不同物種龍葵對鎘脅迫的生理響應(yīng)研究

花 莉， 馬 倩， 常江峰， 楊春燕

(陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 引言

土壤作為環(huán)境介質(zhì)之一，是人類不可或缺的重要資源.然而隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，頻繁的人類活動(dòng)引發(fā)了嚴(yán)重的土壤環(huán)境污染問題.而重金屬污染由于其毒性大，難降解性和隱蔽性等特點(diǎn)，使得現(xiàn)階段我國土壤重金屬污染較為嚴(yán)重.鎘是環(huán)境中毒性最強(qiáng)的重金屬之一，具有很強(qiáng)的從土壤向植物遷移的能力，且極易被植物吸收積累[1].當(dāng)土壤中的鎘含量超過一定值時(shí)則會(huì)引起植物的毒害作用，可表現(xiàn)為植株的生長緩慢、矮小和褪綠等，其細(xì)胞的膜透性、光合代謝、呼吸代謝、酶代謝和遺傳效應(yīng)等也會(huì)發(fā)生一些改變，從而導(dǎo)致生物量的下降[2,3].鎘一旦通過食物鏈進(jìn)入人體亦會(huì)造成嚴(yán)重而不可逆?zhèn)?，修?fù)治理鎘污染的土壤刻不容緩.與傳統(tǒng)的物理、化學(xué)和工程等修復(fù)手段相比，植物修復(fù)方法簡單易操作，能耗較低，且成本低廉，有利于保持土壤生態(tài)環(huán)境系統(tǒng).因此，選擇植物修復(fù)鎘污染土壤具有一定研究意義.

龍葵(Solanumnigrum)作為一種鎘的超富集植物[4]，具有耐Cd毒害和富集Cd的能力，因其繁殖能力強(qiáng)、生長迅速、生物量大等優(yōu)勢[5]，成為潛在的鎘污染修復(fù)優(yōu)勢植物[6].有研究表明，對于Cd敏感的植物來說，短時(shí)間Cd污染或Cd處理明顯干擾其正常生長發(fā)育，表現(xiàn)為生長受抑、葉綠素含量降低等[7-9].郭智等[10]發(fā)現(xiàn)在Cd的脅迫下龍葵葉片的光合作用會(huì)受到抑制，但其光合生理響應(yīng)以及主要的光合限速因子還有待研究.本研究通過考察Cd對不同物種龍葵的生長及生理響應(yīng)的影響，旨在為龍葵的耐鎘機(jī)理研究提供一定的理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 供試材料

供試龍葵種子分別選自吉林長春德惠市、漢中寧強(qiáng)縣、廣東九龍山，編號分別為JL，HZ，GD.JL是紅果龍葵(SolanumalatumMoench)，HZ是黃果龍葵(Solanumdiphyllum)，GD是少花龍葵(SolallumnigrumL.verPauciflorumLiou).

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選飽滿圓潤、大小均一的種子用去離子水浸泡后均勻播種于穴盤，置于人工培養(yǎng)間，每隔兩天澆一次水.培養(yǎng)條件為：晝夜溫度26 ℃/20 ℃，晝夜時(shí)間16 h /8 h，相對濕度60% 左右.待大部分幼苗長出3片真葉后轉(zhuǎn)至藍(lán)色周轉(zhuǎn)箱，用1/2 Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)四周，根據(jù)幼苗長勢，3～5天更換一次培養(yǎng)液.幼苗生長4周后株高約18～20 cm.挑選長勢良好且一致的龍葵轉(zhuǎn)移至黑色水培罐中進(jìn)行Cd脅迫處理.其中Cd以CdCl2·2.5H2O形式加入1/2 Hoagland培養(yǎng)液中，設(shè)置Cd2+濃度梯度分別為0(CK)、5、10、15、20、25、50、100 mg·L-1，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行.

1.3 測定方法

各項(xiàng)生理指標(biāo)：將龍葵的根、莖和葉用清水沖洗，再用去離子水洗凈，于105 ℃下殺青30 min，然后在 80 ℃下烘至恒重，測定干重.葉綠素采用丙酮乙醇混合液提取法測定[4]，丙二醛(MDA)含量用硫代巴比妥(TBA)酸法測定[10]，超氧化物歧化酶(SOD)活性用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測定[11]，過氧化物酶(POD)活性用愈創(chuàng)木酚法測定[11]，過氧化氫酶(CAT)活性用過氧化氫法測定[12].

2 結(jié)果與討論

2.1 Cd脅迫對龍葵生物量的影響

由表1可知，在Cd處理7 d后，除GD的根和葉的生物量呈逐漸下降的趨勢外，其余兩種龍葵的根、莖、葉和GD的莖的生物量均呈先升高后降低的趨勢.當(dāng)Cd處理濃度為5 mg·L-1時(shí)，JL的根、莖、葉的生物量都分別達(dá)到最大值0.103 5 g，0.193 8 g，0.439 6 g，分別是對照的1.01倍、1.19倍和1.35倍.當(dāng)Cd處理濃度≥10 mg·L-1時(shí)，JL的根生物量低于對照7.02%～71.47%，當(dāng)Cd處理濃度≥20 mg·L-1時(shí)，JL的莖生物量低于對照11.52%～42.83%，葉的生物量顯著低于對照17.04%～48.46%.當(dāng)Cd處理濃度為5 mg·L-1時(shí)，HZ的根、莖、葉的生物量都分別達(dá)到最大值0.112 5 g、0.174 9 g和0.438 2 g，分別是對照的1.74倍、1.07倍和1.33倍.當(dāng)Cd處理濃度≥20 mg·L-1時(shí)，HZ的根生物量顯著低于對照14.57%～61.55%(P<0.05)，當(dāng)Cd處理濃度≥10 mg·L-1時(shí)，HZ的莖生物量顯著低于對照19.94%～74.54%(P<0.05)，葉的生物量顯著低于對照1.6%～41.93%(P<0.05).GD只有莖的生物量呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，根和葉的生物量隨著Cd處理濃度的增加而減少.當(dāng)Cd處理濃度為5 mg·L-1時(shí)，GD莖的生物量最大，是對照的1.16倍.當(dāng)Cd處理濃度≥15 mg·L-1時(shí)，GD的根生物量顯著低于對照18.09%～51.33%(P<0.05)，當(dāng)Cd處理濃度≥20 mg·L-1時(shí)，莖生物量顯著低于對照26.58%～34.98%(P<0.05).

表1 不同濃度 Cd 脅迫7d后龍葵的根、莖、葉的生物量

植物對重金屬的耐性可以根據(jù)植物地上部以及根系生物量的變化作為指標(biāo)[13]，土壤Cd含量過高會(huì)對植物產(chǎn)生一定的毒害作用，表現(xiàn)為植物體葉綠素結(jié)構(gòu)破壞，植物葉、莖黃化甚至脫落，根系的生長由于水分以及營養(yǎng)物質(zhì)的減少遭受一定阻礙，導(dǎo)致植物的生物量降低[14].植物在受到惡劣環(huán)境的影響時(shí)，生長的變化是可以最先觀察到的指標(biāo)響應(yīng)，尤其是在受到污染的土壤上生長的植物，其根部需要直接從土壤里汲取營養(yǎng)，會(huì)快速地表現(xiàn)出毒害特征[15].而低濃度會(huì)刺激植物生長，高濃度會(huì)抑制植物的生長，即“低促高抑”現(xiàn)象[16].王濤等[17]通過水培試驗(yàn)研究鎘對龍葵幼苗生長的影響，結(jié)果表明，低濃度Cd處理(<25μmol·L-1)對龍葵幼苗干物質(zhì)量的影響不明顯，甚至對某些參數(shù)有一定的促進(jìn)作用，高濃度Cd處理(>50μmol·L-1)對龍葵幼苗的生理指標(biāo)有抑制作用.本研究中，低濃度Cd處理對GD的根和葉同樣造成了抑制作用，而對另外兩種龍葵還有一定的促增長作用.

2.2 Cd脅迫對龍葵葉綠素含量的影響

在Cd脅迫下，3種龍葵的葉片的葉綠素含量隨Cd處理濃度的增加均有所降低(如圖1所示)，與CK相比，JL、HZ、GD的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素均顯著降低(P<0.05).JL、HZ、GD(按此順序，下同)的葉綠素a分別降低4.12%～50%，6.4%～59%，9%～41%，葉綠素b分別降低0.47%～51.16%，10.2%～46.94%，4.65%～39.53%，類胡蘿卜素分別降低6.06%～41.82%，16.67%～22.22%，17.65%～41.18%；在Cd脅迫下，HZ的葉綠素a含量最大降低了59%，JL的葉綠素b含量最大降低了46.94%，JL和GD的類胡蘿卜素含量下降幅度相近，而HZ的類胡蘿卜素含量下降幅度較小.

(a)JL葉綠素含量

3種龍葵的葉片的葉綠素含量隨Cd處理濃度的增加而降低，而HZ的葉片的葉綠素含量受到的抑制作用最小.大量的研究結(jié)果表明逆境脅迫會(huì)降低植物葉片的葉綠素含量，而較高的葉綠素含量是維持植物正常光合作用的基礎(chǔ)，另外，還有一些研究發(fā)現(xiàn)，Cd 脅迫還會(huì)直接影響葉綠體數(shù)量并使其減少或破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)[18].孫瑞蓮[19]研究龍葵和茄子對Cd脅迫的耐性特征，在低Cd水平下(T1和T2)，龍葵的葉綠素含量與對照相比無顯著差異(P>0.05)，但隨著Cd濃度的升高，葉綠素含量顯著降低(P<0.05)，而Cd處理顯著影響茄子的葉綠素含量.王濤等[17]也研究發(fā)現(xiàn)10μmol·L-1Cd處理下，龍葵幼苗葉片中的色素含量較對照顯著降低，隨著Cd處理濃度的增加，葉片色素遭到更大的破壞，具有一定的濃度效應(yīng).

2.3 Cd脅迫對龍葵丙二醛(MDA)含量的影響

在Cd脅迫下，3種龍葵的根和葉的MDA含量都隨著Cd濃度均不同程度呈先增加后下降趨勢(如圖2所示).JL的根和葉的MDA含量均在Cd處理濃度為10 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值，隨后根的MDA含量一直下降，在Cd處理濃度≥50 mg·L-1，MDA含量顯著低于CK(P<0.05)，葉的含量雖一直下降，卻始終高于CK；HZ、GD的根和葉的MDA含量分別在Cd處理濃度為25 mg·L-1、20 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值，隨后根和葉的MDA含量都開始下降，但仍顯著高于CK(P<0.05).

(a)JL丙二醛(MDA)含量

衰老或逆境環(huán)境下的植物會(huì)產(chǎn)生過量自由基，這些自由基會(huì)引發(fā)植物體內(nèi)膜脂過氧化作用，其毒性產(chǎn)物丙二醛(MDA)是植物在環(huán)境脅迫下膜脂過氧化而產(chǎn)生的一種具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，其含量常作為反映逆境條件下植物受傷害程度的指標(biāo)之一[20]，MDA 的積累說明植物細(xì)胞膜脂過氧化加重，植物細(xì)胞中MDA含量越多，植物受損傷越嚴(yán)重[21].本研究中Cd脅迫下，3種龍葵的根和葉的MDA含量都隨著Cd濃度先增加后降低，但高濃度處理時(shí)的龍葵的MDA含量都依舊高于對照(JL的根部MDA含量在高濃度處理時(shí)低于對照).而唐秀梅等[22]利用采自金華北山的龍葵種子在水培試驗(yàn)下研究龍葵的耐性，發(fā)現(xiàn)在處理34 d時(shí)，Cd處理100 mg·L-1時(shí)MDA含量比對照增加了289.5%.曾秀存等[23]研究Cd脅迫對紅果龍葵生理特性的影響，發(fā)現(xiàn)在25μmol·L-1和50μmol·L-1處理6 d時(shí)，丙二醛含量是對照的117.00%和154.50%.本研究中丙二醛含量在高濃度Cd處理時(shí)含量反而下降，可能是因?yàn)樵谥袧舛菴d脅迫時(shí)龍葵的承受力已達(dá)到閾值，當(dāng)Cd處理濃度繼續(xù)升高時(shí)，植物的保護(hù)酶系統(tǒng)嚴(yán)重受損，且同時(shí)嚴(yán)重影響了龍葵對Cd脅迫的敏感性，出現(xiàn)反應(yīng)遲緩.重金屬脅迫下植物體內(nèi)都會(huì)產(chǎn)生ROS[24].ROS積累得不到及時(shí)清除就會(huì)引發(fā)膜脂過氧化作用，從而造成MDA的大量生成，這也是本研究中龍葵體內(nèi)MDA含量隨著Cd處理濃度的增加而增加的原因.

2.4 Cd脅迫對龍葵超氧化物歧化酶(SOD)的影響

本研究中，3種龍葵根和葉的SOD活性變化趨勢有所差異(如圖3所示)，大部分Cd處理濃度下，HZ的根和葉的SOD活性遠(yuǎn)大于JL和GD.在各Cd脅迫下，JL的根的SOD活性先增加后降低，在Cd處理濃度為50 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值，JL的葉的SOD活性隨著Cd處理濃度的增加而增加，當(dāng)Cd處理濃度≥15 mg·L-1時(shí)，葉的SOD活性顯著高于CK(P<0.05)；HZ、GD的根和葉的SOD活性都隨Cd處理濃度的增加而先增加后降低，在Cd處理濃度為25 mg·L-1時(shí)根的SOD活性均達(dá)到最大值，隨后活性顯著下降(P<0.05)，Cd處理濃度為15 mg·L-1時(shí)HZ葉的SOD活性達(dá)到最大值，Cd處理濃度為20 mg·L-1時(shí)，GD葉的SOD活性達(dá)到最大值，Cd處理濃度≥10 mg·L-1時(shí)，GD根的SOD活性顯著高于CK(P<0.05).

植物細(xì)胞中的活性氧在正常情況下其產(chǎn)生和清除達(dá)到平衡，逆境條件下則更利于活性氧的產(chǎn)生，其增加的活性氧會(huì)誘導(dǎo)SOD、POD、CAT等保護(hù)酶活性的升高，也會(huì)直接破壞生物大分子，使酶活性喪失[25].本研究中在各Cd脅迫下，HZ和GD的根和葉的SOD活性都隨Cd處理濃度的增加而先增加后降低，JL的根的SOD活性先增加后降低，但始終高于對照值，JL的葉的SOD活性隨著Cd處理濃度的增加而增加.

(a)JL超氧化物歧化酶(SOD)活性

2.5 Cd脅迫對龍葵過氧化物酶(POD)的影響

JL的葉中的POD活性隨著Cd處理濃度的增加先增加后降低，當(dāng)Cd處理濃度為25 mg·L-1時(shí)，POD活性達(dá)到最大值，是對照值的17倍(如圖4所示)，當(dāng)Cd處理濃度≥15 mg·L-1時(shí)，葉中的POD活性顯著高于對照6～17倍(P<0.05)； HZ的葉中的POD活性隨著Cd處理濃度的增加而增加，當(dāng)Cd處理濃度≥5 mg·L-1時(shí)，HZ的葉中的POD活性顯著高于對照5.4～16倍(P<0.05)；GD的葉中的POD活性隨著Cd處理濃度的增加而增加，當(dāng)Cd處理濃度≥20 mg·L-1時(shí)，GD的葉中的POD活性顯著高于對照6.7～38倍(P<0.05).

3種龍葵的根中的POD活性都隨著Cd處理濃度的增加先增加后降低，但活性大小有明顯的差異，其中HZ的POD活性遠(yuǎn)大于其他兩種龍葵(如圖5所示).當(dāng)Cd處理濃度為25 mg·L-1時(shí)，JL的根中的POD活性最大，是對照值的4倍，當(dāng)Cd處理濃度在10～50 mg·L-1時(shí)，根中的POD活性顯著高于對照1.4～4倍(P<0.05)；當(dāng)Cd處理濃度為15 mg·L-1時(shí)，HZ的根中的POD活性最大，是對照值的2.42倍，當(dāng)Cd處理濃度在5～25 mg·L-1時(shí)，根中的POD活性顯著高于對照1.83～2.42倍(P<0.05)；當(dāng)Cd處理濃度為20 mg·L-1時(shí)，GD的根中的POD活性最大，是對照值的3.09倍，當(dāng)Cd處理濃度在10～50 mg·L-1時(shí)，根中的POD活性顯著高于對照1.42～3.09倍(P<0.05).

圖5 不同Cd濃度處理下龍葵根系中POD活性

2.6 Cd脅迫對龍葵過氧化氫酶(CAT)的影響

3種龍葵根和葉的CAT活性基本呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(如圖6所示)，3種龍葵的根中的CAT活性在Cd處理濃度為25 mg·L-1時(shí)均呈現(xiàn)最大值，當(dāng)Cd處理濃度為15 mg·L-1時(shí)，JL葉中的CAT活性達(dá)到最大值，是對照值的13.45倍，當(dāng)Cd處理濃度在10～50 mg·L-1時(shí)，葉中的CAT活性顯著高于對照3.03～13.45倍(P<0.05)；當(dāng)Cd處理濃度為50 mg·L-1時(shí)，HZ的葉中的CAT活性最大，是對照值的6.32倍，當(dāng)Cd處理濃度≥5 mg·L-1時(shí)，HZ的葉中的CAT活性顯著高于對照2.25～6.32倍(P<0.05)；當(dāng)Cd處理濃度為20 mg·L-1時(shí)，GD的葉中的CAT活性最大，是對照值的3.64倍.

(a)JL過氧化氫酶(CAT)活性

超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)作為抗氧化保護(hù)系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，在抑制植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生及清除ROS發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[26,27].SOD通過歧化反應(yīng)將多余的活性氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2，POD和CAT都可以分解H2O2，不同的是POD除了分解H2O2的作用，還會(huì)參與植物體內(nèi)其他的生長代謝作用，而CAT則是生物抗氧化過程的終端，這三種抗氧化酶的互相配合則可以更好地清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的ROS，從而減輕對植物細(xì)胞的傷害.而三種酶在高濃度Cd處理時(shí)的活性反而下降，則也可能是植物在高污染狀況下超負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)或者整體代謝系統(tǒng)達(dá)到臨界點(diǎn)進(jìn)而紊亂，也可能是過量的重金屬抑制了這些酶的生物合成[28].唐秀梅等[22]研究龍葵抗氧化酶活性和抗壞血酸含量的變化表明3個(gè)酶的活性呈現(xiàn)隨著Cd濃度升高而變化的規(guī)律,三者都表現(xiàn)出先升高后降低再升高的趨勢.張玉秀等[29]通過研究鎘對鎘超積累植物龍葵的抗氧化酶活性及基因表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)Cd可增強(qiáng)或穩(wěn)定多種抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)從而提高酶活性.可見，植物的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)是一個(gè)多方調(diào)控的比較復(fù)雜的系統(tǒng)，在不同的植物中表現(xiàn)出不同的抗氧化規(guī)律，即使同一類型植物也隨著植物生理的不同狀態(tài)而表現(xiàn)出不同的抗氧化能力.

3 結(jié)論

(1)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cd脅迫(>50 mg·L-1)能顯著抑制三個(gè)品種龍葵的生長，Cd對龍葵HZ生長的抑制作用較其他兩個(gè)品種要低，從生物量指標(biāo)來看，HZ較耐鎘.

(2)隨著Cd脅迫濃度的增加，3種龍葵葉綠素含量、MDA含量、SOD活性、CAT活性以及根的POD活性均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，且HZ的抗氧化酶活性大于其他兩種龍葵.綜合生物量指標(biāo)、葉綠素含量、MDA含量和抗氧化酶活性指標(biāo)整體來看，HZ有較強(qiáng)的Cd耐性.