孫蛟,叢珊,李潭,張倩楠,羅莉
作者單位: 830011 烏魯木齊市,新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以持續(xù)性關(guān)節(jié)滑膜炎性反應(yīng)導(dǎo)致骨和軟骨破壞為特征的慢性系統(tǒng)性全身性自身免疫性疾病[1]。T細(xì)胞免疫功能紊亂是RA發(fā)病的主要機(jī)制之一[2],但近年,具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)、維持免疫平衡的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Bregs)也成為RA發(fā)病的研究熱點(diǎn)[3]。艾拉莫德是我國自主研發(fā)的1.1類藥物,是一種新型的具有多作用靶點(diǎn)的抗風(fēng)濕藥物(DMARDs),對RA有明顯的治療作用[4]。研究表明,艾拉莫德不僅對Th1、Th17細(xì)胞有抑制作用[5-6],且能降低B細(xì)胞分泌的免疫球蛋白和紅細(xì)胞沉降率[7]。艾拉莫德是否通過影響B(tài)regs從而達(dá)到控制關(guān)節(jié)炎癥的目的尚未明確。
1.1 實驗動物 選擇健康清潔級、6~8周齡、Wistar雌性大鼠60只,平均體質(zhì)量180~220 g。
1.2 實驗藥物與試劑 艾拉莫德片(先聲藥業(yè)有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字H20110084);牛Ⅱ型膠原(美國Chondrex公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號:20022)、弗氏完全佐劑(美國Sigma公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號:F5881);大鼠白介素-10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)ELISA試劑盒(武漢基因美科技有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號GR201708-1)。
1.3 方法 (1)動物分組:將60只大鼠隨機(jī)分為空白組、CIA模型組、艾拉莫德組,每組20只。(2)模型制備:將牛Ⅱ型膠原等體積加入弗氏完全佐劑后,于冰浴條件下使二者充分乳化[4],CIA模型組和艾拉莫德組大鼠足跖及尾根部采用多點(diǎn)皮內(nèi)注射的方法進(jìn)行初次免疫,0.3 ml/只,初次免疫第8天,再次制備上述乳劑,進(jìn)行加強(qiáng)免疫。免疫后第21天時,關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)≥6分提示造模成功[8]。(3)治療方法:造模成功后,艾拉莫德組給予每只大鼠每天灌胃艾拉莫德10 mg·kg-1·d-1,模型組給予每只大鼠每天灌胃等量生理鹽水,給藥4周。
1.4 觀察指標(biāo) (1)大鼠體質(zhì)量變化:測體質(zhì)量,每4天1次,直至治療結(jié)束。(2)滑膜病理變化情況:HE染色,光鏡下觀察滑膜細(xì)胞和血管的增生及淋巴細(xì)胞浸潤等情況。(3)ELISA法檢測細(xì)胞因子:末次治療24 h后,取大鼠血液離心后采血清,使用ELISA方法檢測IL-10、TGF-β的表達(dá)水平。(4)實時熒光定量PCR測定:末次治療24 h后,獲取滑膜,提取滑膜總RNA,鑒定總RNA純度和濃度,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行引物設(shè)計和合成,最后進(jìn)行Realtime PCR。
2.1 大鼠體質(zhì)量比較 治療前,3組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);治療第57天,艾拉莫德組大鼠體質(zhì)量大于治療前和CIA模型組,但低于空白組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。
表1 各組大鼠治療前后體質(zhì)量比較
2.2 滑膜組織病理形態(tài)學(xué)檢查 空白組大鼠關(guān)節(jié)滑膜有4層細(xì)胞層且未見炎性細(xì)胞浸潤;CIA模型組關(guān)節(jié)滑膜有10層細(xì)胞層,可見大量炎性細(xì)胞浸潤;艾拉莫德組有4層細(xì)胞層,未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。
注:a為空白組;b為CIA模型組;c為艾拉莫德組圖1 關(guān)節(jié)滑膜病理光鏡切片 (×400)
2.3 ELISA法檢測細(xì)胞因子變化情況 與空白組比較,CIA模型組和艾拉莫德組血清IL-10、TGF-β表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與CIA模型組比較,艾拉莫德組血清IL-10、TGF-β表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。見表2。
表2 各組細(xì)胞因子表達(dá)情況比較
2.4 Realtime PCR測定細(xì)胞因子變化情況 與空白組比較,CIA模型組和艾拉莫德組關(guān)節(jié)滑膜IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾臟Bcl-6mRNA表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與CIA模型組比較,艾拉莫德組關(guān)節(jié)滑膜IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾臟Bcl-6mRNA表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。見表3。
表3 各組關(guān)節(jié)滑膜IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾臟Bcl-6mRNA表達(dá)比較
RA是以侵蝕性、慢性、全身性多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病。目前認(rèn)為,RA的發(fā)病機(jī)制可能與免疫活性細(xì)胞、異常的抗原提呈細(xì)胞、抗原特異性T細(xì)胞、B細(xì)胞和自身抗體(如類風(fēng)濕因子、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體等)之間的相互作用有關(guān)[9]。雖然T細(xì)胞免疫功能紊亂是RA發(fā)病的主要機(jī)制之一[2],但維持機(jī)體免疫耐受[10]、發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用、通過直接接觸(Fas L、PD-L1)、間接接觸(主要分泌IL-10、TGF-β)發(fā)揮免疫效應(yīng),其中Bcl-6為標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄蛋白[11-13],這類具有特殊功能的B細(xì)胞亞群被稱之為Bregs[14],這也是近年RA發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。亦有研究指出,分泌IL-10的Bregs細(xì)胞在RA患者和其他炎性疾病的免疫調(diào)節(jié)功能中發(fā)揮核心作用[15]。因此,Bregs在RA的發(fā)生發(fā)展中起著極其重要的作用。
大部分治療RA的藥物的作用機(jī)制為抑制機(jī)體T細(xì)胞的增殖,如甲氨蝶呤片、來氟米特片等。而艾拉莫德是我國自主研發(fā)的1.1類新藥,已被亞太抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(APLAR)納入治療RA。艾拉莫德通過T細(xì)胞途徑減少IL-1β、TNF-α的分泌,通過臨床觀察,也降低免疫球蛋白、紅細(xì)胞沉降率,說明其可改善B細(xì)胞的免疫功能,在RA的治療中發(fā)揮作用。研究表明,Bregs亦可調(diào)控免疫球蛋白的類別轉(zhuǎn)換[16]。本研究旨在探討艾拉莫德是否通過調(diào)控Bregs途徑促進(jìn)IL-10、TGF-β、Bcl-6的表達(dá),從而達(dá)到控制關(guān)節(jié)炎癥的作用。
本實驗使用艾拉莫德治療Wistar大鼠CIA模型,結(jié)果顯示,CIA模型組及艾拉莫德組與空白組比較,大鼠體質(zhì)量增加緩慢。經(jīng)艾拉莫德治療后,CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹逐漸消退,在實驗第57天,CIA大鼠體質(zhì)量明顯增加,經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn),CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜有4層細(xì)胞層,炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。本結(jié)果表明,艾拉莫德可明顯改善CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹、使體質(zhì)量增加恢復(fù)正常、關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞層恢復(fù)正常,這與Lina等[17]研究結(jié)果一致:艾拉莫德在RA動物模型中具有較強(qiáng)的抗炎和改善關(guān)節(jié)炎癥狀的功效。
本研究通過與空白組比較,ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)CIA模型組血清IL-10、TGF-β表達(dá)水平降低,PCR熒光定量發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)滑膜中IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾臟Bcl-6mRNA表達(dá)降低,與Johansson等[18]研究結(jié)果一致。Bregs分泌的IL-10、TGF-β、Bcl-6在RA的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[19]。與CIA模型組比較,ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)艾拉莫德組血清IL-10、TGF-β表達(dá)水平未見明顯變化,PCR熒光定量發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)滑膜中IL-10mRNA、TGF-βmRNA及脾臟Bcl-6mRNA表達(dá)未見明顯變化,研究結(jié)果提示,艾拉莫德并未影響IL-10、TGF-β、Bcl-6的表達(dá),說明艾拉莫德不是通過影響IL-10、TGF-β、Bcl-6這條途徑來控制關(guān)節(jié)炎癥。
綜上所述,Bregs有不同的類型,表型各異,根據(jù)表型的不同分為過渡2型邊緣帶前Bregs、MZBregs和分泌IL-10的B10細(xì)胞等。本研究完成了CIA大鼠血清及滑膜中細(xì)胞因子IL-10、TGF-β及標(biāo)志蛋白Bcl-6的檢測,因艾拉莫德對免疫球蛋白有抑制作用,艾拉莫德是否通過影響過渡2型邊緣帶前Bregs或MZBregs控制關(guān)節(jié)炎癥將是下一步的研究重點(diǎn)。