焦 磊,宮熳鈺,張 瑩

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室,黑龍江 哈爾濱 150000)

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200 bp、不具有編碼成熟蛋白質(zhì)能力的RNA分子[1]。近年來(lái)，大量研究顯示[2-3],lncRNA參與腫瘤、糖尿病、心血管疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中。鋅脂蛋白編碼基因Znfx1(zinc finger，NFX1-type containing 1)的反義鏈即鋅脂蛋白反義鏈1(zinc finger antisense 1，lncRNA-ZFAS1)，是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA。最初，lncRNA-ZFAS1被發(fā)現(xiàn)對(duì)乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤具有調(diào)控作用[4-5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-ZFAS1對(duì)心血管系統(tǒng)具有調(diào)控作用。lncRNA-ZFAS1是急性心肌梗死的外周血潛在診斷標(biāo)志物[6]。深入機(jī)制研究我們發(fā)現(xiàn)，lncRNA-ZFAS1是肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase 2a，SERCA2a)的內(nèi)源性抑制劑，誘發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而引起心肌梗死后心臟收縮舒張功能障礙[7]。此外，我們還揭示心肌梗死后心肌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-ZFAS1的高表達(dá)會(huì)引發(fā)心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體凋亡途徑激活，從而誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡[8]。

心肌纖維化(cardiac fibrosis，CF)常常伴隨病理性心肌肥厚、心肌梗死及心力衰竭等多種心血管疾病發(fā)生。心肌纖維化一旦發(fā)生難于逆轉(zhuǎn)[9-10]。目前，臨床上針對(duì)心肌纖維化的特異性治療手段相對(duì)缺乏，是該領(lǐng)域的瓶頸問(wèn)題。因此，探索心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制，發(fā)現(xiàn)心肌纖維化的新靶點(diǎn)，并針對(duì)分子水平的新靶點(diǎn)提出有效的防治措施，具有重要的意義。本研究通過(guò)構(gòu)建在體和離體心肌纖維化模型以及過(guò)表達(dá)lncRNA-ZFAS1轉(zhuǎn)基因小鼠，探究lncRNA-ZFAS1對(duì)小鼠心肌纖維化的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑阿佛丁(Avertin)購(gòu)買(mǎi)自Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)為T(mén)48402；lncRNA-ZFAS1的siRNA(siZFAS1)：sense 5′-GCGUGAACUCCUGAGGCGAdTdT-3′和antisense 5′-UCGCCUCAGGAGUUCACGCdTdT-3′購(gòu)買(mǎi)自廣州市銳博生物科技有限公司；血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)購(gòu)買(mǎi)自Sigma公司，貨號(hào)a9525。MTT試劑購(gòu)買(mǎi)自Sigma公司貨號(hào)為M2128-100MG，引物購(gòu)買(mǎi)自生工生物工程(上海)股份有限公司，引物序列如下表所示。TRIzol試劑購(gòu)買(mǎi)自Invitrogen公司，貨號(hào)為15596026；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit購(gòu)買(mǎi)自TOYOBO公司，貨號(hào)為fsq-101；Power SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)買(mǎi)自Applied Biosystems公司，貨號(hào)為4364344。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMΑ)抗體購(gòu)買(mǎi)自Abcam公司，貨號(hào)為ab7817。

Forward primer (5′-3′)LReverse primer (5′-3′)ZFAS1AGCGTTTGCTTTGTTCCCCTCCCTCGATGCCCTTCTCo1a1AAGAAGACATCCCTGAAGTCATTGTGGCAGATACAGATCAAGCo3a1TTGGGATGCAGCCACCTTGCGCAAAGGACAGATCCTGAGTGFβ1GTGTGGAGCAACATGTGGAACTCTATTGGTTCAGCCACTGCCGTAβ-actinACTGCCGCATCCTCTTCCTTCAACGTCACACTTCATGATGGA

1.2 儀器低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；超純水系統(tǒng)(美國(guó)Milipore公司)；酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；Nano Drop 8000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Forma公司)；逆轉(zhuǎn)錄儀(美國(guó)Thermo Forma公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；小動(dòng)物呼吸機(jī)(UGO BASILE)；Odyssey紅外熒光掃描系統(tǒng)(LI-COR)。

1.3 動(dòng)物健康清潔級(jí)C57BL/6雄性小鼠，8周齡，體質(zhì)量(25-28) g，購(gòu)買(mǎi)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司(NO.SCXK(遼)2020-0001)。LncRNA-ZFAS1轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)在C57BL/6小鼠染色體中條件性敲入小鼠ZFAS1基因，將穩(wěn)定遺傳的ZFAS1敲入小鼠與工具小鼠(αMHC-Cre)雜交，最終獲得心臟特異性過(guò)表達(dá)lncRNA-ZFAS1的轉(zhuǎn)基因小鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用均符合哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.4 方法

1.4.1建立小鼠心肌梗死(MI)模型 C57BL/6小鼠腹腔注射麻醉劑2%阿佛丁溶液(0.01 mL·g-1)后，固定，氣管插管呼吸機(jī)，連接心電圖裝置，待呼吸穩(wěn)定后，打開(kāi)胸腔，撕開(kāi)心包膜，以7/0帶針縫合線(xiàn)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，待心尖變白，心電圖(ECG)顯示ST段明顯太高，表明心肌梗死模型建立成功。假手術(shù)組(Sham)不結(jié)扎，其他操作與實(shí)驗(yàn)組相同。關(guān)閉胸腔，縫合傷口，繼續(xù)飼養(yǎng)4周后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2Masson染色 取心肌梗死模型小鼠心臟梗死邊緣區(qū)組織塊，Sham組小鼠、lncRNA-ZFAS1轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠左心室心臟組織塊，置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，石蠟包埋、切片，依次將石蠟切片放入二甲苯Ⅰ20 min→二甲苯Ⅱ20 min→無(wú)水乙醇Ⅰ5 min→無(wú)水乙醇Ⅱ5 min→75%乙醇5 min梯度脫水→水洗，蘇木精液染核5-10 min。用Masson麗春紅酸性復(fù)紅液5-10 min，2%冰醋酸水溶液浸洗，1%磷鉬酸水溶液分化3-5 min，光綠液染5 min，0.2%冰醋酸水溶液浸洗，95%酒精、無(wú)水酒精、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固。

1.4.3原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 取1-3 d內(nèi)新生C57BL/6乳鼠，75%的乙醇中消毒，采用斷頭法處死乳鼠后，取出心臟，剪碎心臟組織，加入胰蛋白酶消化心臟組織，用含有10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基終止消化，待所有組織塊消化完畢后，1 500 r·min-1條件下離心5 min，棄去上清，用含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液均勻鋪到六孔板中，37 ℃孵箱中培養(yǎng)1.5 h后，成纖維細(xì)胞貼壁，棄掉懸液，加入適量的含血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。

1.4.4細(xì)胞加藥與轉(zhuǎn)染 原代培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞貼壁后，細(xì)胞密度達(dá)70%-90%時(shí)進(jìn)行加藥和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、加藥Ang Ⅱ組(終濃度為100 nmol·L-1)、加藥Ang Ⅱ后轉(zhuǎn)染siZFAS1(終濃度為100 nmol·L-1)組，加藥Ang Ⅱ后轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siNC(終濃度為100 nmol·L-1)組，加藥和轉(zhuǎn)染48-72 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.5MTT 將加藥Ang Ⅱ組和對(duì)照組心肌成纖維細(xì)胞中加入MTT溶液(0.5 mg·L-1，20 μL)，在37℃孵箱中孵育4 h后，棄去液體，每孔加入200 μL DMSO，將96孔板平放在水平搖床上10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)在490 nm的吸光度值。

1.4.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 取心臟組織樣本或心肌成纖維細(xì)胞，以TRIzol法提取RNA，利用Nano Drop 8 000分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，按照ReverTra Ace qPCR RT Kit 試劑盒的方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。配置SYBR Green法PCR反應(yīng)體系，包括SYBR Green(10 μL)，F(xiàn)orward Primer(1 μL)，Reverse Primer(1 μL)，cDNA (1 μL)，Nuclease-Free Water(1 μL)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃進(jìn)行10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)進(jìn)行40次。采用ΔΔCt法分析Ct值，以2-ΔΔCt表示目的基因的表達(dá)量。

1.4.7Western blot 取心肌組織適量，加入200 μL蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑)，待心臟組織裂解充分后，12 000 r·min-1，4 ℃離心15 min，取上清液，利用BCA法測(cè)定蛋白濃度。采用SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳分離蛋白分子，基層膠：70 V，恒壓30 min，待Marker各條帶均分開(kāi)后調(diào)電壓。分離膠：110 V，待目的條帶遷移到合適位置時(shí)停止電泳進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜，冰浴300 mA恒流轉(zhuǎn)膜50 min。將轉(zhuǎn)膜完成的NC膜置于5%脫脂牛奶中，水平搖床室溫封閉2 h。將封閉好的NC膜于PBS中清洗放入稀釋好的一抗中4 ℃搖床過(guò)夜。次日將完成一抗孵育的NC膜用PBST清洗3次。于室溫避光孵育熒光二抗50 min，孵育結(jié)束后NC膜用PBST避光清洗3次。利用Odessey紅外成像掃描儀在紅外熒光掃描系統(tǒng)下掃描觀察NC膜，通過(guò)配套軟件分析蛋白條帶光密度值。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA-ZFAS1在心肌纖維化模型小鼠心臟組織中的表達(dá)情況小鼠心肌梗死模型建立4周后，取材心臟組織進(jìn)行Masson染色，結(jié)果顯示，MI組小鼠心臟組織中膠原沉積顯著高于假手術(shù)組(Sham)，表明在體心肌纖維化模型建立成功。取心臟組織進(jìn)行qRT-PCR，結(jié)果顯示，心肌纖維化模型小鼠心臟組織中l(wèi)ncRNA-ZFAS1的表達(dá)顯著升高(Fig 1B，P<0.05)。這表明lncRNA-ZFAS1對(duì)心肌纖維化具有潛在調(diào)控作用。

Fig 1 Expression of lncRNA-ZFAS1 in cardiac tissues of mice with myocardial fibrosis

2.2 轉(zhuǎn)染敲減lncRNA-ZFAS1的siRNA對(duì)心肌纖維化的影響為進(jìn)一步探究lncRNA-ZFAS1對(duì)心肌纖維化的調(diào)控作用，我們構(gòu)建了離體水平心肌纖維化模型。Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中，細(xì)胞增殖顯著增加(Fig 2A，P<0.01)；lncRNA-ZFAS1的表達(dá)顯著升高(Fig 2B，P<0.05)。為進(jìn)一步探究lncRNA-ZFAS1對(duì)心肌纖維化的影響，我們構(gòu)建了敲減lncRNA-ZFAS1的siRNA(siZFAS1)。Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了siZFAS1后，lncRNA-ZFAS1的表達(dá)明顯降低。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta-1，TGFβ1)和Ⅲ型膠原(collagen type III alpha 1 chain，Col3a1)是表征心肌纖維化的標(biāo)志性蛋白。Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中TGFβ1和Col3a1 的表達(dá)顯著升高，敲減lncRNA-ZFAS1后，可以顯著降低兩者的表達(dá)(Fig 2B，P<0.05)。以上結(jié)果表明，敲減lncRNA-ZFAS1可以抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化。

Fig 2 Effect of knock down lncRNA-ZFAS1 on myocardial fibrosis

2.3 過(guò)表達(dá)lncRNA-ZFAS1轉(zhuǎn)基因小鼠的心肌纖維化情況為進(jìn)一步探討lncRNA-ZFAS1對(duì)心肌纖維化的影響，我們構(gòu)建了心臟特異性過(guò)表達(dá)lncRNA-ZFAS1的轉(zhuǎn)基因小鼠。如Fig 3A的Masson染色結(jié)果所示，成年lncRNA-ZFAS1轉(zhuǎn)基因小鼠(transgenic mice，TG)心臟組織中膠原沉積比野生型小鼠(wild type mice，WT)明顯增加。此外，TG組心臟組織中α-SMA的表達(dá)顯著高于WT組(Fig 3B，P<0.01)。并且與WT組相比，TG組Ⅰ型膠原(Col1a1)和Col3a1的表達(dá)顯著升高(Fig 3C，P<0.05)。這表明lncRNA-ZFAS1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)了心肌纖維化。

3 討論

lncRNA-ZFAS1作為長(zhǎng)鏈非編碼RNA家族中的一員，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，并且其在人和小鼠中具有約70%的保守性[7]。lncRNA-ZFAS1對(duì)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有調(diào)控作用。Xie等[11]研究證實(shí)，lncRNA-ZFAS1通過(guò)靶向miR-484促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲。有研究表明，lncRNA-ZFAS1在胃癌組織中高表達(dá)，這種高表達(dá)是誘發(fā)胃癌細(xì)胞增殖和遷移的重要原因[12]。在膠質(zhì)瘤中，lncRNA-ZFAS1可以通過(guò)激活內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和Notch信號(hào)通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)展，降低晚期膠質(zhì)瘤患者生存率[13]。此外，Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-ZFAS1通過(guò)靶向抑制miR-150，從而調(diào)控ZEB1、MMP14和MMP16的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌轉(zhuǎn)移。隨著研究深入，我們課題組發(fā)現(xiàn)lncRNA-ZFAS1不但對(duì)腫瘤具有調(diào)控作用，對(duì)心血管系統(tǒng)也發(fā)揮重要作用。我們研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-ZFAS1具有成為心肌梗死外周血診斷標(biāo)志物的潛力，對(duì)心肌細(xì)胞中SERCA2a蛋白具有抑制作用，從而誘發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，引起心肌梗死后心臟功能障礙和心肌細(xì)胞凋亡[6-8]。lncRNA-ZFAS1在心肌細(xì)胞中的作用已經(jīng)相對(duì)明確，但是其對(duì)心肌成纖維細(xì)胞以及心肌纖維化的調(diào)控作用尚不明確。

本研究中，我們首先構(gòu)建在體心肌纖維化模型，利用Masson染色確定心肌纖維化模型構(gòu)建成功，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)心肌纖維化組織中l(wèi)ncRNA-ZFAS1的表達(dá)顯著升高。提示lncRNA-ZFAS1對(duì)心肌纖維化具有潛在調(diào)控作用。離體水平進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)敲減lncRNA-ZFAS1后，由Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞中纖維化相關(guān)因子TGFβ1和Ⅲ型膠原表達(dá)顯著降低，這表明敲減lncRNA-ZFAS1對(duì)心肌纖維化具有保護(hù)作用。有趣的是，在心肌細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)lncRNA-ZFAS1的轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟組織中出現(xiàn)膠原沉積，并且纖維化相關(guān)蛋白α-SMA和Ⅰ型膠原以及Ⅲ型膠原的表達(dá)顯著升高。前期研究已經(jīng)闡明lncRNA-ZFAS1在心肌細(xì)胞中的高表達(dá)會(huì)引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡。有研究顯示，心肌細(xì)胞凋亡與心肌纖維化密切相關(guān)，心肌細(xì)胞凋亡會(huì)刺激心肌成纖維細(xì)胞增殖從而導(dǎo)致心肌纖維化[15]。這可能是lncRNA-ZFAS1轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織產(chǎn)生纖維化的原因。但是具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

Fig 3 The myocardial fibrosis in lncRNA-ZFAS1 transgenic mice

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-ZFAS1對(duì)心肌纖維化具有調(diào)控作用，敲減lncRNA-ZFAS1具有抗心肌纖維化的效果。