程琳 ，黃天晴，劉晨斌，谷偉，徐革鋒，史秀蘭，姚作春，王麗薇，王炳謙

（1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

魚類早期胚胎發(fā)育階段生殖細(xì)胞系與體細(xì)胞系發(fā)生分離，隨后形成原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells,PGCs）。PGCs 起源于胚胎外，通過(guò)胚胎組織遷移到生殖嵴，分化為精原細(xì)胞或卵原細(xì)胞，進(jìn)一步發(fā)育成卵母細(xì)胞和精母細(xì)胞，最終形成成熟卵子和精子[1]，是配子在胚胎中的前體。精子與卵子結(jié)合后將遺傳信息傳遞給下一代，以保證物種延續(xù)和進(jìn)化[2]。作為親本與后代之間的聯(lián)系，研究魚類PGCs 發(fā)育及遷移對(duì)遺傳資源保護(hù)、性別控制和水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重要意義，也為研究其他生物提供了機(jī)制線索和模型[3,4]。生殖細(xì)胞具有特定的基因表達(dá)模式，脊椎動(dòng)物的一些基因在PGCs 中特異表達(dá)，如Vasa，Dead end（dnd）和Nanos3 等，越來(lái)越多的研究以這些基因?yàn)闃?biāo)記來(lái)研究PGCs 的遷移和發(fā)育。

1 魚類PGCs 的起源及形成機(jī)制

受精卵的細(xì)胞質(zhì)中存在一些由特殊mRNA 和蛋白組成的細(xì)胞質(zhì)決定因子，即生殖質(zhì)（germ plasm），隨著胚胎發(fā)育及細(xì)胞分裂，生殖質(zhì)被不對(duì)稱地分配到細(xì)胞中，含有生殖質(zhì)的細(xì)胞將分化為PGCs[1]。生殖質(zhì)為生殖細(xì)胞的發(fā)源地，決定PGCs 的形成及發(fā)育[5]。最開始由于缺乏PGCs 標(biāo)記，只能利用光學(xué)和電子顯微鏡簡(jiǎn)單地鑒定PGCs 的形態(tài)特征。形態(tài)學(xué)研究表明，PGCs 一般為梨形、圓形或橢圓形，比體細(xì)胞大（直徑通常為10～12 μm），細(xì)胞直徑因不同種屬及發(fā)育時(shí)期差異較大；核質(zhì)分界明顯，細(xì)胞核較大（一般為6～10 μm），位于細(xì)胞一側(cè)，常呈圓形或分葉狀，核膜清晰，核仁較明顯（一般1～2 個(gè)）[6]。超微結(jié)構(gòu)表明，PGCs 具有與線粒體相關(guān)的電子致密物。Nedelea 等[7]在鯉Cyprinus carpio PGCs 胞質(zhì)中最早發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)。劉少軍[8]將革胡子鲇Clarias lazera PGCs 中的這種電子致密物稱為生殖質(zhì)。這種結(jié)構(gòu)不僅能儲(chǔ)存PGCs 分化及發(fā)育所需的RNA 和蛋白質(zhì)，在生殖系發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，還可能參與調(diào)節(jié)生殖系的轉(zhuǎn)錄及翻譯[9,10]。有些魚類的PGCs 中還有卵黃塊，在胚胎發(fā)育早期為PGCs 提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[8]。在遷移期間，PGCs 中還常見絲狀偽足或葉狀偽足[11]。

不同種屬魚類的PGCs 起源不同，大致可分為兩種：一種起源于內(nèi)胚層，如中華鱘Acipenser sinensis、虹鱒Oncorhynchus mykiss、大麻哈魚Oncorhynchus keta、泰山螭霖魚Varicorhinus macrolepis、革胡子鲇和黑尾近紅鲌Ancherythroculter nigrocauda 等，都在原腸早期內(nèi)胚層中鑒別出PGCs[12]；另一種起源于中胚層，如普氏七鰓鰻Entosphennus wilderi 和泥鰍Misgurnus anguillicaudatus[11]。

隨著斑馬魚Danio rerio PGCs 中特異表達(dá)基因Vasa 的出現(xiàn)，魚類PGCs 研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展[13]。Vasa RNA 在早期卵裂胚胎中被定位到32 細(xì)胞期的4 個(gè)細(xì)胞中。這4 個(gè)細(xì)胞隨后分化為PGCs，表明在胚胎發(fā)育早期斑馬魚的生殖細(xì)胞與體細(xì)胞就已經(jīng)發(fā)生分離，在原腸期進(jìn)入內(nèi)胚層后PGCs 數(shù)量保持不變并開始積極遷移到形成性腺的部位[14]。之后在大西洋鱈Gadus morhua、大西洋鮭Salmo salar、大菱鲆Scophthalmus maximus、鯉、金魚Carassius auratus 和泥鰍等中發(fā)現(xiàn)了與斑馬魚具有相似的PGCs形成模式，稱為先成論[15]。PGCs 還有一種形成方式稱為后成論，該觀點(diǎn)認(rèn)為，生殖細(xì)胞是由體細(xì)胞周圍組織誘導(dǎo)分化而來(lái)，在發(fā)育晚期才能鑒定出生殖細(xì)胞，如青鳉Oryzias latipes Vasa RNA 在卵裂期胚胎細(xì)胞中廣泛分布，直到原腸晚期PGCs 中才鑒定出Vasa 基因[16]，虹鱒、真鯛Pagrosomus major 的PGCs形成模式與青鳉相似[15]。

對(duì)斑馬魚和青鳉PGCs 遷移方式的研究比較系統(tǒng)和深入。目前認(rèn)為有3 種方式遷移至生殖嵴：通過(guò)臟壁中胚層到達(dá)腸系膜，再遷移至生殖嵴；通過(guò)體節(jié)遷移沿體壁中胚層到達(dá)生殖嵴；最后一種為借助血液循環(huán)遷移至生殖嵴[17]。斑馬魚在囊胚期時(shí)，PGCs 開始從非運(yùn)動(dòng)模式轉(zhuǎn)變?yōu)檫\(yùn)動(dòng)模式[18]。在體細(xì)胞發(fā)生后期，PGCs 位于腸道周圍，被中胚層體細(xì)胞包圍，通過(guò)腸道和腸系膜的中胚層從體細(xì)胞附近開始遷移[19]。在體節(jié)發(fā)育階段，PGCs 位于外側(cè)中胚層，呈兩條線性分布，隨后這些細(xì)胞沿著背-腹軸向軀干腹部遷移，然后聚集在原始生殖嵴中[20]。魚類PGCs 在遷移中除自身獨(dú)特性外，還具有主動(dòng)及被動(dòng)遷移能力，如有些魚類PGCs 表面觀察到偽足形成，認(rèn)為這是PGCs 主動(dòng)遷移的標(biāo)志；一些PGCs在遷移過(guò)程中受到周圍組織細(xì)胞推動(dòng)而被動(dòng)遷移[21]。

2 魚類PGCs 標(biāo)記基因

在許多物種中已鑒定的生殖質(zhì)是一些保守的RNA 結(jié)合蛋白或編碼這些蛋白的mRNA，對(duì)生殖細(xì)胞的命運(yùn)至關(guān)重要。已生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的特異表達(dá)基因，如Vasa、Nanos、Dead end（dnd）、bucky ball、Ca15a、sdf1 和Dazl，可用作PGCs 特異分子標(biāo)記。研究這些基因的功能具有理論意義，對(duì)魚類生殖細(xì)胞操作技術(shù)及相關(guān)應(yīng)用研究，如生殖細(xì)胞生物學(xué)、遺傳資源保護(hù)、性別控制等具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本文綜述了幾種常見標(biāo)記基因的研究進(jìn)展，為了解魚類標(biāo)記基因提供借鑒。

2.1 Vasa 基因

Vasa 基因（也稱為Ddx4）是DEAD-box（Asp-Glu-Ala-Asp）蛋白家族的重要成員，參與RNA 編輯、mRNA 啟動(dòng)、rRNA 加工、翻譯起始、核mRNA 輸出以及mRNA 降解等過(guò)程[22]。在大多數(shù)魚類中，僅在生殖細(xì)胞系中檢測(cè)到Vasa 基因雜交信號(hào)。該基因?yàn)樯臣?xì)胞形成和配子發(fā)生所必需，被作為優(yōu)良分子標(biāo)記廣泛用于魚類PGCs 的起源、遷移、分化及性腺和配子發(fā)生等研究中[23]。目前，已在許多魚類中成功克隆得到其同源基因，如斑馬魚[13]、虹鱒[24]、羅非魚Oreochromis spp[25]、青鳉[16]、異育銀鯽Carassius auratus gibelio[26]、黃鱔Monopterus albus[27]、牙鲆Paralichthys olivaceus[28]、草魚Ctenopharyngodon idellus[29]、鱸Dicentrarchus labrax[30]、大菱鲆[31]、大西洋鱈[32]、七彩神仙魚Symphysodon haraldi[33]、半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis Gunther[20]、革胡子鯰[34]、南方鱸Silurus meridionalis[35]、石首魚Totoaba macdonaldi[36]、金魚[37]、翹嘴紅鲌[38]和真鯛Pagrus major[39]等。

Vasa 基因由Schüpbach 等于1986 年首次在黑腹果蠅Drosophila melanogaster 中發(fā)現(xiàn)，證實(shí)其為生殖質(zhì)的前體，具有母源遺傳效應(yīng)。該基因發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致生殖細(xì)胞無(wú)法正常形成[40]。Vasa 亞族蛋白具有DEAD-box 家族典型的8 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（圖1）[41]，AXXXGKT 和DEAD 分別為ATP 酶A-motif 和ATP酶B-motif 結(jié)合域，A 區(qū)域?yàn)锳TP 結(jié)合位點(diǎn)，B 區(qū)域?yàn)锳TP 水解部位。SAT 保守結(jié)構(gòu)域也是ATP 結(jié)合位點(diǎn)，GRIGRXXR 與其他幾個(gè)結(jié)構(gòu)域可能間接參與RNA 結(jié)合及解旋活動(dòng)[42]。鋅指結(jié)構(gòu)（CCHC 框）為Vasa 蛋白特有結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可能與核酸結(jié)合有關(guān)，也可能與靶RNA 分子特異性相關(guān)。大多數(shù)Vasa 蛋白的N 末端存在甘氨酸富集區(qū)（G-rich region）和多個(gè)RGG（arginine-glycine-glycine）重復(fù)序列。N 末端起始密碼子及C 末端終止密碼子附近有Vasa 保守結(jié)構(gòu)常見的色氨酸（W）殘基，有些Vasa 蛋白還具有ARKF 框、GXVGXA 框及位于C 末端的EXEEXW框[43]。

研究表明，七彩神仙魚從受精卵開始Vasa 基因即穩(wěn)定表達(dá)，一直到出膜期，均檢測(cè)到表達(dá)信號(hào)，到囊胚期時(shí)含量達(dá)最大，隨后逐漸降低[33]。羅非魚和青鳉早期胚胎中，到原腸早期Vasa mRNA 均高表達(dá)，原腸期時(shí)開始下降，呈低表達(dá)[16,25]。這些研究均證實(shí)：Vasa 基因是母源性表達(dá)基因，Vasa 在PGCs中特異性表達(dá)，隨著胚胎發(fā)育，直到出膜之前，體細(xì)胞開始大量分裂，數(shù)量逐漸增加，此時(shí)與體細(xì)胞相比，生殖細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)減少，Vasa 基因的表達(dá)量降低。在斑馬魚胚胎第一次和第二次卵裂溝末端檢測(cè)到Vasa 信號(hào)，信號(hào)逐漸遷移到囊胚期的四個(gè)卵裂球中，隨后卵裂球分化成PGCs，在囊胚期結(jié)束之前，PGCs 中富集大量Vasa mRNA 和合子Vasa 轉(zhuǎn)錄物。隨著胚胎發(fā)育，母源性Vasa mRNA 逐漸在生殖質(zhì)附近聚集，這證實(shí)Vasa mRNA 是組成斑馬魚生殖質(zhì)的重要成分[13]。

孫冬捷等[44]研究發(fā)現(xiàn)，Vasa 基因在斑馬魚不同發(fā)育期生殖細(xì)胞中特異性表達(dá)，整個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)量先上升再下降；同一發(fā)育期，精巢與卵巢中Vasa 基因表達(dá)量基本一致，卵巢略高于精巢。七彩神仙魚各發(fā)育期卵巢中Vasa 基因的表達(dá)量均高于精巢[33]，繁殖前的精巢中含有大量的精子，但檢測(cè)到的Vasa 基因表達(dá)量卻低于繁殖后期，這也進(jìn)一步證實(shí)Vasa 為母源性基因。

圖1 Vasa 蛋白8 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域[41]Fig.1 Eight conserved motifs in Vasa protein[41]

魚類Vasa mRNA 在精子和卵子發(fā)生中的表達(dá)模式不同。在卵子發(fā)生過(guò)程中，Vasa 基因在卵原細(xì)胞中雜交信號(hào)較弱，在I、II 期的卵母細(xì)胞中雜交信號(hào)較強(qiáng)，在III、IV 期卵母細(xì)胞中又急劇減弱，但外周皮層區(qū)域陽(yáng)性信號(hào)仍較強(qiáng)，呈現(xiàn)低高低的表達(dá)模式[20,37]。不同魚類精子發(fā)生過(guò)程一般也不同。Kobayashi 等[25]研究顯示：羅非魚Vasa 基因在精原細(xì)胞中大量表達(dá)，初級(jí)精母細(xì)胞中表達(dá)下降，胞質(zhì)中的雜交信號(hào)均勻且強(qiáng)烈，在次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和成熟精子中則沒(méi)有雜交信號(hào)，這一模式與金魚、青鳉等相似；Vasa 基因在異育銀鯽精原細(xì)胞中表達(dá)量低，但在初級(jí)精母細(xì)胞中大量表達(dá)，精細(xì)胞和精子中信號(hào)較低或檢測(cè)不到，此結(jié)果與七彩神仙魚、半滑舌鰨和革胡子鯰等結(jié)果相似[26]。

雖然Vasa mRNA 在卵子和精子發(fā)生過(guò)程中表達(dá)模式不同，但Vasa 基因信號(hào)均在配子發(fā)生前期較強(qiáng)，后期較弱或不表達(dá)。這證實(shí)Vasa 基因?qū)υ缙谏臣?xì)胞產(chǎn)生、分化及發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在一些報(bào)道中，Vasa 基因mRNA 的表達(dá)不止局限于生殖細(xì)胞，其他組織中也有表達(dá)，如青鳉腦、軀干和尾部[45]；虹鱒心臟和腦部[24]及半滑舌鰨的心臟[46]都曾報(bào)道過(guò)Vasa mRNA 的低量表達(dá)，這說(shuō)明Vasa 對(duì)體細(xì)胞的發(fā)育也有一定作用。

2.2 Dnd 基因

Dead end（Dnd）是Gilbert Weidinger 等2003 年首次在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)并被分離出來(lái)。該基因能編碼RNA 結(jié)合蛋白，是組成生殖質(zhì)的重要成分，在生殖質(zhì)及PGCs 中特異表達(dá)，對(duì)PGCs 存活和遷移至關(guān)重要[10,47]。Dnd 在進(jìn)化上很保守，其基因編碼的蛋白包含一個(gè)保守的RNA 識(shí)別基序（RRM）和五個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（圖2）[48]，其中RRM為主要的功能區(qū)域。五個(gè)保守結(jié)構(gòu)域包括N 末端區(qū)域（NR）和四個(gè)C 末端區(qū)域[49]。Dnd 蛋白位于斑馬魚PGCs 核周的生殖質(zhì)顆粒中，在核周區(qū)域的亞細(xì)胞定位與RRM有關(guān)，若RRM突變將導(dǎo)致Dnd 無(wú)法從核中區(qū)域轉(zhuǎn)移到生殖質(zhì)顆粒中，導(dǎo)致其功能喪失；雖然在亞細(xì)胞定位中Dnd 蛋白的C 端不起主要作用，但若其發(fā)生突變也會(huì)顯著影響Dnd 功能[50]。Dnd 基因還具有特殊的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)（3’非翻譯區(qū)即3’UTR）。這種穩(wěn)定依賴于mRNA 與某些蛋白質(zhì)的相互作用，如Dnd-1，保護(hù)它們免受miRNA 介導(dǎo)的抑制，如斑馬魚Dnd 蛋白可與生殖系基因Nanos1 和tdrd7 的3’UTR 結(jié)合，防止miR-430b 復(fù)合物介導(dǎo)的RNA 將這兩種基因降解[51]。最新的研究表明：斑馬魚Dnd 蛋白的C 末端具有ATPase 活性，這種活性對(duì)于PGCs 的存活至關(guān)重要，且C 端突變將導(dǎo)致PGCs 數(shù)量減少[52]。Dnd基因?qū)巫愕男纬珊头€(wěn)定也有很大關(guān)系[10]，敲除Dnd導(dǎo)致PGCs 錯(cuò)誤遷移，斑馬魚不育[50]。

目前，在斑馬魚[10]、青鳉[53]、泥鰍[54]、金魚[55]、尼羅羅非魚[56]、大黃魚Pseudosciaena crocea[47]、斯特拉鱘[57]、中華鱘[58]、大西洋鮭[59]、大菱鲆[60]、真鯛Pagrus major[61]、大西洋鱈[62]、牙鲆[63]、稀有鮈鯽Gobiocypris rarus[64]和半滑舌鰨[20]等魚類中都成功克隆了Dnd同源基因。

Dnd 基因翻譯受阻可完全抑制PGCs 在早期胚胎發(fā)生過(guò)程中的遷移和發(fā)育；Dnd 的缺失會(huì)導(dǎo)致PGCs 功能喪失[63]。方玲玲等[65]研究表明：敲除Dnd基因?qū)е履崃_羅非魚性腺中缺失生殖細(xì)胞，隨著胚胎發(fā)育，雄性精巢中僅存在大量體細(xì)胞；精巢中還出現(xiàn)大量空腔，無(wú)法形成正常的配子。敲除大西洋鱈魚Dnd 基因?qū)е翽GCs 相關(guān)基因mRNA 表達(dá)量降低。抑制泥鰍Dnd 基因?qū)е律臣?xì)胞消失，形成無(wú)生殖細(xì)胞的雄性個(gè)體[54]。Dnd 基因?qū)RNA 還具有保護(hù)作用，如斑馬魚PGCs 中，Dnd 可以通過(guò)與富含尿嘧啶區(qū)域的靶mRNAs（URRS）結(jié)合，阻礙一些短片段非編碼的單鏈小RNA（miRNAs）對(duì)靶mRNA的降解[66]。

在早期胚胎發(fā)育中，青鳉Dnd 基因一直處于較高水平，直到桑葚胚階段明顯下降，且僅在性腺中高表達(dá)。原位雜交結(jié)果表明：青鳉卵巢中的卵原細(xì)胞和早期卵母細(xì)胞中Dnd 信號(hào)強(qiáng)烈。睪丸周圍精原細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)，初級(jí)和次級(jí)精母細(xì)胞中減弱，但在精子中卻很難檢測(cè)到。因此，也將Dnd mRNA 作為雄性青鳉生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂前期和后期的標(biāo)記物[48]。桂建芳等[67]用Dnd 特異性寡聚核苷酸介導(dǎo)的敲除方法，建立了一個(gè)完整的生殖細(xì)胞衰竭性腺模型，揭示了銀鯽雌核發(fā)育中所有雌魚原始生殖細(xì)胞的完全缺失，改變了性別偏向基因的表達(dá)，發(fā)生不育雄性。上述結(jié)果表明：異育銀鯽Dnd 轉(zhuǎn)錄物能成為配子發(fā)生不同階段的極好標(biāo)記，也是追蹤胚胎發(fā)育過(guò)程中PGC 遷移的有用標(biāo)記[53]。Lin 等[60]發(fā)現(xiàn)，大菱鲆Dnd 基因發(fā)生模式與斑馬魚似，僅在生殖細(xì)胞中特異性表達(dá)，并呈現(xiàn)明顯的性別二態(tài)性，推測(cè)Dnd 基因可能參與大菱鲆性別分化過(guò)程。

圖2 Dnd 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖[48]Fig.2 The structure diagram of Dnd protein[48]

2.3 Nanos 基因

Nanos 基因最先在果蠅中發(fā)現(xiàn)，是一種母源效應(yīng)基因，能夠編碼一種RNA 結(jié)合蛋白，與Pumilio RNA 結(jié)合蛋白相互作用形成核蛋白復(fù)合物，共同抑制母源hunchback mRNA 的翻譯，調(diào)控果蠅胚胎后腹部細(xì)胞的分化，其編碼的蛋白是組成生殖質(zhì)的重要成分[68,69]。Nanos C 端有兩個(gè)為翻譯調(diào)控所必需的特異Cys-Cys-His-Cys（CCHC）鋅指基序[70]，缺失或突變都使Nanos 失去功能。Nanos 參與PGCs 的遷移和維持，為生殖干細(xì)胞自我更新和生殖細(xì)胞發(fā)育所必需，突變會(huì)導(dǎo)致性腺中極細(xì)胞無(wú)法正常遷移，且無(wú)法形成生殖細(xì)胞，并造成胚胎大量死亡[71]。如果蠅缺失Nanos 基因?qū)⒉荒苄纬筛共?，形成的極細(xì)胞不能準(zhǔn)確遷移，分化出的生殖細(xì)胞不具有正常功能并最終發(fā)生凋亡[72]。

目前，已鑒定出的Nanos 同源基因有三種：Nanos1、Nanos2 和Nanos3。這三種Nanos 同系物在不同物種中的功能不同。秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans 含有三個(gè)Nanos 同源基因，Nanos1 和Nanos2 對(duì)PGCs 有調(diào)節(jié)作用，單獨(dú)缺失時(shí)，多數(shù)生殖細(xì)胞都能正常發(fā)育，但同時(shí)缺失則導(dǎo)致線蟲不孕；Nanos3 與FBF-1 能調(diào)節(jié)雌雄同體線蟲精子和卵子發(fā)生的轉(zhuǎn)換點(diǎn)[73]。小鼠的Nanos1 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、成體大腦和睪丸輸精管中均有高表達(dá)，但在生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中沒(méi)有表達(dá)。缺乏Nanos1 的小鼠并未表現(xiàn)出異常，表明Nanos1 對(duì)小鼠性腺發(fā)育并非必需[74]。據(jù)報(bào)道，Nanos2 只在雄性細(xì)胞中表達(dá)，敲除其導(dǎo)致成年睪丸中精原細(xì)胞丟失，因此將Nanos2 作為雄性生殖細(xì)胞的特異性標(biāo)記，調(diào)控小鼠的性別決定[75]。Nanos3 在兩性生殖細(xì)胞中均有表達(dá)，敲除Nanos3 會(huì)導(dǎo)致PGCs 在遷移過(guò)程中凋亡[76]。

對(duì)魚類Nanos 的研究還不多，目前僅在斑馬魚、青鳉、日本鰻鱺Anguilla japonica、泥鰍、牙鲆、金魚、鯡Clupea pallasi、大黃魚、蝦虎魚Gobiidae、黑脊倒刺鲃Spinibarbus caldwell、白氏文昌魚、中華鱘、團(tuán)頭魴Megalobrama amblycephala 等魚類中有過(guò)報(bào)道[77-79]。Koprunner 等[80]以Nanos 為標(biāo)記基因，向缺失母源Nanos 的斑馬魚細(xì)胞胚胎注射Nanos3′UTR mRNA，證實(shí)了Nanos 是斑馬魚PGCs 遷移和成活所必需的基因。隨后Draper 等[81]證實(shí)，Nanos對(duì)維持成體斑馬魚卵巢產(chǎn)生卵母細(xì)胞至關(guān)重要。青鳉的Nanos1 有兩種亞型Nanos1a 和Nanos1b，Nanos1a 在卵母細(xì)胞和精子細(xì)胞周圍的體細(xì)胞中表達(dá)，但Nanos1b 不表達(dá)。在成年卵巢和精原細(xì)胞僅有Nanos2 表達(dá)，但在性腺分化早期未發(fā)現(xiàn)該信號(hào)。Nanos3 在早期胚胎發(fā)生和成體青鳉雌性卵母細(xì)胞遷移的PGCs 中有所表達(dá)，因此，一般選用Nanos3標(biāo)記PGCs[82]。Hitomi 等[83]發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育過(guò)程中Nanos3 在體細(xì)胞和PGCs 中都能被轉(zhuǎn)錄，但只在PGCs 中被翻譯，這與其3’UTR 密切相關(guān)，3’UTR區(qū)域的翻譯調(diào)控元件（TCE）和微小元件能調(diào)控細(xì)胞特異性表達(dá)。向青鳉中注射GFP-半滑舌鰨Nanos 3′UTR mRNA，能夠標(biāo)記胚胎發(fā)育過(guò)程中的PGCs，這也證實(shí)了Nanos3 可作為魚類PGCs 的理想標(biāo)記基因[20]。

Nanos 基因在半滑舌鰨性腺中高表達(dá)；在精巢中的表達(dá)量高于卵巢，在其他組織中，腦和肝臟的表達(dá)量相對(duì)較高。原位雜交結(jié)果表明，半滑舌鰨Nanos mRNA 在卵巢中卵子發(fā)育I 期、II 期信號(hào)較強(qiáng)，之后逐漸減弱；在精巢中，主要在與精子形成相關(guān)細(xì)胞中高表達(dá)，其他細(xì)胞中未檢測(cè)到信號(hào)，為典型的性別二態(tài)性表達(dá)[20]。Nanos 基因在黑脊倒刺鲃生殖細(xì)胞發(fā)生早期起重要作用，在后期作用并不是很大[84]。

比對(duì)發(fā)現(xiàn)，不同魚類Nanos3 3’UTR 序列差異很大。在斑馬魚、羅非魚等少數(shù)魚類的3’UTR 中發(fā)現(xiàn)了識(shí)別結(jié)合miR430 促進(jìn)RNA 降解的序列GCACUU。該序列附近存在U-rich 區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的Dnd 蛋白能夠與Nanos3 3’UTR 的U-rich區(qū)域結(jié)合，抑制miR 430 與3’UTR 的結(jié)合，從而抑制PGCs 中Nanos mRNA 的降解[10]。朱林等[85]對(duì)團(tuán)頭魴的研究也證實(shí)這一點(diǎn)。團(tuán)頭魴Nanos3 3’UTR中存在一個(gè)非經(jīng)典的miR430 識(shí)別位點(diǎn)（GCACTA）。該位點(diǎn)突變可影響Nanos3 3’UTR 對(duì)斑馬魚PGCs 的標(biāo)記效率，證實(shí)其有利于Nanos3 在非PGCs組織中的降解。目前，關(guān)于Nanos3 3’UTR 的多變性了解的還很不透徹，還需要在其他硬骨魚中進(jìn)行相關(guān)研究。

3 小結(jié)

隨著分離鑒定出的魚類原始生殖細(xì)胞標(biāo)記基因的增多，對(duì)PGCs 的研究也日益透徹。了解生殖細(xì)胞分化和配子發(fā)生過(guò)程中基因表達(dá)的變化，不僅為研究PGCs 不同發(fā)育階段生殖細(xì)胞起源、遷移和分離奠定基礎(chǔ)，也為魚類的應(yīng)用研究提供了理論支持。盡管對(duì)這些基因有了一定的了解和應(yīng)用，但在很多方面都不成系統(tǒng)，對(duì)其功能的認(rèn)識(shí)也只通過(guò)敲除、RNA 干擾及轉(zhuǎn)基因等方式進(jìn)行推測(cè)，對(duì)這些基因的研究也僅局限于生殖細(xì)胞，幾乎沒(méi)有在非生殖細(xì)胞中進(jìn)行功能研究。因此，對(duì)這些魚類標(biāo)記基因的研究有著非常廣泛的空間，可以在更多魚類中發(fā)掘更多標(biāo)記基因。隨著RNA 定點(diǎn)表達(dá)（localized RNA expression,LRE）技術(shù)的廣泛應(yīng)用，更加明了對(duì)些標(biāo)記基因在魚類體內(nèi)的調(diào)控機(jī)理，對(duì)魚類生殖細(xì)胞研究及繁殖育種都有極大的幫助，對(duì)于生殖細(xì)胞體外培養(yǎng)和移植、瀕危魚類的保護(hù)和利用以及魚類生殖發(fā)育生物學(xué)的研究都具有重要意義。