高 歌孟鳳珍姚艷豐?

(1.中國科學(xué)院武漢病毒研究所,武漢國家生物安全實驗室,武漢 430071;2.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,武漢大學(xué)動物實驗中心,武漢 430071)

艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是全球三大傳染病之一,自發(fā)現(xiàn)以來在全球迅速蔓延,對人類的生命健康造成嚴(yán)重威脅。 世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)2020 年統(tǒng)計的數(shù)據(jù)顯示,全球已有3800 萬人感染了艾滋病病毒(human immunodeficiency virus,HIV),2019 年新增170 萬病例,AIDS 導(dǎo)致的死亡人數(shù)高達(dá) 69萬[1]。 在眾多HIV 相關(guān)研究的動物模型中,非人靈長類動物如恒河猴感染SIV 后出現(xiàn)的臨床癥狀和發(fā)病機(jī)制與人類感染 HIV 相似[2-3]。 因此,SIV 感染非人靈長類動物模型被廣泛應(yīng)用于HIV/AIDS 的研究,并為 WHO 所推薦[4]。 抗 HIV/AIDS 的逆轉(zhuǎn)錄治療的主要靶點(diǎn)是HIV 的逆轉(zhuǎn)錄酶。 為了建立逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑治療的動物模型,研究人員將SIV 的逆轉(zhuǎn)錄酶基因改造為HIV 的逆轉(zhuǎn)錄酶基因,形成基于SIV 骨架,含有HIV 逆轉(zhuǎn)錄酶的SIV-HIV 雜交病毒,即SHIV[5]。 SHIV 感染猴主要用于抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物耐藥性的研究[5]。 近年來,越來越多的研究人員將 SHIV 感染猴模型用于抗 HIV 新藥的研究[6-8]。 檢測感染猴體內(nèi)SIV/SHIV 載量的變化是評價和分析疾病發(fā)展的重要指標(biāo)[9-11]。 因此,建立一種快速,敏感和特異的實驗方法監(jiān)測SIV/SHIV載量十分必要。 基于SIV/SHIV 骨架中重要且高度保守的gag基因作為目標(biāo)檢測對象,本研究利用TaqMan 探針技術(shù)建立了檢測SIV/SHIV 病毒核酸的實時熒光定量法。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

普通級雄性中國恒河猴17 只,體重6 ～8 kg,5歲。 均購于中國科學(xué)院昆明動物研究所[SCXK(滇)K2017-0003]。 無菌手術(shù)在武漢大學(xué)動物實驗中心生物安全三級實驗室進(jìn)行[SYXK(鄂)2019-0013]。 這些動物是按照國際實驗動物護(hù)理評估和認(rèn)證協(xié)會的規(guī)定進(jìn)行護(hù)理。 該研究方案和程序經(jīng)武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物管理與使用委員會批準(zhǔn)(2015024)。 所有的動物組織樣本均保存于武漢大學(xué)動物實驗中心動物生物安全三級實驗室。

1.1.2 毒株

R5 SHIVSF162p3n(由美國 Aaron Diamond 艾滋病研究中心Cecilia Cheng-Mayer 博士惠贈);SHIVKU-1、SIVmac239、SIVmac251、HCV JFH-1(由美國 NIH艾滋病研究項目提供);pCMV ayw HBV(由吉林大學(xué)呂銘宇博士惠贈);EBV(B95-8 毒株)、HSV-1 17syn+以及HSV-2 G 毒株(由中國科學(xué)院武漢病毒研究所胡勤學(xué)博士惠贈)。

1.2 主要試劑與儀器

TIANprep Mini Plasmid Kit 購自北京天根生化科技有限公司;E.Z.N.ATMGel Extraction Kit 購自美國 Omega Bio-Tek 公司;pGEM? -T and pGEM? -T Easy Vector Systems 購自美國 PROMEGA 公司;JM109 購自美國 BioVector NTCC 公司;Taq DNA Polymerase 購 自 TaKaRa 公 司; Ficoll-PaqueTMPREMIUM 購自美國 GE Healthcare 公司;Tri Reagent-LS 購自美國 MRC 公司;AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal kit (50)購自美國Qiagen 公司; M-MLV RT 5X Buffer、 M-MLV Reverse Transcriptase、 Random Hexame primer、 RiboLock RNase inhibitor 購自美國 Thermo 公司;REGULAR AGAROSEG-10 購自西班牙 Biowest 公司。 Real-Time PCR Bio-Rad MyIQTM2 和 PCR Bio-Rad MyCyclerTMthermal cycler 購自美國 Bio-Rad 公司;NANODROP 2000 spectrophotometer 購自美國Thermo 公司。

引物和探針的設(shè)計合成:擴(kuò)增gag基因的引物和探針是參考文獻(xiàn)[12](Forward primer gag: 5’-TGGAGAACAAAGAAGGATGTCAAA-3 ’, Reverse primer gag: 5’-CACCAGATGACGCAGACAGTATTA T-3’;Gag-Probe: FAM-5’-TTGGCACTAATGGAGCT AAGACCGAAAGTATT-3’-BHQ1)由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 RNA 的提取和 cDNA 的合成

按照RNA 提取試劑Tri Reagent-LS 操作步驟從病毒液中提取SHIVSF162p3n病毒的RNA,加入20 μL無 RNA 酶的水溶解,56℃助溶 15 min,然后用NanoDrop 2000 檢測 RNA 的濃度。 將得到的 RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積為20 μL,分別加入 4 μL M-MLV RT 5X Buffer,1 μL dNTPs(5 μmol/L),1 μL Random Hexame primer(5 μmol/L), 0.5 μL RiboLock RNase inhibitor( 1 U), 0.5 μL M-MLV Reverse Transcriptase(10 U),10 μL RNA(1 μg)模板,剩余體積用 Rnase free water 補(bǔ)足到20 μL。 逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序為37℃,60 min;95℃,5 min。

1.3.2 SHIVgag質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

以1.3.1 中得到的病毒cDNA 為模板,使用gag引物,通過普通PCR 進(jìn)行擴(kuò)增。 擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行DNA 凝膠電泳之后用E.Z.N.ATMGel Extraction Kit 進(jìn)行純化和回收,然后利用 pGEM? -T and pGEM? -T Easy Vector Systems 進(jìn)行片段連接和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。 利用藍(lán)白斑篩選白色單克隆菌落加入到含有氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)液中,在37℃恒溫培養(yǎng)振蕩儀中180 r/min 培養(yǎng)過夜。 過夜培養(yǎng)得到的菌液用TIANprep Mini Plasmid Kit 提取質(zhì)粒 DNA,然后測序鑒定。

將測序鑒定正確的質(zhì)粒DNA 用NanoDrop 2000測定濃度,然后用公式計算出DNA 模板濃度:DNA模板濃度(copies/μL)= [質(zhì)粒濃度(ng/μL)×10-9×6.02×1023]/[660 g/mol×堿基對數(shù)目]。

1.3.3 TaqMan 實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

以pGEM? -T-SHIVgag質(zhì)粒作為反應(yīng)模板,同時設(shè)End1/E6E7 細(xì)胞DNA 為陰性對照,無RNA 酶水為空白對照。 通過對PCR 反應(yīng)體系中各種成分(Taq 酶,引物和探針濃度)以及反應(yīng)程序中的相關(guān)條件(退火溫度,循環(huán)數(shù))進(jìn)行一系列的優(yōu)化實驗,通過比較檢測結(jié)果的各相關(guān)系數(shù)(CT 值,標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2等),最終得到該法的最佳檢測條件。

1.3.4 檢測靈敏度的分析及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取 107～101copies/μL 濃度的 pGEM? -T-SHIVgag質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為TaqMan 實時熒光定量PCR 的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行擴(kuò)增,每個濃度做3 個平行,同時設(shè)End1/E6E7 細(xì)胞DNA 陰性對照,無RNA 酶的水空白對照,由定量PCR 儀自動繪制出線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測方法重復(fù)性分析

選擇 R2在 0.997 ～ 1.000 之間的 pGEM? -TSHIVgag質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度樣本作為檢測模板,每個濃度做5 個平行檢測樣本,通過計算Ct 值的變異系數(shù)CV 來評價檢測方法的重復(fù)性。

1.3.6 TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測方法特異性分析

除了檢測SHIVSF162p3n,SHIVKU-1,SIVmac239,SIVmac251 的cDNA 外,還同時檢測了 HCV,EBV,HBV,HSV-1 以及HSV-2 的DNA。 人原代巨噬細(xì)胞DNA 為陰性對照,無RNA 酶水作為空白對照。

1.3.7 TaqMan 實時熒光定量 PCR 檢測方法的應(yīng)用

本研究中使用的動物組織樣本包括SIV 或SHIV 感染猴和健康猴的血漿(plasma)、外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear, PBMC)、淋巴結(jié)(lymph node)[13-14]。 血漿為猴靜脈全血經(jīng)過EDTA抗凝處理后所得,PBMC 為猴靜脈全血經(jīng)過Ficoll-PaqueTMPREMIUM 處理分離所得。 淋巴結(jié)組織樣本為猴安樂死后,直接解剖取材所得。 SIV 感染猴(n= 3)腸系膜 LN,SHIV 感染猴(n= 7)Plasma、PBMC、腋下LN、腹股溝LN、腸系膜LN 和結(jié)腸 LN,健康猴(n=7)Plasma、PBMC、腋下 LN、腹股溝 LN、腸系膜 LN 和結(jié)腸 LN。 使用 AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal kit(美國Qiagen)提取標(biāo)本的DNA和RNA,RNA 按照1.3.1 的操作步驟獲得 cDNA。將cDNA 和DNA 按照1.3.3 中優(yōu)化好的方法進(jìn)行檢測,同時設(shè)人原代巨噬細(xì)胞作為陰性對照和無RNA 酶水空白對照。

注:圖中陰影部分為引物和探針結(jié)合目的片段部位。圖1 重組質(zhì)粒pGEM? -T-SHIV gag 測序鑒定結(jié)果Note.The part of primers and probe combined with targeted fragment was indicated.Figure 1 Identification results of recombinant plasmid pGEM? -T-SHIV gag sequencing

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

普通PCR 擴(kuò)增SHIV cDNA 的片段大小為109 bp,克隆到載體中制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)過氨芐青霉素篩選的陽性單克隆菌株經(jīng)測序鑒定與GeneBank(AY033146.2)中記錄的SHIVgag片段序列一致(圖1)。

2.2 TaqMan 實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系的建立

反應(yīng)結(jié)束后,通過Bio-Rad 軟件系統(tǒng)分析PCR的結(jié)果。 得出最佳反應(yīng)體系見表1,最佳反應(yīng)程序為:95℃,10 min;95℃,15 s,60℃,1 min,55 個循環(huán)。

2.3 靈敏度及定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

將pGEM? -T-SHIVgag質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10 倍倍比稀釋,以 107～101copies/μL 稀釋度作為 PCR擴(kuò)增的模板,如圖2 所示,SHIVgag質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在107～102copies/μL 濃度間標(biāo)準(zhǔn)曲線定量線性關(guān)系很好。 R2=0.998,slope=-3.304。 因此,我們把該法的檢測靈敏度定為102copies/μL。

2.4 TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測方法重復(fù)性分析

以 R2在 0.997～1.000 的 107～102copies/μL 的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板重復(fù)測定5 次,然后計算Ct 值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差s以及變異系數(shù)(表2)。 結(jié)果表明,該檢測方法具有可重復(fù)性。

2.5 TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測方法特異性分析

為了確定該方法的特異性,我們檢測了多個SHIV 和SIV 株以及其它無關(guān)病毒。 如圖3 所示,該法 只 能 擴(kuò) 增 SHIVSF162p3n、 SHIVKU-1、 SIVmac239、SIVmac251 的 cDNA,而對其它病毒(HCVJFH-1、EBV、HBV、HSV-1 17syn+和 HSV-2 G)無擴(kuò)增作用。人原代巨噬細(xì)胞DNA 陰性對照和無RNA 酶的水空白對照均為陰性。

2.6 TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測方法的臨床應(yīng)用

TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測健康猴和感染SIV/SHIV 猴的 Plasma、PBMC、LN,結(jié)果見表3。 結(jié)果顯示,TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測SIV/SHIV感染猴樣本均能檢測到SIV/SHIV 的RNA 和前病毒DNA;檢測健康猴樣本時,所有樣本的檢測結(jié)果都為陰性。

表1 TaqMan 實時熒光定量PCR 的反應(yīng)體系Table 1 Reaction systems of TaqMan real-time FQ-PCR

表2 TaqMan 實時熒光定量PCR 的重復(fù)性實驗Table 2 Repeatability evaluation of TaqMan real-time FQ-PCR

注:A:質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線;B:將107-102copies/μL 10 倍倍比稀釋的pGEM? -T-SHIV gag 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線;標(biāo)準(zhǔn)曲線定量線性方程為Y=-3.304x+41.556,R2=0.998, slope=-3.304。圖2 pGEM? -T-SHIV gag 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增曲線Note.A, Fluorescence quantitative amplification plot of 10-fold serial dilutions standard plasmids.B, Standard curve obtained with 10-fold serial dilutions of the pGEM? -T-SHIV gag plasmids from 107-102 copies/μL, the quantitative equation was Y=-3.304x+41.556,R2=0.998, slop=-3.304.Figure 2 TaqMan real-time FQ-PCR quantitative fluorescence amplification plot and standard curve of pGEM? -T-SHIV gag

表3 TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測猴樣本的結(jié)果Table 3 Results of samples from monkeys detected by TaqMan real-time FQ-PCR

注:SHIV 和 SIV 有特異性擴(kuò)增,HCV JFH-1、EBV、HBV、HSV-1 17syn+以及HSV-2 G Strain 以及人原代巨噬細(xì)胞、無RNA 酶水?dāng)U增結(jié)果都為陰性。圖3 TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測方法特異性分析Note.To analyze the specificity of TaqMan real-time FQ-PCR for detecting SHIV or SIV gagmRNA.Except for the strains of SHIV and SIV, the method could not amplify cDNA or DNA of other viruses.Figure 3 Specific amplification tests of TaqMan real-time FQ-PCR

3 討論

SIV 感染獼猴是目前研究HIV/AIDS 的最佳動物模型[15]。 為了獲得更接近HIV 感染人類的猴動物模型,研究人員構(gòu)建了由HIV 和SIV 嵌合的病毒,被稱為SHIV 病毒,SHIV 能有效地感染獼猴[16],已被廣泛地用于 HIV/AIDS 的研究工作。 由于SHIV 的遺傳基因包括了HIV 的逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列,SHIV 感染的非人靈長類動物模型成為評估抗HIV 藥物和疫苗的重要工具[5]。 SHIV 感染后期,由于病毒繁殖受到免疫抑制,血中病毒量下降。 但仍有部分病毒以前病毒(provirus)DNA 或RNA 分子形式潛伏在感染細(xì)胞中[17-18]。 在SHIV 感染的潛伏期和平臺期,血漿病毒載量降低或消失的情況下,前病毒DNA 載量更能反映感染的狀態(tài),與疾病的發(fā)展密切相關(guān)。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)TaqMan 實時熒光定量PCR 能夠檢測出 SHIV/SIV,而對其它幾種病毒(HCV JFH-1、EBV、HBV、HSV-1 17syn+和HSV-2 G)的擴(kuò)增結(jié)果都為陰性(圖3),說明該方法檢測SHIV/SIV 具有高特異性。 此外,為了能夠定量檢測病毒,我們還構(gòu)建了pGEM? -T-SHIVgag質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,圖2 的結(jié)果顯示,構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品 R2在0.997-1.000 之間,說明該標(biāo)準(zhǔn)品所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。 由表2 中所顯示的各個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過5 次獨(dú)立重復(fù)實驗擴(kuò)增得到的CT 值的變異系數(shù)在0.6%～1.1%之間,說明該方法具有較好的可重復(fù)性。 為了進(jìn)一步評價該方法的特異性和靈敏度,我們使用該方法檢測了SHIV 和SIV感染恒河猴的血漿,外周血單核細(xì)胞以及淋巴結(jié)中病毒RNA 以及前病毒DNA 的水平。 如圖4 所示,所有SIV 或SHIV 感染猴樣本的結(jié)果都為陽性,而健康猴樣本的結(jié)果均為陰性,說明該方法能夠特異性檢測出SHIV/SIV 感染猴不同組織中的病毒RNA以及前病毒DNA。

傳統(tǒng)的熒光定量PCR 檢測方法是利用熒光染料與雙鏈DNA 結(jié)合之后發(fā)出熒光信號,通過檢測該熒光信號進(jìn)行定量檢測。 而本研究采用的TaqMan探針實時熒光定量PCR 檢測的是積累熒光,由于增加了探針的識別步驟,PCR 檢測的特異性比傳統(tǒng)的熒光定量 PCR 更高[19]。 雖然已有研究運(yùn)用TaqMan 探針的方法檢測猴艾滋病毒[20],但本研究構(gòu)建的檢測方法靈敏度更高,并同時檢測了SHIV和SIV 不同毒株的病毒核酸,在特異性評價實驗中同時檢測了多種RNA 病毒和DNA 病毒核酸,且在實際應(yīng)用評價中檢測了多種猴組織樣本(血漿,PBMC 以及淋巴結(jié))中的病毒RNA 和前病毒DNA。

本研究構(gòu)建的TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測法的靈敏度為102copies/μL(圖2)。 如果樣本的病毒量少于102copies/μL,需重復(fù)檢測避免漏診,必要時還應(yīng)動態(tài)地檢測動物血漿病毒載量的變化。 本法的特異性高,除了能特異性地診斷是否有SIV/SHIV 感染外,還能定量檢測SIV/SHIV 的RNA 和前病毒DNA 的水平。 因此,該法具有特異、敏感和快速的優(yōu)點(diǎn),適用于 SIV/SHIV 感染猴模型的動物研究。