劉睿，王琳，畢會芳，孫德鵬，車明秀，胡明燕

山東省食品藥品檢驗研究院（濟南 250101）

生物胺是由食品微生物的酶促氨基酸脫羧反應(yīng)產(chǎn)生的，具有生物活性的一類小分子堿性含氮有機化合物。生物胺普遍存在于魚類及其制品、奶酪、黃酒、葡萄酒等食品中。按照化學(xué)結(jié)構(gòu)，可以將生物胺分為脂肪胺（腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、胍丁胺）、芳香胺（2-苯乙胺、酪胺、章魚胺）和雜環(huán)胺（組胺、色胺、5-羥色胺）；而雜環(huán)胺又可細分為咪唑胺（組胺）和吲哚胺（色胺和5-羥色胺）；按氨基數(shù)量可將生物胺分為單胺、二胺和多胺[1]。微量的生物胺是生物體內(nèi)正常的活性成分，但當(dāng)人體攝入過量的生物胺時，就會引起頭痛、惡心等食源性生物胺中毒，嚴重會危及生命。另外，精胺、亞精胺和胍丁胺等生物胺是致癌物亞硝胺的前提物質(zhì)[1]。

葡萄酒是以鮮葡萄或葡萄汁為原料，經(jīng)全部或部分發(fā)酵釀制而成的，含有一定酒精度的發(fā)酵酒。葡萄酒中的生物胺含量與原料的衛(wèi)生狀況、發(fā)酵過程中微生物的代謝以及發(fā)酵過程的參數(shù)等均有關(guān)系[2]。由于酒類的主要成分乙醇（以及微量成分乙醛）能夠顯著增強生物胺的毒性，因此酒類中所允許的生物胺含量應(yīng)低于其他食品[1]。一些葡萄酒生產(chǎn)國要求葡萄酒中組胺的含量不得超過：德國2 mg/L，比利時5～6 mg/L，瑞士和澳大利亞10 mg/L，法國8 mg/L，荷蘭2 mg/L[3]。我國尚未明確葡萄酒中生物胺的限量要求。葡萄酒中生物胺含量的測定主要通過液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、毛細管電泳法以及最近新開發(fā)的傳感器技術(shù)進行檢測[4]。

根據(jù)GB 5009.208—2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》中液相色譜法測定葡萄酒樣本中的9種生物胺含量，并對其進行分析研究。同時對葡萄酒中生物胺的產(chǎn)生原因及控制措施進行系統(tǒng)分析，并對葡萄酒生物胺限量的制定及進一步監(jiān)管提出意見和建議，以促進我國葡萄酒行業(yè)綠色健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同品牌葡萄酒樣本100批次（其中含國產(chǎn)葡萄酒80批次，進口葡萄酒20批次），市售。乙腈、正己烷、乙酸、乙酸銨，均為色譜純，海阿拉?。槐?，色譜純，天津康科德；乙醚、正丁醇、三氯甲烷、谷氨酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、三氯乙酸，均為分析純，上海國藥；丹磺酰氯，純度＞99%，上海國藥；1, 7-二氨基庚烷，純度＞98%，Bepure；2-苯乙胺，純度＞98%，Bepure；亞精胺三鹽酸鹽，純度＞97%，Bepure；尸胺，純度＞98%，Dr. Ehrenstorfer GmbH；鹽酸章魚胺，純度＞97%，Dr. Ehrenstorfer GmbH；精胺四鹽酸鹽，純度＞97%，Bepure；組胺二鹽酸鹽，純度＞99%，Dr. Ehrenstorfer GmbH；腐胺二鹽酸鹽，純度＞98%，Bepure；色胺，純度＞99%，Bepure；酪胺鹽酸鹽，純度＞98%，Dr. Ehrenstorfer GmbH。

高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾公司；電子天平，梅特勒-托利多公司；離心機，德國Sigma公司；均質(zhì)機，德國IKA公司；超純水發(fā)生器，美國密理博公司；酸度計，梅特勒-托利多公司；氮吹儀，上海安譜實驗科技股份有限公司；濾膜針頭濾器，0.22 μm。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗原理

試樣用丹磺酰氯衍生，C18色譜組分離，以1, 7-二氨基庚烷為內(nèi)標，高效液相色譜儀檢測，內(nèi)標法定量。

1.2.2 試劑配制

內(nèi)標溶液配制：準確稱取適量內(nèi)標標準品，置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解后稀釋至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的內(nèi)標標準儲備溶液，置-20 ℃冰箱儲存。吸取上述內(nèi)標標準儲備溶液于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，混勻，作為內(nèi)標標準中間使用液。吸取1.0 mL內(nèi)標標準中間使用液于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，混勻，作為內(nèi)標使用液。

衍生試劑配制：準確稱取適量丹磺酰氯，以丙酮為溶劑配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的衍生劑使用液，置4 ℃冰箱避光儲存。

生物胺標準系列溶液配制：分別吸取1.0 mL各生物胺單組分標準儲備溶液，置于同一個10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，混勻，配制成生物胺標準混合使用液（100 mg/L）。分別吸取0.10，0.25，0.50，1.0，1.50，2.50和5.0 mL生物胺標準混合使用溶液（100 mg/L），置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，混勻，使其質(zhì)量濃度分別為1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，25.0和50.0 mg/L。

1.2.3 試樣制備

準確量取1.0 mL樣品于15 mL塑料離心管中，依次加入250 μL內(nèi)標溶液（100 mg/L）、1 mL飽和碳酸氫鈉溶液、100 μL氫氧化鈉溶液（1 mol/L）、1 mL衍生試劑，渦旋混勻1 min后置于60 ℃恒溫水浴鍋中衍生15 min，取出，分別加入100 μL谷氨酸鈉溶液，振蕩混勻，60 ℃恒溫反應(yīng)15 min，取出冷卻至室溫，于每個離心管中加入1 mL超純水，渦旋混合1 min，40 ℃水浴下氮吹除去丙酮（約1 mL），加入0.5 g氯化鈉渦旋振蕩至完全溶解，再加入5 mL乙醚萃取，渦旋振蕩2 min，靜置分層后，轉(zhuǎn)移上層有機相（乙醚層）于15 mL離心管中，水相（下層）再次用乙醚萃取，合并兩次萃取液，40 ℃水浴下氮氣吹干。加入1 mL乙腈振蕩混勻，使殘留物溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜針頭濾器過濾，待測定。

1.2.4 色譜條件

色譜柱，Xbridge C18，3.5 μm，4.6 mm×250 mm；流動相，甲醇（A）-20 mmol/L醋酸銨（B）；檢測器，紫外檢測器（波長254 nm）；柱溫，35 ℃；流速，1.00 mL/min；進樣體積，10 μL。

以此色譜條件將標準品和樣品色譜圖進行對照，根據(jù)保留時間確定樣品中各組分的色譜峰。

1.2.5 標準曲線繪制

分別移取1 mL生物胺標準系列溶液，置于10 mL具塞試管中，依次加入250 μL內(nèi)標使用液（100 mg/L），以下操作同試樣的衍生步驟。將20 μL系列混合標準工作液的衍生液分別注入高效液相色譜儀，測得目標化合物的峰面積，以系列混合標準工作液的濃度為橫坐標，以目標化合物的峰面積與內(nèi)標的峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.6 樣品測定

將試樣的衍生溶液注入高效液相色譜儀中，測得峰面積，以保留時間定性。根據(jù)標準曲線得到待測液中各目標化合物的濃度。

根據(jù)上述試驗步驟，測定葡萄酒試樣中9種生物胺含量，每個樣品平行測定2次，結(jié)果取平均值。

2 生物胺檢測結(jié)果與分析

2.1 生物胺檢測結(jié)果

根據(jù)GB 5009.208—2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》，采用高效液相色譜法對100批次葡萄酒樣品中的9種生物胺進行了檢測，詳細結(jié)果見表1和表2。

對全部葡萄酒樣品生物胺總量及各生物胺組分檢出率進行統(tǒng)計，結(jié)果見圖1。此次研究結(jié)果共7批次樣品未測出生物胺，檢出率為93%。其中檢出率超過50%的生物胺組分分別為腐胺（90%）、組胺（73%）、酪胺（68%）和章魚胺（53%）。對比國產(chǎn)和進口葡萄酒，檢出率均在50%以上的生物胺為腐胺、組胺和酪胺，說明這3種生物胺在葡萄酒中存在最普遍。

表1 國產(chǎn)葡萄酒各生物胺組分含量 mg/L

表2 進口葡萄酒各生物胺組分含量 mg/L

圖1 國產(chǎn)和進口葡萄酒各生物胺組分檢出率比較

對全部葡萄酒樣品生物胺總量及各生物胺組分平均檢出值進行統(tǒng)計，結(jié)果見圖2。對比國產(chǎn)和進口葡萄酒生物胺總量及各生物胺組分的平均檢出值進行分析，國產(chǎn)葡萄酒的生物胺總量明顯高于進口葡萄酒；對于檢出率較高的3種生物胺，國產(chǎn)和進口葡萄酒中的含量均較高，且平均檢出值國產(chǎn)葡萄酒明顯高于進口葡萄酒。

圖2 國產(chǎn)和進口葡萄酒各生物胺組分平均檢出值比較

GB 5009.208—2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》中液相色譜法規(guī)定了葡萄酒中各生物胺的檢出限和定量限。依據(jù)國家標準對國產(chǎn)和進口葡萄酒中各生物胺組分檢出率進行統(tǒng)計，結(jié)果見圖3。國家標準檢出限和定量限檢出率國產(chǎn)葡萄酒整體高于進口葡萄酒。

圖3 生物胺組分檢出率

2.2 國產(chǎn)葡萄酒與進口葡萄酒生物胺含量對比分析

此次研究采購的葡萄酒樣本為中低檔葡萄酒，國產(chǎn)葡萄酒以中檔葡萄酒為主，進口葡萄酒以較為低端的餐酒為主。對比國產(chǎn)和進口葡萄酒各生物胺檢出率、平均檢出值、國家標準檢出限及定量限檢出率進行分析，國產(chǎn)葡萄酒和進口葡萄酒腐胺、組胺和酪胺檢出率較高，且國產(chǎn)葡萄酒中各生物胺含量明顯高于進口葡萄酒。根據(jù)我國生物胺檢測國家標準，國產(chǎn)葡萄酒生物胺檢出情況要高于進口葡萄酒。

由此可見，我國葡萄酒生物胺含量的控制需進一步改善。

3 控制措施與建議

3.1 葡萄酒中生物胺產(chǎn)生原因及控制措施

葡萄酒中存在多種生物胺，來自葡萄果實和發(fā)酵過程。大量研究表明，葡萄果實中存在腐胺、亞精胺、尸胺、組胺等多種生物胺，其中生物胺的種類和含量受品種、產(chǎn)地、年份、氣候、土壤、栽培處理及成熟度等影響[6-7]。葡萄酒釀造包括兩個階段：第一階段為物理化學(xué)或物理學(xué)階段，即在釀造紅葡萄酒時，葡萄漿果中的固體成分通過浸漬進入葡萄汁，在釀造白葡萄酒時，通過壓榨獲得葡萄汁；第二階段為生物學(xué)階段，即酒精發(fā)酵和蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF）階段[8]。

大量研究表明，葡萄酒中的生物胺主要來源于發(fā)酵過程，釀造工藝的選擇對于保證葡萄酒的安全性很重要。影響生物胺含量的因素主要是前提氨基酸、釀酒微生物，以及發(fā)酵過程的控制[7,9-21]。葡萄酒生產(chǎn)過程中生物胺的控制手段主要有：（1）選擇品質(zhì)優(yōu)良、衛(wèi)生狀況好的葡萄原料；（2）接種無組氨酸脫羧酶活性的菌株進行MLF；（3）MLF結(jié)束后立即對乳酸菌進行清除，可采用添加足夠的二氧化硫，添加化學(xué)抑制劑或進行瞬間高溫滅菌等工藝[7,9-21]。

3.2 建議

3.2.1 制定葡萄酒中生物胺限量要求與相應(yīng)法規(guī)

2011年國務(wù)院食品安全委員會辦公室印發(fā)了《關(guān)于進一步加強酒類質(zhì)量安全工作的通知》（食安辦[2011]23號），要求加強對白酒、葡萄酒、黃酒等生產(chǎn)加工過程產(chǎn)生的生物胺的風(fēng)險檢測和評估。建議監(jiān)管部門嚴格按照國家要求，建立生物胺風(fēng)險評估體系，并制定葡萄酒中生物胺的限量要求與相應(yīng)法規(guī)。

3.2.2 加大監(jiān)管力度，并利用快速檢測方法提高監(jiān)管效率

建議相關(guān)監(jiān)督管理部門能夠加大對葡萄酒行業(yè)的監(jiān)督管理力度，對葡萄酒中生物胺等知識進行宣貫普及。通過調(diào)研、試驗、驗證等方式增加生物胺的快速檢測方法，以提高監(jiān)管效率。

4 結(jié)論

采用GB 5009.208—2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》標準中規(guī)定的高效液相色譜法，依次對80批次國產(chǎn)葡萄酒和20批次進口葡萄酒中的生物胺含量進行了檢測與分析。結(jié)果表明，國產(chǎn)葡萄酒與進口葡萄酒生物胺含量的控制尚存在著一定的差距，應(yīng)持續(xù)改進我國葡萄酒中生物胺含量的控制手段，在實際生產(chǎn)中選擇品質(zhì)及衛(wèi)生狀況優(yōu)良的葡萄果實和適當(dāng)?shù)尼勗旃に嚕梢韵鄳?yīng)降低葡萄酒中生物胺的產(chǎn)生。建議監(jiān)督管理部門制定葡萄酒中生物胺限量標準，增進監(jiān)督管理手段和監(jiān)管力度，以確保我國葡萄酒行業(yè)的健康發(fā)展。