椎間盤退變動(dòng)物模型的研究進(jìn)展*

張欣怡 楊艷妮 姬笑顏 李含笑 劉西紡,2

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院研究生院，咸陽 712046)(2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會(huì)醫(yī)院神經(jīng)脊柱病區(qū)，西安 710054)

頸肩腰腿痛是常見的肌肉骨骼系統(tǒng)病痛，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來一定的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。其預(yù)防、發(fā)病機(jī)制及治療一直是公共衛(wèi)生領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。雖然多種因素均可引起頸肩腰腿痛的發(fā)生，但椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)是其發(fā)病的主要原因之一[1]。椎間盤是人體最大的無血管結(jié)構(gòu)，由髓核、纖維環(huán)和軟骨終板構(gòu)成，為脊柱的運(yùn)動(dòng)和負(fù)荷提供結(jié)構(gòu)支撐。椎間盤退變的原因復(fù)雜多樣，主要包括衰老、機(jī)械壓力、吸煙、肥胖、感染、創(chuàng)傷、遺傳等。退變的椎間盤表現(xiàn)出椎間高度的降低、纖維環(huán)出現(xiàn)裂隙或斷裂、髓核膠原蛋白和水分的丟失、椎體終板的鈣化等結(jié)構(gòu)的改變，繼而出現(xiàn)膨出、突出、脫垂等病理變化，在相應(yīng)部位出現(xiàn)頸肩部疼痛、腰腿痛等臨床表現(xiàn)。利用椎間盤退變動(dòng)物模型可以經(jīng)濟(jì)有效地進(jìn)行病因病機(jī)和治療方法的研究。因此，建立操作簡便、可控性強(qiáng)、符合人類解剖及生理特征且能再現(xiàn)椎間盤退變的客觀規(guī)律的動(dòng)物模型有助于開展醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)目前主要的椎間盤退變模型進(jìn)行分類歸納及總結(jié)，以期為研究者選取椎間盤退變動(dòng)物模型提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

模型動(dòng)物的選擇直接影響動(dòng)物模型的構(gòu)建效果，因此模型動(dòng)物的選擇具有十分重要的意義。動(dòng)物模型的制備對(duì)于了解疾病的產(chǎn)生機(jī)制及作用過程具有相當(dāng)重要的作用。這就要求動(dòng)物模型必須是合乎倫理的、可控制的、具有重復(fù)性和成本效益，并且能夠充分模擬正在研究的人類病理過程[2]。椎間盤退變動(dòng)物模型應(yīng)能夠再現(xiàn)椎間盤退變的客觀規(guī)律，截至目前用于構(gòu)建椎間盤退變的動(dòng)物有10多種，主要包括鼠、兔、羊、犬、豬、猴、狒狒等。由于鼠和兔來源充足、易于飼養(yǎng)、品種純正、實(shí)驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，是椎間盤退變模型的首選動(dòng)物，但其脊柱構(gòu)造及生物力學(xué)特性與人類有一定的差異。其中由于小鼠體型小，生命力較弱，對(duì)手術(shù)的耐受性差，在模型制作過程中死亡率也較高。因此，鼠和兔作為椎間盤退變的模型動(dòng)物也具有一定的局限性。羊、豬、犬等大型哺乳動(dòng)物的椎間盤與人類椎間盤在大小上合適，但其為四足動(dòng)物，椎間盤受力與人類不一致而無法體現(xiàn)力學(xué)因素在椎間盤退變過程中的重要作用，雖然有研究者采用人為辦法迫使其直立行走，但由于經(jīng)濟(jì)成本高、技術(shù)要求嚴(yán)格、飼養(yǎng)不便等缺點(diǎn)，未在椎間盤退變動(dòng)物模型構(gòu)建過程中大量使用。靈長類動(dòng)物是人類椎間盤退變研究最理想的選擇，其與人類一樣都是雙足直立行走，椎間盤結(jié)構(gòu)及受力環(huán)境與人類高度相似，但由于價(jià)格昂貴及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理道德等因素限制，無法得到廣泛應(yīng)用。不同的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目有不同的目的和要求，因而每項(xiàng)研究都應(yīng)該選擇最合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，從而以最小的代價(jià)獲得最好的結(jié)果。每種動(dòng)物有不同的生理特點(diǎn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)條件及經(jīng)費(fèi)預(yù)算等進(jìn)行模型動(dòng)物的選擇。

2 模型建立的方法

2.1 誘發(fā)性椎間盤退變動(dòng)物模型

2.1.1結(jié)構(gòu)損傷模型

2.1.1.1 機(jī)械損傷模型：機(jī)械損傷主要通過外科手術(shù)干擾髓核、纖維環(huán)及軟骨終板引起椎間盤的退變。其中細(xì)針穿刺法因操作簡便、造模結(jié)果可靠、椎間盤退變程度易于控制而得到廣泛的應(yīng)用。Kim等[3]使用18G、21G和23G三種不同型號(hào)的穿刺針在透視引導(dǎo)下行兔L3～L4、L4～L5及L5～L6椎間盤纖維環(huán)穿刺結(jié)合髓核抽吸發(fā)現(xiàn)，21G穿刺技術(shù)在較短的時(shí)間內(nèi)造成椎間盤退變的效果更好。Glaeser等[4]在大鼠椎間盤退變模型的優(yōu)化研究中也發(fā)現(xiàn)21G穿刺技術(shù)致椎間盤退變的效果及可重復(fù)性均較好。損傷髓核與纖維環(huán)致退行性變發(fā)展緩慢便于觀察及干預(yù), 其穿刺針的型號(hào)、進(jìn)針的深度需要進(jìn)行精確計(jì)算，其最大的缺點(diǎn)是髓核組織丟失導(dǎo)致發(fā)生退行性變的過程與自然退行性變有較大的差別，不能全面反映椎間盤退行性變機(jī)制[5]。Vadala等[6]通過對(duì)12只成年綿羊經(jīng)椎弓根入路，從終板向髓核鉆2 mm的通道，進(jìn)行部分髓核切除術(shù)，建立了一個(gè)纖維環(huán)完整的椎間盤逐步退變的動(dòng)物模型，可用于研究髓核再生及早期輕度椎間盤退變的再生修復(fù)。軟骨終板是椎間盤獲取營養(yǎng)物質(zhì)的主要通道，軟骨終板的損傷也會(huì)引起椎間盤的退變。無水乙醇是微循環(huán)破壞試劑，具有去血管化作用，終板下注射可阻礙椎體-終板營養(yǎng)[7]。白榮飛等[8]通過針刺纖維環(huán)、終板注射無水乙醇及針刺聯(lián)合終板注射三種方法建立大鼠椎間盤退變模型，從椎間盤相對(duì)高度、椎間盤組織病理學(xué)檢查及免疫組織化學(xué)染色評(píng)價(jià)椎間盤退變，發(fā)現(xiàn)終板注射法較針刺纖維環(huán)法更早引起退變，12周后兩種造模方法無顯著差異，而聯(lián)合組則可明顯加快并加重椎間盤的退變并有效縮短實(shí)驗(yàn)周期。

2.1.1.2 化學(xué)損傷模型：化學(xué)損傷法是將一些化學(xué)物質(zhì)注入椎間盤，引起髓核和纖維環(huán)的損傷或變性，從而達(dá)到椎間盤退變的目的。Lotz[9]向鼠椎間盤髓核內(nèi)注射木瓜凝乳蛋白，3周后發(fā)現(xiàn)椎間隙變窄、磁共振T2加權(quán)像信號(hào)強(qiáng)度降低，提示椎間盤發(fā)生退變。Muramatsu等[10]將糖胺聚糖降解酶——condoliase注射入食蟹猴椎間盤中，引起了髓核、纖維環(huán)、軟骨終板和骨骺生長板的退變和壞死；骨骺生長板灶性消失以及軟骨終板的新生血管化和骨化，與木瓜凝乳蛋白酶引起的變化在性質(zhì)上相似，但范圍更加廣泛。Hoogendoorn等[11]向羊椎間盤內(nèi)注射0.25 U/mL軟骨素酶ABC致髓核蛋白多糖裂解，且羊椎間盤內(nèi)缺乏脊索細(xì)胞，與人類椎間盤相似，在18周內(nèi)成功建立了一種緩慢的、可重復(fù)性的且與人類椎間盤退變相似性極強(qiáng)的椎間盤退變模型。Liu等[12]利用微創(chuàng)微量注射技術(shù)將FN-f注射到兔椎間盤中，通過上調(diào)MMPs、iNOS及TNF-1導(dǎo)致軟骨損傷，在4周時(shí)開始出現(xiàn)早期退變，后期髓核被纖維組織完全替代，成功建立了重復(fù)性好、操作簡便且性價(jià)比高的椎間盤退變模型。Wei等[13-14]將博來霉素經(jīng)皮注射到恒河猴鄰近椎間盤的軟骨下或在CT引導(dǎo)下將平陽霉素注射到兔腰椎間盤鄰近的軟骨下骨中,采用影像學(xué)、組織化學(xué)和分子生物學(xué)等方法評(píng)估椎間盤退變，成功誘導(dǎo)與人類椎間盤退變相似的缺血性慢進(jìn)性椎間盤退變模型。

2.1.2力學(xué)改變模型

2.1.2.1 應(yīng)力改變模型：生物力學(xué)在椎間盤退變過程中具有重要作用。在生理情況下椎間盤承受身體的垂直靜壓力及在運(yùn)動(dòng)過程中的水平剪切力，維持椎間隙高度使相鄰兩椎體的活動(dòng)度在正常范圍內(nèi)。異常的力學(xué)會(huì)導(dǎo)致椎間盤內(nèi)反常的力分布和滲透壓平衡的破壞，被認(rèn)為是椎間盤退變的重要發(fā)病因素[15]。Lao等[16]發(fā)現(xiàn)小鼠在用下肢站立和跳躍時(shí)的運(yùn)動(dòng)模式與人類相似，采用自制熱板籠提供脊柱軸向生物力學(xué)載荷，隨著時(shí)間的延長和生物力學(xué)載荷的增加，纖維環(huán)處裂隙逐漸增大，椎間盤和軟骨終板高度均降低，細(xì)胞外基質(zhì)成分改變，形成退變模型。Ao等[17]是利用小鼠的恐水性，在有限的含水空間內(nèi)誘導(dǎo)小鼠主動(dòng)采取兩足站立姿勢，10周后椎間盤退變嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為纖維環(huán)和關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)的退變，成功建立了一種無創(chuàng)的、有效的與人類相似的椎間盤退變小鼠模型。Wang等[18]通過椎弓根螺釘和棒植入固定羊L3～L4椎間盤，保持椎間盤完整、軟骨終板未被破壞，導(dǎo)致其椎間盤負(fù)荷環(huán)境發(fā)生變化，從而誘導(dǎo)椎間盤的退變。Xia等[19]在大鼠尾椎中經(jīng)皮插入兩根克氏針，使尾椎彎曲而施以靜態(tài)壓縮載荷，他們發(fā)現(xiàn)隨著負(fù)荷量的增加，靜態(tài)壓迫導(dǎo)致MRI T2加權(quán)像上細(xì)胞核強(qiáng)度進(jìn)行性降低，聚集素和Ⅱ型膠原表達(dá)減少，MMP-3和MMP-13表達(dá)增加，組織形態(tài)發(fā)生變性，形成了退變模型。

2.1.2.2 脊柱失穩(wěn)模型：此類模型是通過破壞椎間盤周圍結(jié)構(gòu)，打破脊柱的動(dòng)靜態(tài)平衡，使脊柱過度運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生脊柱不穩(wěn)。付方達(dá)等[20]通過手術(shù)去除小鼠棘上和棘間韌帶致其脊柱軸線力學(xué)失穩(wěn)來誘導(dǎo)構(gòu)建椎間盤退變模型，術(shù)后4周見椎間盤高度明顯下降、纖維環(huán)排列紊亂、MMP-13表達(dá)增加等，出現(xiàn)椎間盤退變特征，成功建立椎間盤退變小鼠模型。Fukui等[21]通過完全切除L4～L5雙側(cè)小關(guān)節(jié)，術(shù)后7周發(fā)現(xiàn)L4～L5節(jié)段椎間盤高度增加，終板不規(guī)則，相鄰節(jié)段椎間盤高度降低，組織學(xué)評(píng)分高于對(duì)照組，出現(xiàn)椎間盤退變征象。

2.1.3基因敲除模型:近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，基因?qū)ψ甸g盤的重要作用可以從各種轉(zhuǎn)基因鼠中得到證實(shí)，為椎間盤退變提供了新的選擇。有研究[22-23]描述了一種SPARC基因缺失小鼠，早在3個(gè)月大的時(shí)候就出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)引起的不適跡象及下背部和后掌對(duì)冷刺激的超敏反應(yīng)，且椎間盤退變程度隨著年齡的增長而發(fā)展，可作為椎間盤退變所致慢性疼痛的重要?jiǎng)游锬Ｐ?。Lin等[24]研究發(fā)現(xiàn)一種肌腱/韌帶特異性標(biāo)志物和抗血管生成因子——Tnmd基因敲除小鼠，早在6月齡時(shí)出現(xiàn)椎間盤退變征象，同時(shí)報(bào)道了Tnmd和Chm1雙基因敲除小鼠不僅表現(xiàn)出加速的椎間盤退變,而且還表現(xiàn)出椎間盤的異位成骨。Wu等[25]研究HIF-1a基因在小鼠椎間盤退變中的作用，結(jié)果顯示基因敲除組小鼠椎骨內(nèi)糖胺聚糖減少及Ⅱ型膠原蛋白減少和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)減少。特定基因敲除模型證明了遺傳或基因因素是導(dǎo)致椎間盤退變的因素之一，但其只強(qiáng)調(diào)了某個(gè)單一基因的作用，且其技術(shù)難度較高、操作復(fù)雜、可重復(fù)性不佳及模型受限，所以該領(lǐng)域研究相對(duì)較少。

2.1.4缺血模型:椎間盤無血管結(jié)構(gòu)，是從相鄰椎體的血管網(wǎng)絡(luò)接受其營養(yǎng)物質(zhì)及進(jìn)行代謝物質(zhì)的交換，骨性終板為營養(yǎng)物質(zhì)向椎間盤的輸送提供了主要途徑[26-27]。之前有研究在犬模型中，用骨水泥堵塞終板營養(yǎng)通路長達(dá)70周，并且沒有發(fā)現(xiàn)椎間盤產(chǎn)生明顯的退變[28]。Kang等[29]證明在幼豬模型中，通過骨水泥干預(yù)阻斷雙側(cè)終板通路3個(gè)月后引起椎間盤退變，但其阻斷終板營養(yǎng)通路對(duì)椎間盤退變的影響尚不清楚，也存在爭議?，F(xiàn)有研究者[30-31]向山羊的兩個(gè)腰椎間盤(L2～L3和L3～L4)注射骨水泥阻斷雙側(cè)終板營養(yǎng)通路，干預(yù)48周后，椎間盤出現(xiàn)嚴(yán)重退變，建立了骨水泥注射阻斷雙終板營養(yǎng)通路的成熟山羊模型。雖然缺血性干預(yù)措施的長期作用還有待觀察，但它提示了營養(yǎng)障礙在椎間盤退變中起作用的重要信息。此外，缺血模型對(duì)于評(píng)估新的椎間盤退變和修復(fù)的生物學(xué)干預(yù)措施也有重要意義。

2.1.5其他模型:吸煙被認(rèn)為是椎間盤退變的主要危險(xiǎn)因素之一[32-33]。Iwahashi等[34]將稀釋后的尼古丁溶液注射到兔皮下8周后發(fā)現(xiàn)，髓核細(xì)胞破壞、纖維環(huán)紊亂及蛋白多糖的合成減少，提示尼古丁毒性導(dǎo)致了椎間盤的退變。吳磊磊等[35]通過對(duì)大鼠皮下注射尼古丁，5周后同樣發(fā)現(xiàn)椎間盤退變的征象，并且指出尼古丁加速椎間盤退變的機(jī)制可能與抑制AQP1及AQP3表達(dá)有關(guān)。Fields等[36]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠出現(xiàn)了椎間盤軟骨終板細(xì)胞代謝障礙、骨化和生物力學(xué)行為變化等退變征象。

2.2 自發(fā)性椎間盤退變動(dòng)物模型

Silberberg等[37]首先發(fā)現(xiàn)了與人類椎間盤退變相似的地中海沙鼠椎間盤的變化，認(rèn)為沙鼠高鹽少水的飲食引起代謝產(chǎn)生一定的變化，從而引起椎間盤的退變尤其是髓核功能的異常。沙鼠椎間盤退變發(fā)生早、發(fā)生率高且有一定的遺傳傾向。自發(fā)性椎間盤退變模型與年齡有一定的關(guān)系，Ohnishi等[38]通過Pfirrmann分級(jí)、MRI成像和椎間盤組織學(xué)評(píng)分發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠在14月齡時(shí)開始出現(xiàn)輕度椎間盤退變，22月齡時(shí)退變程度達(dá)到中重度。Vincent等[39]也發(fā)現(xiàn)與3月齡和12月齡的小鼠相比，24月齡的小鼠表現(xiàn)出典型的椎間盤退變。Choi等[40]首次報(bào)道了SM/J小鼠，在椎間盤退變自發(fā)性SM/J小鼠中，髓核細(xì)胞減少、基質(zhì)成分改變、椎間盤高度降低、椎體骨質(zhì)量差等，概括了人類椎間盤退變的許多顯著特征，是一種新的椎間盤退變小動(dòng)物模型。此類模型在一定程度上減少了人為因素的影響，但其退變?cè)蚣爸虏C(jī)理尚不清楚，在作為動(dòng)物模型的應(yīng)用中受到了限制。

3 小結(jié)與展望

椎間盤退變是頸肩腰腿痛的病理基礎(chǔ)，椎間盤退變性疾病可以歸入中醫(yī)“痹癥”范疇。由椎間盤退變引起的頸肩腰腿痛，肝和腎與其有較為密切的關(guān)系，肝主筋、腎主骨且精血同源，肝腎虧損是椎間盤退變的病機(jī)之一。椎間盤退變模型研究發(fā)展迅速，但鑒于人類椎間盤退變是隨著年齡增長而發(fā)生的復(fù)雜性退行性變化，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與臨床中人的椎間盤退變有很大差異。目前尚沒有一種模型可以完全復(fù)制人類椎間盤退變，每一種椎間盤退變模型都有其局限性。

在現(xiàn)有研究中，椎間盤結(jié)構(gòu)損傷模型最為常見，其中細(xì)針穿刺法因操作易行、重復(fù)性好及造模時(shí)間相對(duì)較短等優(yōu)點(diǎn)，成為研究椎間盤退變的常用手段，但其模型不適用于早期干預(yù)研究。自發(fā)性椎間盤退變模型因與人類椎間盤退變相似度較高，是研究人類椎間盤退變的有利選擇，但由于動(dòng)物物種和數(shù)量的限制，其使用并不廣泛。雖然每一種動(dòng)物模型都有其局限性，但根據(jù)不同的研究需求我們可以選擇更具優(yōu)勢的動(dòng)物模型。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展及研究者們對(duì)椎間盤退變的不斷深入了解與探索，對(duì)椎間盤退變的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究不僅限于西醫(yī)以“病”來建立模型，還可以根據(jù)中醫(yī)不同的證型來建立模型，相信一定會(huì)構(gòu)建出一種比較規(guī)范且與人類椎間盤退變相似的理想椎間盤退變動(dòng)物模型，以期為臨床預(yù)防和治療人類椎間盤退變提供堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。