái)調(diào)控?zé)熑~葉際微生物菌群或減輕病害發(fā)生，等，有待下一步研究與驗(yàn)證。此外，不同成熟度煙葉葉際微生物代謝特征存在較大差異，葉際微生物高效代謝碳源種類數(shù)量為成熟煙葉（25種）>適熟煙葉（17種）>未熟煙葉（1種），可能為不同成熟度煙葉葉際的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)間存在差異所致;也可能為不同成熟度煙葉葉際微生物的種群和數(shù)量間的差異所致，均有待下一步深入研究。

了解病害發(fā)生和危害期葉際微生物群落結(jié)構(gòu)是葉部病害災(zāi)變規(guī)律研究的基礎(chǔ)，已有諸多關(guān)于赤星病煙葉組織葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的報(bào)道。劉暢等[6-7]報(bào)道了田間感赤星病煙葉組織的優(yōu)勢(shì)真菌有鏈格孢屬、莖點(diǎn)霉屬、枝孢霉屬等;優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有為泛菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬等。向立剛[17]等報(bào)道了赤星病感病和健康烤后煙葉組織的優(yōu)勢(shì)真菌有鏈格孢屬、紅酵母屬（Rhodotorula）。相比而言，本文分析了赤星病發(fā)生期田間不同成熟度健康煙葉組織的微生物群落結(jié)構(gòu)，雖然取樣組織和時(shí)期不同，但均發(fā)現(xiàn)煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌鏈格孢屬及優(yōu)勢(shì)細(xì)菌假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬。為此，推測(cè)這些真菌及細(xì)菌為煙葉葉際優(yōu)勢(shì)微生物種群。同時(shí)，這些微生物中，鏈格孢屬、莖點(diǎn)霉屬、亞隔孢殼屬均被報(bào)道能引起煙草葉斑類病害[18-20]，推測(cè)它們?yōu)闊熑~葉際核心病原菌種群，在赤星病發(fā)生后，這些病原菌因共生可引起復(fù)合侵染。本文煙葉樣品采集期為赤星病發(fā)生期，發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬真菌（赤星病病原菌）豐度在3種成熟度煙葉上均較高且無(wú)顯著差異，而成熟煙葉的莖點(diǎn)霉屬和小不整球殼屬相對(duì)豐度顯著高于適熟和未熟煙葉，未熟煙葉上未分類的根瘤菌科、泛菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬等菌屬的相對(duì)豐度顯著高于適熟和成熟煙葉，結(jié)果進(jìn)一步揭示了病害發(fā)生期葉際主要病原的空間分布規(guī)律。此外，本文發(fā)現(xiàn)成熟煙葉葉際真菌豐富度指數(shù)顯著高于未熟煙葉，且成熟煙葉葉際特有真菌種類也高于適熟、未熟煙葉樣品，如Albifimbria、Pantospora及小不整球殼屬等。其差異原因，可能與不同成熟度煙葉在糖、煙堿、淀粉等化學(xué)成分含量上均存在差異[21]有關(guān)，成熟葉片的化學(xué)成分、葉片分泌物、葉片結(jié)構(gòu)等可能更有利于更多微生物定殖的相關(guān)假說(shuō)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本文基于Biolog ECO代謝表型技術(shù)及高通量測(cè)序技術(shù)研究了赤星病發(fā)生期不同成熟度（成熟、適熟、未熟）煙葉葉際微生物代謝功能與群落結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)成熟煙葉葉際微生物代謝功能和葉際真菌群落豐富度（ACE）最高，其次依次為適熟煙葉、未熟煙葉;煙葉真菌群落和細(xì)菌群落在多樣性（Shannon、Simpson）上均無(wú)顯著性差異。3種成熟度煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌、細(xì)菌菌門(mén)均分別為子囊菌門(mén)和變形菌門(mén);優(yōu)勢(shì)真菌屬均為鏈格孢屬、枝孢霉屬、亞隔孢殼屬和Symmetrospora，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬均為假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬。3種煙葉葉際真菌中，成熟煙葉葉際子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度最高，其次依次為適熟、未熟煙葉，且成熟煙葉均顯著高于未熟煙葉;3種煙葉葉際細(xì)菌中，未熟煙葉的變形菌門(mén)相對(duì)豐度最高，且顯著高于適熟煙葉。

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