艾拉莫德對調(diào)節(jié)性B細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的影響

孫蛟,叢珊,李潭,張倩楠,羅莉

作者單位： 830011 烏魯木齊市,新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以持續(xù)性關(guān)節(jié)滑膜炎性反應(yīng)導(dǎo)致骨和軟骨破壞為特征的慢性系統(tǒng)性全身性自身免疫性疾病[1]。T細(xì)胞免疫功能紊亂是RA發(fā)病的主要機(jī)制之一[2]，但近年，具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)、維持免疫平衡的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Bregs)也成為RA發(fā)病的研究熱點(diǎn)[3]。艾拉莫德是我國自主研發(fā)的1.1類藥物，是一種新型的具有多作用靶點(diǎn)的抗風(fēng)濕藥物(DMARDs)，對RA有明顯的治療作用[4]。研究表明，艾拉莫德不僅對Th1、Th17細(xì)胞有抑制作用[5-6]，且能降低B細(xì)胞分泌的免疫球蛋白和紅細(xì)胞沉降率[7]。艾拉莫德是否通過影響B(tài)regs從而達(dá)到控制關(guān)節(jié)炎癥的目的尚未明確。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇健康清潔級、6～8周齡、Wistar雌性大鼠60只，平均體質(zhì)量180～220 g。

1.2 實驗藥物與試劑 艾拉莫德片(先聲藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20110084)；牛Ⅱ型膠原(美國Chondrex公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：20022)、弗氏完全佐劑(美國Sigma公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：F5881)；大鼠白介素-10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)ELISA試劑盒(武漢基因美科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號GR201708-1)。

1.3 方法 (1)動物分組：將60只大鼠隨機(jī)分為空白組、CIA模型組、艾拉莫德組，每組20只。(2)模型制備：將牛Ⅱ型膠原等體積加入弗氏完全佐劑后，于冰浴條件下使二者充分乳化[4]，CIA模型組和艾拉莫德組大鼠足跖及尾根部采用多點(diǎn)皮內(nèi)注射的方法進(jìn)行初次免疫，0.3 ml/只，初次免疫第8天，再次制備上述乳劑，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。免疫后第21天時，關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)≥6分提示造模成功[8]。(3)治療方法：造模成功后，艾拉莫德組給予每只大鼠每天灌胃艾拉莫德10 mg·kg-1·d-1，模型組給予每只大鼠每天灌胃等量生理鹽水，給藥4周。

1.4 觀察指標(biāo) (1)大鼠體質(zhì)量變化：測體質(zhì)量，每4天1次，直至治療結(jié)束。(2)滑膜病理變化情況：HE染色，光鏡下觀察滑膜細(xì)胞和血管的增生及淋巴細(xì)胞浸潤等情況。(3)ELISA法檢測細(xì)胞因子：末次治療24 h后，取大鼠血液離心后采血清，使用ELISA方法檢測IL-10、TGF-β的表達(dá)水平。(4)實時熒光定量PCR測定：末次治療24 h后，獲取滑膜，提取滑膜總RNA，鑒定總RNA純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行引物設(shè)計和合成，最后進(jìn)行Realtime PCR。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠體質(zhì)量比較 治療前，3組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療第57天，艾拉莫德組大鼠體質(zhì)量大于治療前和CIA模型組，但低于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠治療前后體質(zhì)量比較

2.2 滑膜組織病理形態(tài)學(xué)檢查 空白組大鼠關(guān)節(jié)滑膜有4層細(xì)胞層且未見炎性細(xì)胞浸潤；CIA模型組關(guān)節(jié)滑膜有10層細(xì)胞層，可見大量炎性細(xì)胞浸潤；艾拉莫德組有4層細(xì)胞層，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

注：a為空白組；b為CIA模型組；c為艾拉莫德組圖1 關(guān)節(jié)滑膜病理光鏡切片 (×400)

2.3 ELISA法檢測細(xì)胞因子變化情況 與空白組比較，CIA模型組和艾拉莫德組血清IL-10、TGF-β表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與CIA模型組比較，艾拉莫德組血清IL-10、TGF-β表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞因子表達(dá)情況比較

2.4 Realtime PCR測定細(xì)胞因子變化情況 與空白組比較，CIA模型組和艾拉莫德組關(guān)節(jié)滑膜IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾臟Bcl-6mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與CIA模型組比較，艾拉莫德組關(guān)節(jié)滑膜IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾臟Bcl-6mRNA表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。見表3。

表3 各組關(guān)節(jié)滑膜IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾臟Bcl-6mRNA表達(dá)比較

3 討 論

RA是以侵蝕性、慢性、全身性多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病。目前認(rèn)為，RA的發(fā)病機(jī)制可能與免疫活性細(xì)胞、異常的抗原提呈細(xì)胞、抗原特異性T細(xì)胞、B細(xì)胞和自身抗體(如類風(fēng)濕因子、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體等)之間的相互作用有關(guān)[9]。雖然T細(xì)胞免疫功能紊亂是RA發(fā)病的主要機(jī)制之一[2]，但維持機(jī)體免疫耐受[10]、發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用、通過直接接觸(Fas L、PD-L1)、間接接觸(主要分泌IL-10、TGF-β)發(fā)揮免疫效應(yīng)，其中Bcl-6為標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄蛋白[11-13]，這類具有特殊功能的B細(xì)胞亞群被稱之為Bregs[14]，這也是近年RA發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。亦有研究指出，分泌IL-10的Bregs細(xì)胞在RA患者和其他炎性疾病的免疫調(diào)節(jié)功能中發(fā)揮核心作用[15]。因此，Bregs在RA的發(fā)生發(fā)展中起著極其重要的作用。

大部分治療RA的藥物的作用機(jī)制為抑制機(jī)體T細(xì)胞的增殖，如甲氨蝶呤片、來氟米特片等。而艾拉莫德是我國自主研發(fā)的1.1類新藥，已被亞太抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(APLAR)納入治療RA。艾拉莫德通過T細(xì)胞途徑減少IL-1β、TNF-α的分泌，通過臨床觀察，也降低免疫球蛋白、紅細(xì)胞沉降率，說明其可改善B細(xì)胞的免疫功能，在RA的治療中發(fā)揮作用。研究表明，Bregs亦可調(diào)控免疫球蛋白的類別轉(zhuǎn)換[16]。本研究旨在探討艾拉莫德是否通過調(diào)控Bregs途徑促進(jìn)IL-10、TGF-β、Bcl-6的表達(dá)，從而達(dá)到控制關(guān)節(jié)炎癥的作用。

本實驗使用艾拉莫德治療Wistar大鼠CIA模型，結(jié)果顯示，CIA模型組及艾拉莫德組與空白組比較，大鼠體質(zhì)量增加緩慢。經(jīng)艾拉莫德治療后，CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹逐漸消退，在實驗第57天，CIA大鼠體質(zhì)量明顯增加，經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn)，CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜有4層細(xì)胞層，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。本結(jié)果表明，艾拉莫德可明顯改善CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹、使體質(zhì)量增加恢復(fù)正常、關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞層恢復(fù)正常，這與Lina等[17]研究結(jié)果一致：艾拉莫德在RA動物模型中具有較強(qiáng)的抗炎和改善關(guān)節(jié)炎癥狀的功效。

本研究通過與空白組比較，ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)CIA模型組血清IL-10、TGF-β表達(dá)水平降低，PCR熒光定量發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)滑膜中IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾臟Bcl-6mRNA表達(dá)降低，與Johansson等[18]研究結(jié)果一致。Bregs分泌的IL-10、TGF-β、Bcl-6在RA的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[19]。與CIA模型組比較，ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)艾拉莫德組血清IL-10、TGF-β表達(dá)水平未見明顯變化，PCR熒光定量發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)滑膜中IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾臟Bcl-6mRNA表達(dá)未見明顯變化，研究結(jié)果提示，艾拉莫德并未影響IL-10、TGF-β、Bcl-6的表達(dá)，說明艾拉莫德不是通過影響IL-10、TGF-β、Bcl-6這條途徑來控制關(guān)節(jié)炎癥。

綜上所述，Bregs有不同的類型，表型各異，根據(jù)表型的不同分為過渡2型邊緣帶前Bregs、MZBregs和分泌IL-10的B10細(xì)胞等。本研究完成了CIA大鼠血清及滑膜中細(xì)胞因子IL-10、TGF-β及標(biāo)志蛋白Bcl-6的檢測，因艾拉莫德對免疫球蛋白有抑制作用，艾拉莫德是否通過影響過渡2型邊緣帶前Bregs或MZBregs控制關(guān)節(jié)炎癥將是下一步的研究重點(diǎn)。