王瑩蕾, 趙鈺瑩, 劉 旭, 王小葉, 劉子翔 徐云巧, 朱 妍, 莊 靖, 田 李

(曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，273165，山東省曲阜市)

大麗輪枝菌是引發(fā)多種農(nóng)作物(包括棉花、茄子等重要經(jīng)濟作物)產(chǎn)生黃萎病的土傳性病原真菌，在世界范圍內(nèi)造成重大經(jīng)濟損失[1，2].長期的致病機理研究發(fā)現(xiàn)，大麗輪枝菌胞外分泌蛋白在侵染過程發(fā)揮重要作用，是最終引起寄主植株發(fā)病和死亡的主要因素[3].胞外蛋白大致分為兩類：一是扮演毒力因子或者參與調(diào)控寄主免疫反應(yīng)的效應(yīng)蛋白.如蛋白譜發(fā)現(xiàn)的小分子量富含半胱氨酸類蛋白VdSCP7，可誘導(dǎo)植物的免疫反應(yīng)[4]；比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)的幾丁質(zhì)結(jié)合模體蛋白LysM抑制幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的植物免疫反應(yīng)[5].另外一類是具有酶活的分泌型蛋白.分泌蛋白中的大量酶類可以降解寄主植物的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，這不僅有利于病原真菌的侵入與擴展，也為病原菌的生存提供了必要的碳源.根據(jù)酶作用的底物，細(xì)胞壁降解酶可分為果膠酶、纖維素酶等種類.目前，研究人員通過基因敲除實驗發(fā)現(xiàn)果膠酶裂解酶VdPL3.1/3[6]，纖維素酶VdEG1/3[7]均參與大麗輪枝菌的致病性.這可能與大麗輪枝菌需要降解寄主富含果膠和纖維素的細(xì)胞壁，從而進入維管束的生活史特點密切相關(guān)[8].淀粉是植物細(xì)胞內(nèi)的重要碳源，大麗輪枝菌如何利用寄主的淀粉作為其營養(yǎng)物質(zhì)一直不明確.本研究選取了一個大麗輪枝菌淀粉酶，利用基因敲除技術(shù)對其功能進行了初步研究.

1 材料與方法

1.1 大麗輪枝菌Vd991淀粉酶基因VdAmy-1的克隆

根據(jù)酵母菌淀粉酶蛋白序列，在NCBI大麗輪枝菌基因組數(shù)據(jù)庫中進行BLASTp搜索.根據(jù)數(shù)據(jù)庫中該蛋白的編碼基因序列，設(shè)計可擴增該基因全長的引物Amy-F/R (見表1).分別以大麗輪枝菌Vd991基因組DNA和cDNA為模板，擴增該基因的全長序列和編碼框序列.PCR產(chǎn)物送交上海生工生物工程有限公司測序.

1.2 VdAmy-1信號肽功能驗證

PCR擴增編碼信號肽的基因序列，將擴增產(chǎn)物連接到EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切的pSUC2載體(該載體含有缺失信號肽的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因SUC).利用聚乙二醇/醋酸鋰(PEG/LiAc)法將重組載體轉(zhuǎn)入YTK12酵母菌株(該酵母菌株缺失蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因SUC，在以棉子糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中不能生長).將上述酵母菌培養(yǎng)在以棉子糖為唯一碳源的YPRAA培養(yǎng)基 (1% yeast extract,2% peptone,2% raffinose,2 μg/Μl antimicyn A)，通過觀察酵母是否生長，判斷蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC是否可有效分泌.

1.3 VdAmy-1基因敲除突變體的構(gòu)建

按照高效大麗輪枝菌基因敲除方法進行[9].簡要來說，使用引物K1-K6分別擴增VdAmy-1基因上游、下游和潮霉素抗性基因片段，融合 PCR方法構(gòu)建基因敲除載體，然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化大麗輪枝菌.在添加有50 μg/mL頭孢霉素、30 μg/mL潮霉素和50 μmol/L F2dU的PDA培養(yǎng)基中篩選基因敲除轉(zhuǎn)化子，并利用VdAmy-1基因內(nèi)部引物K7-K8對其進行PCR分子驗證.將野生型VdAmy-1基因重新導(dǎo)入突變體細(xì)胞，得到回補菌株.本文所使用的引物見表1.

表1 本研究中使用的引物

1.4 突變體菌株利用淀粉能力分析

分別取5 μL濃度為1×106個/mL野生型菌株、突變體菌株和功能互補菌株的孢子點接至1%淀粉作為唯一碳源的固體查比克鹽(NaNO32 g/L，KCl 0.50 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.50 g/L) 培養(yǎng)基上(以豐富培養(yǎng)基PDA為對照)，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d并拍照，根據(jù)菌落大小定性推測各菌株利用淀粉能力的差異.

1.5 致病力檢測

在棉苗子葉期，將棉株連根拔起.將根在無菌水中沖洗，然后置于大麗輪枝菌的孢子懸浮液中5 min.每個菌株接種10株棉苗，共設(shè)3個重復(fù).接菌后的第4周拍照并調(diào)查病情指數(shù)[10].

2 結(jié)果與討論

2.1 大麗輪枝菌VdAmy-1基因的序列分析

根據(jù)酵母菌淀粉酶蛋白序列，在大麗輪枝菌 Vd991基因組數(shù)據(jù)庫中進行 BLASTp 搜索，得到大麗輪枝菌Vd991中的同源蛋白，Genbank編號為VEDA_08865，本研究中命名為VdAmy-1.基因測序結(jié)果顯示，該基因全長1967 bp，含有1個內(nèi)含子，編碼635個氨基酸殘基.大麗輪枝菌VdAmy-1蛋白與酵母菌淀粉酶蛋白具有76%的氨基酸序列同源性，其中C端的淀粉酶結(jié)構(gòu)域的同源性高達(dá)91%.蛋白質(zhì)保守功能域預(yù)測表明，在該蛋白的 N端有典型的信號肽，C端有1個保守的淀粉酶(carbohydrate-binding module,family 20)結(jié)構(gòu)域，說明VdAmy-1蛋白是一個分泌型淀粉酶.

2.2 VdAmy-1的N端信號肽具有分泌活性

本研究利用酵母信號肽捕獲系統(tǒng)對其信號肽活性進行驗證[11].YTK12 酵母菌株為蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC缺陷性菌株，不能夠在只含有棉籽糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基YPRAA中生長.pSUC2質(zhì)粒中含有缺失信號肽的SUC2編碼基因，只有在該基因前插入編碼信號肽的核酸序列，并將重組pSUC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入YTK12菌株中，這樣蔗糖轉(zhuǎn)化酶才可以正常分泌至胞外，從而使YTK12菌株可以利用棉籽糖作為碳源生長.

信號肽預(yù)測程序 SignalP 5.0顯示VdAmy-1蛋白質(zhì)N端前21個氨基酸為信號肽序列.本研究將VdAmy-1編碼信號肽的核苷酸序列連接到 pSUC2 載體中，轉(zhuǎn)入YTK12酵母細(xì)胞中進行信號肽活性驗證.結(jié)果顯示，YTK12菌株和含有pSUC2空載體的菌株不能夠在YPRAA培養(yǎng)基中生長，而含有VdAmy-1信號肽的酵母菌株可以在YPRAA培養(yǎng)基中正常生長(圖1)，說明該蛋白的信號肽具有分泌活性，VdAmy-1為大麗輪枝菌分泌型蛋白.

圖1 酵母信號肽捕獲系統(tǒng)驗證VdAmy-1信號肽活性.已知的信號肽Avr1b作為陽性對照

2.3 獲得大麗輪枝菌突變體菌株KO和功能回補菌株EC

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將基因敲除載體導(dǎo)入野生型菌株(Wild Type,WT)進行遺傳轉(zhuǎn)化，共得到26個轉(zhuǎn)化子.選取隨機挑選其中2個候選基因敲除的轉(zhuǎn)化子，對其進行 PCR驗證并命名為KO-1/2.為進一步證明突變體菌株KO-1/2相對于野生型的表型變化是由于VdAmy-1基因缺失所造成的，本研究將VdAmy-1基因重新導(dǎo)入KO-1/2，構(gòu)建功能回補菌株EC-1/2.PCR驗證顯示(圖2)，以野生型菌株基因組作為模板，利用VdAmy-1基因內(nèi)部引物K7-K8，可成功擴增出0.7 kb的VdAmy-1基因片段.以突變體菌株KO-1/2基因組作為模板，不能擴增出VdAmy-1基因所對應(yīng)的條帶，回補菌株EC-1/2又重新擴增出VdAmy-1基因所對應(yīng)的條帶(圖2).上述結(jié)果說明已經(jīng)成功構(gòu)建了突變體和功能回補菌株.

圖2 大麗輪枝菌突變體菌株(KO-1/2)和功能回補菌株(EC-1/2)的構(gòu)建

2.4 突變體菌株利用淀粉能力減弱

野生型菌株WT和突變體菌株KO-1/2在豐富培養(yǎng)基PDA上均生長良好，可形成大量的白色氣生菌絲，無黑色微菌核生成，并且形成大小相似的菌落.說明VdAmy-1的缺失不影響大麗輪枝菌的基本生長能力(圖3).與之相比，突變體KO-1/2在以淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基上的菌落直徑明顯小于野生型菌株，僅有野生型菌株的52%.功能互補菌株EC-1/2可彌補突變體菌株的上述缺陷(圖3).

圖3 VdAmy-1的缺失減弱菌株利用淀粉能力

以上實驗說明突變體KO-1/2利用淀粉能力明顯減弱，VdAmy-1是大麗輪枝菌重要的淀粉酶.同時，突變體菌株并沒有完全喪失在淀粉培養(yǎng)基上的生長能力，提示大麗輪枝菌中還可能存在其他的淀粉酶編碼基因，它們共同行使利用淀粉的功能.

2.5 突變體菌株致病性下降

致病性實驗表明，接種野生型菌株的棉株表現(xiàn)出典型的葉片萎蔫、褪綠、壞死和植株株高變矮的黃萎病發(fā)病癥狀.與之相比，突變體菌株所侵染的棉苗發(fā)病明顯減輕，僅表現(xiàn)出微弱的黃萎病癥狀.病情指數(shù)統(tǒng)計顯示，突變體菌株造成的致病性僅有野生型菌株的41%.回補菌株所侵染的棉苗的發(fā)病癥狀與野生型相似(圖4).以上結(jié)果說明淀粉酶VdAmy-1是大麗輪枝菌重要的致病因子.推測原因，可能是由于淀粉是病原菌重要的碳源，淀粉利用能力的下降可能造成大麗輪枝菌在寄主中的生長受限，從而使菌株致病性下降.

圖4 VdAmy-1的缺失減弱菌株的致病性

3 結(jié) 論

VdAmy-1基因的缺失不影響大麗輪枝菌的基本生長，但是減弱了其利用淀粉的能力，降低了對寄主棉花的致病性.上述研究表明VdAmy-1是大麗輪枝菌一個重要的分泌型淀粉酶，扮演毒力因子的角色.本研究進一步揭示了大麗輪枝菌如何利用寄主的營養(yǎng)物質(zhì)，為其生物防控提供了理論基礎(chǔ).