乳酸片球菌AS185調(diào)節(jié)高脂高糖飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征

張 麟，高 磊，王 超，趙子健，段翠翠，趙玉娟，楊 舸，李盛鈺,*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

代謝綜合征是一組復(fù)雜的代謝紊亂癥候群，是城市化和生活方式的改變，特別是將常規(guī)飲食改為高脂、高糖飲食造成的[1]。代謝綜合征是導(dǎo)致肥胖、高血脂、糖尿病和心血管疾病等的危險(xiǎn)因素[2]，因此其診斷和治療方案也越來越受到重視。

益生菌被定義為公認(rèn)食用安全的活的微生物，攝入足夠數(shù)量時(shí)，對(duì)宿主的健康有促進(jìn)作用。益生菌是一類重要的功能性食品原料，因其在調(diào)節(jié)腸道菌群、改善便秘和腹瀉、抑制有害微生物、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、預(yù)防腫瘤等方面的潛在功效而受到消費(fèi)者的關(guān)注[3-7]。特別是其在減肥、調(diào)節(jié)血脂和降低血清膽固醇、降血糖、抗動(dòng)脈粥樣硬化等代謝調(diào)控紊亂相關(guān)疾病防治方面的作用[8-12]。

乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）是一種革蘭氏陽性球菌，在商業(yè)發(fā)酵過程中廣泛用于生產(chǎn)普通食品[13]。有研究報(bào)道，通過口服乳酸片球菌R037可以減輕慢性炎癥并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，成功緩解了動(dòng)脈粥樣硬化[14-15]。乳酸片球菌AS185是本實(shí)驗(yàn)室自主分離鑒定的一株乳酸菌新菌株，前期研究表明，該菌株具有較好的黏附和耐受能力，并通過調(diào)節(jié)血脂、抑制炎癥因子及黏附分子改善抗動(dòng)脈粥樣硬化癥狀[16]。因此，推測(cè)乳酸片球菌AS185具有減輕不健康的血脂異常狀態(tài)和抑制炎癥的能力，可能適用于改善代謝綜合征，但其作用和機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。本研究考察乳酸片球菌AS185對(duì)高脂高糖誘導(dǎo)代謝綜合征模型小鼠的治療作用和機(jī)制，為其開發(fā)成食品、保健品、藥品等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、菌株與試劑

45 只7 周齡（體質(zhì)量35～50 g）清潔級(jí)ICR雄性健康小鼠，購于長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2011-0004。進(jìn)行為期1 周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，動(dòng)物房溫度（21±2）℃、相對(duì)濕度（40±10）%，采食和飲水由小鼠自由進(jìn)行。

基礎(chǔ)飼料和高脂飼料（83.3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）基礎(chǔ)飼料+10%豬油+3%膽固醇+3%白砂糖+0.5%的膽酸鈉+0.2%丙基硫氧嘧啶）均由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

實(shí)驗(yàn)菌株AS185是從吉林省延吉地區(qū)傳統(tǒng)農(nóng)家大醬中分離獲得的一株乳酸菌新菌株，經(jīng)API 50 CHL鑒定系統(tǒng)和16S rDNA序列比對(duì)，鑒定為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏登記號(hào)為CCTCCNO：M2018114[17]。

總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）檢測(cè)試劑盒 南京建成生物技術(shù)公司；小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、胰島素（insulin，INS）、游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）、C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒 上海江萊生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；兔抗核因子κ B（nuclear factor kappa-B，NF-κB）抗體、兔抗磷酸化NF-κB（phosphorylation NF-κB，p-NF-κB）、兔抗Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）單克隆抗體、兔抗髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）單克隆抗體、兔抗肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）單克隆抗體 英國Abcam公司；腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate activated protein kinase，AMPK）、磷酸化AMPK（phosphorylation AMPK，p-AMPK）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、磷酸化ACC（phosphorylation ACC，p-ACC）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c）單克隆抗體 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔二抗 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司；血糖儀瑞士Roche有限公司；ELx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；SQ810C型高溫高壓滅菌鍋 重慶雅瑪拓科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

連續(xù)活化3 代的乳酸片球菌AS185菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃靜置培養(yǎng)16 h后，將菌液在4 ℃、4 000×g條件下離心15 min，棄上清液，取菌泥用滅菌生理鹽水洗滌1 次，并調(diào)整活菌數(shù)濃度為1×109CFU/mL，備用。

1.3.2 造模方法與分組

表1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案Table 1 Grouping of experimental animals

按參考文獻(xiàn)[18]的方法，小鼠隨機(jī)分為3 組，每組15 只（表1）。每2 周測(cè)體質(zhì)量并尾靜脈取血測(cè)定斷食不斷水12 h的空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）濃度1 次。造模結(jié)束后，禁食12 h后，尾靜脈取血測(cè)FBG測(cè)定、血脂水平（TC、TG、LDL-C、HDL-C）并檢測(cè)體質(zhì)量。飼養(yǎng)6 周結(jié)束后，模型組和AS185組小鼠滿足以下條件中任意2 項(xiàng)即為代謝綜合征模型造模成功小鼠[19]：1）體質(zhì)量高于對(duì)照組小鼠體質(zhì)量20%；2）血清中血脂水平改變，即TC、TG、LDL-C水平升高和HDL-C水平降低；3）胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance index，IR）升高。最終，各組篩選出10 只符合模型納入標(biāo)準(zhǔn)的小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。其中，AS185組灌胃乳酸片球菌AS185菌懸液（1.0×109CFU/mL），劑量為每日12 mL/kg，對(duì)照組和模型組給予等體積的無菌生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃8 周（第7～14周）。每2 周測(cè)定體質(zhì)量及FBG濃度。末次灌胃后，眼球采血，4 ℃、3 000×g條件下離心10 min，收集血清，－80 ℃凍存；斷頸處死后，解剖，摘取肝臟，－80 ℃凍存，備用。

1.3.3 血清生化指標(biāo)測(cè)定

血脂指標(biāo)（TC、TG、HDL-C、LDL-C和FFA）、血清炎癥指標(biāo)（TNF-α、IL-6、IL-1β、CRP和LPS）及INS水平檢測(cè)，按照試劑盒說明書方法操作。利用穩(wěn)態(tài)模型（homeostasis model assessment，HOMA）評(píng)估胰島素抵抗（insulin resistance，IR）指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR按照下式計(jì)算。

1.3.4 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

根據(jù)文獻(xiàn)[20]的方法，取各組小鼠肝臟50 mg，加入適量蛋白裂解液勻漿，離心收集上清液，采用BCA法測(cè)定總蛋白質(zhì)量濃度。首先，加上樣緩沖液同時(shí)沸水浴10 min使蛋白變性，－20 ℃冷藏，備用；之后進(jìn)行蛋白電泳分離，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（濃縮膠60 mV電壓，30 min；分離膠120 mV電壓，120 min），隨后60 mV電壓，90 min轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；室溫封閉60 min，3%牛血清白蛋白封閉液于搖床上進(jìn)行封閉；最后孵育一抗，TBST洗膜3 次，每次7 min，并分別加入TLR4、NF-κB、p-NF-κB、LKB1、AMPK、p-AMPK、ACC、p-ACC、SREBP-1c等抗體，4 ℃反應(yīng)過夜；次日，以TBST洗膜3 次，每次10 min；再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（稀釋體積比為1∶3 000），常溫下反應(yīng)1 h；再用TBST洗膜4 次，每次5 min；采用電化學(xué)發(fā)光法曝光，并用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

分析處理數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行繪圖，使用SPSS 23.0軟件的單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性比較，結(jié)果均以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸片球菌AS185對(duì)代謝綜合征模型小鼠體質(zhì)量、INS、FBG及HOMA-IR的影響

表2 乳酸片球菌AS185對(duì)高脂高糖誘導(dǎo)代謝綜合征模型小鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effect of P.acidilactici AS185 on body mass of mice with metabolic syndrome induced by high-fat and high-fructose diet

由表2可知，AS185組體質(zhì)量雖呈上升趨勢(shì)，但與模型組相比，上升趨勢(shì)緩慢，并在第12周和第14周體質(zhì)量與模型組相比出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），說明乳酸片球菌AS185具有緩解高脂高糖飲食誘導(dǎo)代謝綜合征的體質(zhì)量上升的趨勢(shì)。

表3 乳酸片球菌AS185對(duì)代謝綜合征模型小鼠INS、FBG、HOMA-IR的影響Table 3 Effect of P.acidilactici AS185 on INS, FBG and HOMA-IR of mice with metabolic syndrome induced by high-fat and high-fructose diet

由表3可知，14 周后，與模型組相比，AS185組小鼠血清中的INS和FBG水平也呈下降趨勢(shì)，同時(shí)HOMA-IR降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明乳酸片球菌AS185對(duì)代謝綜合征具有改善胰島素抵抗的作用。

2.2 乳酸片球菌AS185對(duì)高脂高糖誘導(dǎo)代謝綜合征模型小鼠血脂水平的影響

表4 乳酸片球菌AS185對(duì)代謝綜合征模型小鼠血清TC、TG、LDL、HDL、FFA水平的影響Table 4 Effect of P.acidilactici AS185 on serum TC, TG, LDL, HDL and FFA levels of mice with metabolic syndrome induced by high-fat and high-fructose diet

由表4可知，高脂高糖飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征小鼠血脂代謝出現(xiàn)紊亂，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C及FFA的水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；同時(shí)，HDL-C水平有降低趨勢(shì)；而與模型組相比，AS185組小鼠血脂指標(biāo)TC、TG、LDL-C、FFA的水平也均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），這說明乳酸片球菌AS185能夠改善代謝綜合征小鼠的血脂代謝紊亂。

2.3 乳酸片球菌AS185對(duì)代謝綜合征模型小鼠血清炎癥因子水平的影響

表5 乳酸片球菌AS185對(duì)高脂高糖誘導(dǎo)代謝綜合征模型小鼠血清炎癥因子水平的影響Table 5 Effect of P.acidilactici AS185 on inflammatory factor levels of mice with metabolic syndrome induced by high-fat and high-fructose diet

由表5可以看出，代謝綜合征會(huì)誘發(fā)小鼠體內(nèi)慢性炎癥，與對(duì)照組相比，模型組小鼠的血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP及LPS的水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，AS185組小鼠血清中的IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP、LPS水平均有降低趨勢(shì)，其中IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。以上結(jié)果提示，乳酸片球菌AS185有改善代謝綜合征小鼠血清中的炎癥水平，進(jìn)而緩解機(jī)體慢性炎癥狀態(tài)的可能。

2.4 乳酸片球菌AS185對(duì)代謝綜合征模型小鼠臟組織蛋白表達(dá)的影響

2.4.1 肝組織中TLR4/MyD88/p-NF-κB炎癥通路蛋白的表達(dá)

圖1 乳酸片球菌AS185對(duì)高脂高糖飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征模型小鼠肝臟炎癥通路蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of P.acidilactici AS185 on the expression of proteins associated with inflammatory signaling pathways in liver of mice with metabolic syndrome induced by high-fat and high-fructose diet

由圖1可知，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟中TLR4、MyD88及p-NF-κB蛋白表達(dá)水平極顯著上升（P＜0.01），表明代謝綜合征誘發(fā)了肝臟的炎性反應(yīng)，使機(jī)體出現(xiàn)慢性炎癥；經(jīng)乳酸片球菌AS185治療后，小鼠肝臟中TLR4、MyD88及p-NF-κB表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），NF-κB總蛋白水平無顯著變化，說明p-NF-κB水平的改變并不是因?yàn)镹F-κB總蛋白表達(dá)的變化而引起的，而是因?yàn)樯嫌蜯yD88活化引起，說明乳酸片球菌AS185能抑制高脂高糖飲食誘導(dǎo)中TLR4、MyD88及p-NF-κB的表達(dá)，降低了肝臟的炎性損傷，緩解機(jī)體慢性炎癥。

2.4.2 肝組織中LKB1/AMPK/p-ACC脂代謝通路蛋白的表達(dá)

圖2 乳酸片球菌AS185對(duì)代謝綜合征模型小鼠肝組織脂代謝通路蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of P.acidilactici AS185 on the expression of proteins associated with lipid metabolism signaling pathways in liver of mice with metabolic syndrome induced by high-fat and high-fructose diet

由圖2可知，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟中LKB1、p-AMPK、p-ACC表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），SREBP-1c水平極顯著升高（P＜0.01），表明高脂高糖能夠引起小鼠的脂代謝紊亂；結(jié)合圖1進(jìn)一步說明，機(jī)體出現(xiàn)慢性炎癥的同時(shí)會(huì)伴隨脂代謝紊亂的出現(xiàn)。經(jīng)乳酸片球菌AS185治療后，小鼠肝臟中LKB1、p-AMPK和p-ACC表達(dá)水平顯著升高，SREBP-1c蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，乳酸片球菌AS185能夠干擾LKB1介導(dǎo)高脂高糖對(duì)代謝綜合征小鼠誘導(dǎo)的肝臟AMPK和ACC磷酸化的作用，并抑制SREBP-1c成熟，改善機(jī)體脂代謝的紊亂。

3 討 論

高糖高脂飲食導(dǎo)致的胰島素抵抗與系統(tǒng)性低水平炎癥密不可分。Mansyur等[21]發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗的發(fā)展與炎癥有關(guān)，幾種炎癥標(biāo)記物表現(xiàn)出臨床重要性，包括CRP、白細(xì)胞、纖維蛋白原和白蛋白，高三酰甘油血癥作為代謝綜合征成分也會(huì)影響炎癥。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗與肥胖之間也存在聯(lián)系，其中脂肪組織在發(fā)展胰島素抵抗的機(jī)制中發(fā)揮重要作用。脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的非酯化脂肪酸可通過底物競(jìng)爭(zhēng)和受損的細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)來阻止碳水化合物的代謝。脂肪組織分泌的最常見的細(xì)胞因子是脂聯(lián)素，脂聯(lián)素具有顯著的胰島素增敏作用，因此脂肪組織的增加導(dǎo)致與胰島素抵抗和代謝綜合征相關(guān)的脂聯(lián)素水平的降低。脂肪組織還產(chǎn)生幾種炎癥因子，例如IL-6，IL-6刺激CRP的產(chǎn)生，這也可以加劇與肥胖有關(guān)的炎癥，繼而導(dǎo)致肥胖相關(guān)的胰島素抵抗[22-23]。與已有研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)得出高脂高糖飲食的代謝綜合征小鼠表現(xiàn)出一系列的代謝紊亂，包括空腹血糖和空腹胰島素水平均顯著增加，血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP水平的增加，導(dǎo)致小鼠肥胖出現(xiàn)系統(tǒng)性低水平炎癥進(jìn)而引起血糖-胰島素穩(wěn)態(tài)失衡，經(jīng)乳酸片球菌AS185干預(yù)后，機(jī)體低水平炎癥有所改善，同時(shí)胰島素抵抗指數(shù)顯著下降。

AMPK是哺乳動(dòng)物細(xì)胞能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子。活化的AMPK刺激ATP產(chǎn)生的分解代謝途徑，如脂肪酸β氧化，并抑制ATP消耗過程，如脂肪生成[21-22]。AMPK的磷酸化依賴于上游LKB1的激活。LKB1是一種能夠磷酸化AMPK的上游激酶，是細(xì)胞對(duì)低能量反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)[23]。本研究的結(jié)果表明，AS185可能通過LKB1特異性siRNA刺激LKB1磷酸化，并清除LKB1，明顯阻斷了AS185處理肝細(xì)胞的AMPK和ACC磷酸化，通過促進(jìn)新生脂肪的形成和脂肪酸氧化，可改善高糖高脂飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征。AMPK的第一個(gè)下游酶靶點(diǎn)是ACC，它參與丙二酰輔酶A的合成。AMPK通過磷酸化ACC在Ser77和Ser79上抑制ACC活性，從而刺激脂肪酸氧化和降低脂肪酸合成[24]。此外，乳酸片球菌AS185對(duì)SREBP-1c的成熟有抑制作用。SREBP-1c是一種重要的成脂轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物肝臟中含量豐富。由于SREBP-1c的過度表達(dá)，脂肪酸進(jìn)入肝細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)新的成脂過程[25]。成熟后，SREBP-1c轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，轉(zhuǎn)錄上調(diào)SCD-1和FAS表達(dá)，這是肝細(xì)胞從頭合成脂肪酸和TG所需的關(guān)鍵酶[26]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AS185組TC和FFA的產(chǎn)生減少可能是SREBP-1水平降低所致，這與以往的研究結(jié)果[27]一致。因此，本研究結(jié)果表明，乳酸片球菌AS185的補(bǔ)充是通過AMPK途徑介導(dǎo)ACC磷酸化和抑制SREBP-1信號(hào)來達(dá)到降脂的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乳酸片球菌AS185不僅通過調(diào)節(jié)脂類代謝通路，而且通過在肝水平限制TLR4和MyD88的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的增加，抑制NF-κB活化，從而減少代謝綜合征引起的炎癥及其介質(zhì)。Wang Yuhua等[28]報(bào)道，鼠李糖乳桿菌LGG通過抑制TLR4和TLR5以及抑制NF-κB活化和減少TNF-α生成，增加酒精性肝炎癥的保護(hù)作用。而Jung等[29]的研究表明L.sakeiK040706通過激活巨噬細(xì)胞中的TLR2-NF-κB途徑產(chǎn)生NO、TNF-α和IL-6，且與TLR4無相互作用。L.paracasei通過誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，以TLR2-IRAK4依賴的方式抑制單核細(xì)胞頂體產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子[30]。另外，Raso等[31]指出L.paracaseiB21060在TLR2和TLR4表達(dá)上的活性相同，共享導(dǎo)致NF-κB活化的相同信號(hào)級(jí)聯(lián)。因此，益生菌可能通過誘導(dǎo)TLR2、TLR4等多種TLRs受體途徑調(diào)控高糖高脂飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征中發(fā)揮作用，乳酸片球菌AS185改善代謝綜合征引起的炎癥反應(yīng)的準(zhǔn)確機(jī)制還有待于進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，乳酸片球菌AS185通過MyD88依賴的TLR4/NF-κB通路抑制了促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，并依賴AMPK通路提升了LKB1、AMPK和ACC蛋白表達(dá)的脂代謝通路，改善了高糖高脂飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征。