表達(dá)2.3.2.1d 分支H5 亞型禽流感病毒HA 基因重組鴨瘟病毒的構(gòu)建和評價

王 波，趙玉博，胡玉珍，丁蕾蕾，陳普成，焦晨晨，姜永萍，陳化蘭，柳金雄

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是負(fù)鏈RNA 病毒，屬正粘病毒科，流感病毒屬。1996 年,我國首次分離到H5N1 亞型高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HPAI）病毒（HPAIV），2003年以來，HPAI 相繼在全球63 個國家發(fā)生，數(shù)億只家禽和野生鳥類因其死亡[1-2]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）數(shù)據(jù)，2003 年～2019 年，全球H5N1 流感感染人860 例，死亡454 例，致死率超過50%。每年全球約29 萬～65 萬人因流感死亡[3]。數(shù)年來的數(shù)據(jù)顯示，流感仍是當(dāng)前家禽養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全的主要威脅之一。

水禽是流感病毒的自然宿主，不同亞型流感病毒均能從水禽中分離獲得[4]。水禽感染大部分AIV后表現(xiàn)出不發(fā)病但向外界排毒的隱性癥狀[5]，這不僅為病毒在其體內(nèi)變異和重配提供了條件，而且還能將病毒傳播至易感的人和動物。因此，阻斷流感病毒在鴨體內(nèi)的傳播是防控流感的關(guān)鍵。鴨瘟（Duck enteritis，DE）、鴨肝炎、禽流感是危害養(yǎng)鴨業(yè)最重要的病毒病，我國每年養(yǎng)鴨量約40 億只，占世界總養(yǎng)殖量70%左右[6]，然而對于鴨上述3 種重要病毒病疫苗的研究卻相較其它家禽滯后。目前，DE和鴨肝炎的預(yù)防主要使用減毒活疫苗，而鴨AI 的預(yù)防與雞相同，均為滅活苗[7]。但由于鴨感染大多數(shù)AIV 呈隱性癥狀，所以養(yǎng)殖戶對鴨的免疫缺乏經(jīng)濟(jì)驅(qū)動力，導(dǎo)致鴨AIV 疫苗免疫覆蓋率較低。本研究構(gòu)建了表達(dá)H5 亞型AIV 血凝素（Hemagglutinin，HA）基因的重組鴨瘟病毒，其可作為防控水禽鴨瘟和水禽流感的二聯(lián)活疫苗候選株，為提高鴨H5 亞型AIV 疫苗免疫覆蓋率提供了新方案，為水禽流感的防控提供了新思路，具有重要的公共衛(wèi)生意義。

本研究以前期構(gòu)建的DEV 疫苗株多片段拯救系統(tǒng)平臺[7-8]，構(gòu)建了表達(dá)近年來我國H5 亞型AIV 優(yōu)勢流行抗原分支（Clade 2.3.2.1d）代表病毒CK/LN/SD007株HA基因的重組病毒，命名為rDEV H5-12，并對其生物學(xué)特性、免疫原性及免疫效力進(jìn)行了系統(tǒng)評價，為水禽流感的防控提供了數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料DEV 疫苗株拯救系統(tǒng)5 粘粒（即pFosT、pFosH、pFosJ、pFosQ、pFosD）、pFosTus78-ccdB K+、pBD-LN/SD007HA 和重組質(zhì)粒pEN?TR-SV40 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；Clade 2.3.2.1d 代表株A/Chicken/Liaoning/SD007/2017（H5N1）（簡稱CK/LN/SD007）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；DEV 疫苗株AV1222 購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；DEV 強(qiáng)毒AV1221 株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC）；9 日齡～10 日齡SPF 雞胚和SPF 鴨購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 主要試劑H5 亞型（CK/LN/SD007）HA 單因子血清由本實(shí)驗(yàn)室制備保存；紅外標(biāo)記驢抗雞IgG 購自LI-COR 公司；FITC 標(biāo)記兔抗雞的IgG 購自Sigma公司；Gateway 試劑盒和ProFection Mammalian Trans?fection System-Calcium Phosphate 購 自Invitrogen 公司；Q5 High-Fidelity DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶Mlu I、Sal I、SbfI-HF 和T4 DNA Ligase 購自NEB公司；EPI300-T1 cells 及fosmid 高拷貝誘導(dǎo)劑購自Epicentre 公 司；Plasmid Midi Kit 購 自Qiagen 公 司；膠回收試劑盒、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、病毒DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 重組粘粒構(gòu)建以重組質(zhì)粒pBD-LN/SD007HA為模板，采用引物5'-CGACGCGTGCCACCATGGAAA AAATAGTT-3'/5'-GCGTCGACTTAAATGCAAATTCTG-3'，PCR 擴(kuò)增HA 基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Mlu I 和Sal I 酶切后克隆至pENTR-SV40 質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pENTR-H5-12，并用PCR 和測序鑒定；按Gateway試劑盒操作方法，將pENTR-H5-12 和粘粒pFosTus78-ccdB K+反應(yīng)，構(gòu)建重組粘粒，采用PCR 和測序?qū)χ亟M粘粒鑒定。

1.4 重組病毒的拯救及遺傳穩(wěn)定性鑒定重組粘粒pFosT-us78H5-12 和pFosD、pFosH、pFosJ、pFosQ經(jīng)Sbf I-HF 酶切處理后，參照磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法將其共轉(zhuǎn)染次代雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），待其出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）時收集細(xì)胞和培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液傳至15代；提取第5、10、15 代培養(yǎng)液和親本DEV 疫苗株的總DNA，利用引物5'-ACGCAAATTATGTCGTTG TT-3'/5'-TTGAGGTTCCGTAGTCTGG-3'進(jìn) 行PCR 鑒定，分析重組病毒拯救情況，將拯救的重組病毒命名為rDEV H5-12；同時將擴(kuò)增產(chǎn)物測序鑒定，分析重組病毒的遺傳穩(wěn)定性。

1.5 重組病毒間接免疫熒光（IFA）和western blot鑒定分別將第15 代重組病毒和親本DEV 疫苗株以MOI 0.01 接種次代CEF，培養(yǎng)24 h～36 h 后，以H5 亞型AIV HA 單因子血清（1∶200）為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗雞IgG（1∶1 000）為二抗，進(jìn)行IFA 鑒定。分別將第5、10、15 代rDEV H5-12 和親本DEV疫苗株以MOI 0.01 接種次代CEF，待CPE 至70%～80%收集細(xì)胞樣品，以H5 亞型AIV HA 單因子血清（1∶400）為一抗，紅外標(biāo)記的驢抗雞抗體（1∶1 000）為二抗，進(jìn)行western blot 鑒定。

1.6 重組病毒生長曲線滴定將第15 代重組病毒和親本DEV 疫苗株分別以MOI 0.01 接種次代CEF，在接種后24 h、48 h、72 h、96 h 收集病毒液，10倍倍比稀釋（10-2～10-9）后，接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板生長良好的次代CEF 中，檢測不同時間點(diǎn)rDEV H5-12 和DEV 疫苗株的TCID50，繪制生長曲線。

1.7 重組病毒免疫效力評價將40 只2 周齡SPF 鴨隨機(jī)分為5 組，8 只/組，按表1 進(jìn)行分組和免疫。A組和B 組免疫2 周后分別利用DEV 強(qiáng)毒（AV1221）和AIV 強(qiáng)毒（CK/LN/SD007）攻擊，即將100 LD50的DEV經(jīng)肌肉注射攻毒，106EID50的AIV 經(jīng)滴鼻攻毒，AIV攻毒試驗(yàn)在生物安全三級實(shí)驗(yàn)室（P3）負(fù)壓隔離器中進(jìn)行。攻毒后，觀察并記錄14 d 內(nèi)鴨子發(fā)病和死亡情況。其中，在AIV 強(qiáng)毒攻擊后第3 d、5 d、7 d 采集喉頭和泄殖腔拭子，接種雞胚進(jìn)行病毒的排毒檢測[8]。C 組自首免后每周采血分離血清，利用血凝抑制（HI）試驗(yàn)進(jìn)行HI 抗體效價檢測。

表1 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計Table 1 The animal experiment design

2 結(jié) 果

2.1 重組粘粒鑒定結(jié)果將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEN?TR-H5-12 與pFosT-us78-ccdB K+作用，構(gòu)建重組粘粒，重組粘粒經(jīng)PCR 和測序鑒定。結(jié)果顯示，重組粘粒經(jīng)PCR 擴(kuò)增獲得4 389 bp 的核酸產(chǎn)物和414 bp的空載體pFosT核酸產(chǎn)物（圖1A）。測序結(jié)果顯示，HA基因無突變。表明構(gòu)建了重組粘粒，命名為pFosTus78H5-12。

2.2 重組病毒遺傳穩(wěn)定性鑒定結(jié)果將pFosTus78H5-12 與DEV 疫苗株拯救系統(tǒng)的其它4 粘粒轉(zhuǎn)染次代CEF，待其出現(xiàn)CPE 后，對培養(yǎng)液傳至15代，分別提取第5、10、15 代培養(yǎng)液和親本DEV 疫苗株總DNA 進(jìn)行PCR 鑒定。結(jié)果顯示，不同代次培養(yǎng)液的PCR 擴(kuò)增均獲得4 389 bp 的核酸產(chǎn)物，親本DEV 疫苗株獲得414 bp 的核酸產(chǎn)物（圖1B）。測序結(jié)果顯示，在DEV 疫苗株基因組中插入的HA 基因無突變。且HA 基因能在DEV 疫苗株基因組中穩(wěn)定存在，表明構(gòu)建了重組病毒，命名為rDEV H5-12。

圖1 重組粘粒（A）和rDEV H5-12遺傳穩(wěn)定性（B）的PCR鑒定結(jié)果Fig. 1 Identification of recombinant cosmid (A) and rDEV H5-12(B) by PCR

2.3 rDEV H5-12 IFA和western blot鑒定結(jié)果rDEV H5-12 和親本DEV 疫苗株接種的次代CEF 經(jīng)IFA 鑒定結(jié)果顯示，在rDEV H5-12接種的CEF中可觀察到綠色熒光，而DEV 疫苗株接種的CEF 中無熒光（圖2）。Western blot鑒定結(jié)果顯示，第5、10、15代rDEV H5-12 接種的CEF 樣品中均檢測到76 ku 左右蛋白條帶，而DEV 疫苗株接種的CEF 樣品中無該條帶（圖3）。表明，HA基因在rDEV H5-12 中能夠正確表達(dá)。

圖2 rDEV H5-12 HA 蛋白表達(dá)的IFA 檢測結(jié)果Fig. 2 Identification of rDEV H5-12 by IFA

2.4 rDEV H5-12 生長曲線測定結(jié)果rDEV H5-12和親本DEV 疫苗株以MOI 0.01 接種次代CEF，接種后每隔24 h 收獲病毒，并檢測其TCID50，繪制生長曲線。結(jié)果顯示，rDEV H5-12 和DEV 疫苗株在CEF中的增殖曲線相似，各時間點(diǎn)的病毒滴度無顯著性差異（圖4）。表明，在CEF 中rDEV H5-12 具有與DEV 疫苗株相同的增殖能力。

圖3 rDEV H5-12 的western blot 鑒 定 結(jié) 果Fig. 3 Identification of rDEV H5-12 by western blot

圖4 rDEV H5-12 和DEV 疫苗株在CEF 中的生長曲線Fig. 4 Growth curves of rDEV H5-12 and DEV vaccine strain in CEF

2.5 rDEV H5-12 免疫效力評價結(jié)果A 組為檢驗(yàn)rDEV H5-12 的免疫效力試驗(yàn)組，分為rDEV H5-12免疫組和PBS 對照組。A 組SPF 鴨免疫兩周后經(jīng)DEV 強(qiáng)毒攻擊，觀察14 d，并記錄發(fā)病死亡情況。結(jié)果顯示，在觀察期內(nèi)，rDEV H5-12 免疫組鴨無發(fā)病、無死亡，對照組鴨在感染DEV 后6 d 內(nèi)全部死亡（圖5A）。表明，rDEV H5-12 免疫SPF 鴨后，能誘導(dǎo)針對DEV 強(qiáng)毒的完全免疫保護(hù)。

B 組為檢驗(yàn)rDEV H5-12 對AIV 攻毒的免疫效力試驗(yàn)組，分為rDEV H5-12 免疫組和PBS 對照組。B組SPF 鴨免疫兩周后經(jīng)AIV 強(qiáng)毒攻擊，觀察14 d，并記錄發(fā)病死亡情況。結(jié)果顯示，在觀察期內(nèi)，rDEV H5-12 免疫組鴨無發(fā)病、無死亡，對照組鴨在感染AIV 強(qiáng)毒后5 d 內(nèi)全部死亡（圖5B）；在攻毒后第3 d、5 d、7 d 采集喉頭和泄殖腔拭子（死亡的SPF鴨不再采集），病毒檢測結(jié)果顯示，rDEV H5-12 免疫組SPF 鴨在攻毒后第3 d、5 d、7 d 采集的喉頭和泄殖腔拭子中均未檢測到病毒，而對照組SPF 鴨采集的喉頭和泄殖腔拭子中均能檢測到較高滴度病毒（圖5C、5D）。表明，rDEV H5-12 免疫SPF 鴨后，能誘導(dǎo)針對CK/LN/SD007（H5N1）的完全免疫保護(hù)。

2.6 rDEV H5-12 免疫鴨后的HI 抗體檢測結(jié)果C組為rDEV H5-12 免疫后HI 抗體檢測組。C 組SPF 鴨于2 周齡時首免，5 周齡時加強(qiáng)免疫，首免后每周收集血清檢測HI 抗體，直至首免后第10 周。結(jié)果顯示，rDEV H5-12 免疫組SPF 鴨在首免后2 周檢測到HI 抗體，加強(qiáng)免疫后1 周達(dá)到高峰（HI 抗體最高達(dá)25），隨后HI 抗體緩慢下降，至加強(qiáng)免疫后第7周，37.5%的鴨HI 抗體仍為陽性（圖6）。表明，rDEV H5-12 免疫SPF 鴨后能夠誘導(dǎo)其產(chǎn)生良好的HI抗體。

圖5 rDEV H5-12 對DEV 和AIV 的 保 護(hù) 效 力Fig.5 Protective efficacy of the rDEV H5-12 against DEV and AIV

圖6 rDEV H5-12 免疫鴨后HI 抗體檢測結(jié)果Fig. 6 Detection of HI antibody titers after twice immunizations in ducks

3 討 論

鴨瘟是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病，其弱毒疫苗自上世紀(jì)60 年代沿用至今，應(yīng)用廣泛，具有良好免疫保護(hù)效果，是理想的重組病毒載體[9-11]。由于AIV 抗原不斷變異，導(dǎo)致防控AI 的疫苗株隨之不斷更新。我國2004 年至今先后研制出H5 亞型重組AIV Re-1～Re-12 株等滅活疫苗。與滅活疫苗相同，AIV 抗原的變異也要求防控AI 的活載體疫苗株不斷更新。由此，本研究室基于前期構(gòu)建的DEV 疫苗株多片段拯救系統(tǒng)平臺，對重組DEV 載體活疫苗種毒進(jìn)行更新。

前期研究在DEV 疫苗株復(fù)制非必需區(qū)（US7～US8 之間）插入HA 基因表達(dá)框構(gòu)建的表達(dá)H5 亞型AIV HA 基因重組DEV 載體活疫苗（rDEVus78HA）能誘導(dǎo)對DEV 強(qiáng)毒和AIV 強(qiáng)毒良好的免疫保護(hù)。隨后，圍繞DEV 疫苗株US7～US8 基因之間表達(dá)外源基因的研究成為熱點(diǎn)，本研究構(gòu)建的rDEV H5-12 也取得良好的免疫保護(hù)效果，以上結(jié)果證明DEV 疫苗株基因組US7～US8 之間是可供外源基因穩(wěn)定表達(dá)的良好位點(diǎn)。近年來，隨著對DEV 基因組研究的深入，一些新的復(fù)制非必需區(qū)相繼被篩選出來，例如趙玉博等鑒定出UL44.5 和UL44 基因間隔區(qū)為DEV基因組復(fù)制非必需區(qū)[12]，胡玉珍等獲得了兩個DEV基因組復(fù)制非必需區(qū)，分別位于US7 基因內(nèi)部、US8 和US1 基因之間[13]。由于DEV 疫苗株存在多個可供外源基因插入的位點(diǎn)，那么我們有理由設(shè)想構(gòu)建重組DEV 多聯(lián)活疫苗，為水禽流感或者其它動物疫病的防控提供新思路。但是，DEV 疫苗株能否同時承載多種外源基因的表達(dá)，外源基因之間是否會相互影響，仍是一個未知但極具實(shí)際意義的研究方向，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。

本研究結(jié)果顯示，在攻毒試驗(yàn)中，rDEV H5-12一次免疫SPF 鴨2 周后，對于DEV 強(qiáng)毒和AIV 強(qiáng)毒的攻擊，免疫組無發(fā)病，無排毒，無死亡，對照組鴨排毒并全部死亡，表明rDEV H5-12 在SPF 鴨中誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可以有效阻止病毒感染宿主細(xì)胞或病毒在體內(nèi)的復(fù)制。另外，本實(shí)驗(yàn)對攻毒前SPF 鴨血清檢測HI 抗體，發(fā)現(xiàn)免疫組SPF 鴨有1 只未檢測到HI 抗體（文中未列出），但是仍然能夠抵御DEV 和AIV 強(qiáng)毒的攻擊，提示rDEV H5-12 不僅能夠誘導(dǎo)SPF 鴨體液免疫應(yīng)答，而且也能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，與之相關(guān)的研究應(yīng)做相應(yīng)跟進(jìn)。在SPF 鴨HI 抗體檢測試驗(yàn)中，rDEV H5-12 免疫SPF 鴨后能夠誘導(dǎo)良好的HI 抗體，表明rDEV H5-12 中的HA 基因在SPF 鴨體內(nèi)正確表達(dá)，其產(chǎn)物HA 蛋白被機(jī)體獲得性免疫系統(tǒng)識別，誘導(dǎo)了體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生了特異性抗體。另外，在10 周的觀察期內(nèi)，有8 周HI 抗體為陽性，表明以DEV 疫苗株為載體構(gòu)建的活疫苗能夠達(dá)到理想的免疫效果，提示以DEV 疫苗株為載體研制其它重要動物疫病疫苗具有可行性。

綜上所述，本研究構(gòu)建了表達(dá)2.3.2.1d 分支H5亞型AIV HA 基因的重組鴨瘟病毒（rDEV H5-12），可作為同時防控鴨瘟和水禽流感的二聯(lián)活疫苗候選株，為DE和水禽AI的免疫防控提供了新途徑。