周超 溫天明 胥麗 劉杰 鄔昊 李釗

(1.成都市第一人民醫(yī)院急診科，四川 成都 610094;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科，重慶 400010)

膿毒癥(sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)，是重癥加強(qiáng)護(hù)理病房患者常見的并發(fā)癥之一，具有很高的致死率[1-2]。當(dāng)膿毒癥發(fā)作時(shí)，患者體內(nèi)首先發(fā)生了過度的炎癥反應(yīng)，致多器官衰竭以及內(nèi)皮功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致患者死亡[3-4]。過去數(shù)十年的研究主要集中在通過抗炎治療控制過度炎癥反應(yīng)造成的損害，然而當(dāng)患者渡過了初期的過度炎癥反應(yīng)，隨后進(jìn)入持久性的免疫抑制階段，無法抵御原發(fā)感染或二次感染，造成了患者在該階段的死亡[5-7]。對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)免疫機(jī)制的研究發(fā)展做出了激發(fā)患者免疫功能恢復(fù)的全新治療理論[8]，程序性死亡受體1/配體1(programmed cell death protein 1/programmed cell death ligand 1,PD-1/PD-L1)通路在宿主和病原作用的免疫調(diào)節(jié)中起著相當(dāng)重要的作用，同時(shí)PD-L1也是膿毒癥免疫抑制的關(guān)鍵基因[9-10]。miR-140是一種microRNA，可靶向作用與目標(biāo)基因3′UTR區(qū)域調(diào)控基因表達(dá)，一些癌癥方面的研究表明miR-140和PD-L1存在靶向作用關(guān)系[11-12]，而miR-140是否通過靶向作用PD-L1還未見報(bào)道。本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔法(cecal ligation and puncture,CLP)建立小鼠膿毒癥模型，探討miR-140靶向PD-L1在小鼠膿毒癥免疫抑制中的作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素2(interleukin-2,IL-2)ELISA試劑盒、PD-L1-APC抗體、CD4-FITC/CD8-PE抗體(美國eBioscience公司)；miR-140 agomir、miR-140 mimic、mimic NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；實(shí)驗(yàn)所用引物由北京擎科生物科技有限公司提供，Trizol提取液、RIPA裂解液、ECL顯色液(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)；反轉(zhuǎn)錄和SsoFastTMEva-Green?Supermix試劑盒(美國Bio-rad公司)；PD-L1一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(美國Santa Cruz公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7～8周齡SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠，體質(zhì)量20～25 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)前于20～22 ℃環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，期間食物和水自由攝取。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及模型建立 取90只小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(Control組)、膿毒癥模型組(CLP組)和CLP+miR-140組，每組各30只。1%～3%異氟烷吸入麻醉小鼠，下腹部酒精消毒，其中CLP組和CLP+miR-140組使用手術(shù)刀沿腹部正中縱切約2 cm的切口，于腹腔中取出盲腸進(jìn)行低位結(jié)扎，使用23號(hào)針對(duì)腸系膜側(cè)向?qū)?cè)進(jìn)行穿孔，擠出少量糞便，盲腸放回原位后關(guān)腹，皮下注射1 mL生理鹽水補(bǔ)充體液流失，在加熱墊上保持溫度支持小鼠蘇醒；Control組切開腹部后即行縫合處理。即日起CLP+miR-140組小鼠腹腔注射給予80 μg miR-140 agomir，連續(xù)5周，每周2次，每組各取20只小鼠于30 d內(nèi)每天對(duì)小鼠死亡事件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，另外10只處死做檢測(cè)。

1.3.2 ELISA檢測(cè)血清炎癥細(xì)胞因子水平 各組小鼠于1、7、14 d時(shí)分別進(jìn)行尾靜脈取血，按照ELISA試劑盒提供的操作說明檢測(cè)血液中TNF-α、IL-2濃度。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-L1細(xì)胞及CD4+和CD8+T細(xì)胞 將14 d時(shí)的血液樣品收集在無菌的含EDTA的血管中，然后在黑暗中于4 ℃下用0.5 μg所需的熒光團(tuán)結(jié)合的Ab或同種型對(duì)照染色30 min，然后用流式細(xì)胞儀洗滌兩次緩沖液并固定在1%多聚甲醛中。流式細(xì)胞儀分析獲取熒光數(shù)據(jù)。

1.3.4 RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá) 用Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)SsoFastTMEva-Green?Supermix試劑盒提供的方法進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件設(shè)置為95℃ 30 s，95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min 40個(gè)循環(huán)，2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 用RIPA試劑提取各組細(xì)胞的總蛋白，并用BCA試劑盒定量，樣品量為每孔20 μg，樣品通過10%SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗在4 ℃孵育過夜，添加適量二抗，于第二天孵育2 h，添加ECL顯色液進(jìn)行曝光顯影，凝膠成像儀拍照分析條帶灰度進(jìn)行相對(duì)定量。

1.3.6 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-140和PD-L1靶向作用關(guān)系 分別構(gòu)建PD-L1 pGL3熒光素酶啟動(dòng)子野生型(WT)和突變型(MUT)載體和miR-140 mimic、mimic NC分別共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥免疫抑制對(duì)炎癥細(xì)胞因子水平的影響 與Control組比較，CLP組小鼠1 d血清炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-2水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與CLP組1 d比較，CLP組小鼠14、21、28 d血清炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-2水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 CLP小鼠炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-2水平Table 1 Levels of inflammatory cytokines TNF-α and IL-2 in CLP mice

2.2 miR-140對(duì)CLP小鼠炎癥細(xì)胞因子的影響 與Control組比較，CLP組小鼠血清TNF-α和IL-2水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與CLP組比較，CLP+miR-140組小鼠血清TNF-α和IL-2差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 miR-140對(duì)CLP小鼠炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-2的影響Tab.2 Effect of miR-140 on inflammatory cytokines TNF-α and IL-2 in CLP mice

2.3 miR-140改善CLP小鼠生存率 造模24 h后，CLP組及CLP+miR-140組小鼠出現(xiàn)精神萎靡不振，行動(dòng)遲緩，對(duì)外界刺激反應(yīng)減弱、顫栗、腹瀉等膿毒癥表現(xiàn)，而對(duì)照組無此類表現(xiàn)。選取20只小鼠行生存率統(tǒng)計(jì)。與Control組比較，CLP小鼠30天生存率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與CLP組比較，CLP+miR-140組小鼠生存率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 miR-140改善CLP小鼠30天生存率(n=20)Figure 1 miR-140 improved 30-day survival of CLP mice注：與Control組比較，①P<0.01；與CLP組比較，②P<0.01

2.4 miR-140提高CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞水平 與Control組比較，CLP組小鼠外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與CLP組比較，CLP+miR-140組小鼠CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞水平進(jìn)一步升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 miR-140提高CLP小鼠CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞比率(n=10)Figure 2 miR-140 increased the ratio of CD4+ &CD8+ T lymphocytes in CLP mice注：與Control組比較，①P<0.01；與CLP組比較，②P<0.01

2.5 miR-140抑制CLP小鼠腹膜PD-L1陽性巨噬細(xì)胞水平 與Control組比較，CLP組小鼠腹膜巨噬細(xì)胞PD-L1陽性細(xì)胞率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與CLP組比較，CLP+miR-140組小鼠腹膜巨噬細(xì)胞PD-L1陽性細(xì)胞率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

圖3 miR-140對(duì)PD-L1陽性巨噬細(xì)胞百分率的抑制作用(n=3)Figure 3 Inhibition of miR-140 on the percentage of PD-L1 positive macrophages注：與Control組比較，①P<0.01；與CLP組比較，②P<0.01

2.6 miR-140抑制CLP小鼠腹膜巨噬細(xì)胞PD-L1基因表達(dá) 通過RT-qPCR對(duì)各組小鼠腹膜巨噬細(xì)胞miR-140和PD-L1基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果表明，與Control組比較，CLP組小鼠腹膜巨噬細(xì)胞中miR-140表達(dá)水平降低，PD-L1表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與CLP組比較，CLP+miR-140組小鼠腹膜巨噬細(xì)胞miR-140表達(dá)水平升高，PD-L1表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

圖4 miR-140對(duì)CLP小鼠腹膜巨噬細(xì)胞PD-L1基因表達(dá)的抑制作用(n=3)Figure 4 Inhibition of miR-140 on PD-L1 gene expression in peritoneal macrophages of CLP mice注：與Control組比較，①P<0.01；與CLP組比較，②P<0.01

2.7 miR-140抑制CLP小鼠腹膜巨噬細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá) 與Control組比較，CLP組小鼠腹膜巨噬細(xì)胞中PD-L1蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與CLP組比較，CLP+miR-140組小鼠腹膜巨噬細(xì)胞中PD-L1蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。

圖5 miR-140對(duì)CLP小鼠腹膜巨噬細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)的抑制作用(n=3)Figure 5 Inhibition of miR-140 on PD-L1 protein expression in peritoneal macrophages of CLP mice注：與Control組比較，①P<0.01；與CLP組比較，②P<0.01

2.8 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-140和PD-L1靶向作用關(guān)系 與PD-L1 WT+mimic NC比較，PD-L1 WT+miR-140細(xì)胞熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；PD-L1 MUT+mimic NC和PD-L1 MUT+miR-140細(xì)胞相比熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)，見圖6。

圖6 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-140和PD-L1靶向作用關(guān)系(n=3)Figure 6 Luciferase reporting assay verified the targeting relationship between miR-140 and PD-L1注：與PD-L1 WT+mimic NC比較，①P<0.01

3 討論

程序性死亡受體1(PD-1)，是一種重要的免疫抑制分子，主要存在于CD4和CD8 T細(xì)胞表面，程序性死亡配體1(PD-L1)和程序性死亡配體2(PD-L2)是PD1的天然配體。當(dāng)PD1和配體結(jié)合時(shí)，會(huì)對(duì)T細(xì)胞的活化發(fā)揮抑制作用[13-14]。PD-L1在諸如巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及癌細(xì)胞中均有表達(dá)，有研究表明PD-L1參與了膿毒癥免疫抑制的機(jī)制[15-16]。Zhang等[17]研究表明PD-L1阻滯可減少膿毒癥小鼠淋巴細(xì)胞凋亡和單核細(xì)胞功能失調(diào)而提高其生存率；Wang等[18]研究表明PD-L1在膿毒癥小鼠中性粒細(xì)胞中上調(diào)引起免疫抑制。因此，基于阻滯PD-L1的促進(jìn)患者免疫功能恢復(fù)治療成為膿毒癥一種全新的治療思路。miR-140是一種小分子非編碼RNA，在Dong等[12]的研究中發(fā)現(xiàn)了miR-140在宮頸癌中同PD-L1靶向作用關(guān)系，而在Xie等[11]的研究中同樣發(fā)現(xiàn)miR-140靶向PD-L1對(duì)非小細(xì)胞肺癌增殖產(chǎn)生影響。過去已有研究報(bào)道了miR-140與膿毒癥存在聯(lián)系[19]，本研究為探究miR-140靶向PD-L1對(duì)膿毒癥免疫抑制的影響，建立CLP小鼠膿毒癥模型進(jìn)行試驗(yàn)，并延長觀察時(shí)間以確保免疫抑制狀態(tài)的發(fā)生[20]。本研究首先檢測(cè)了炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-2在1、7、14 d時(shí)的水平變化，發(fā)現(xiàn)CLP模型小鼠的TNF-α和IL-2水平升高，而隨著時(shí)間的推移，TNF-α和IL-2逐步減少，TNF-α和IL-2分別是由巨噬細(xì)胞和活化T細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中有著重要作用，可反映炎癥的水平[21]。本研究以14 d作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的觀察時(shí)間點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過miR-140 agomir處理后，相比于未經(jīng)miR-140 agomir處理的模型小鼠，盡管TNF-α和IL-2水平變化差別不大，但模型小鼠的生存率明顯改善，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分率升高，結(jié)果表明miR-140激發(fā)了CLP小鼠免疫功能恢復(fù)，改善了生存率。

巨噬細(xì)胞除參與了吞噬、抗原呈遞及T、B細(xì)胞活化等功能外，也參與了對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控[22-23]。適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)是殺死入侵的微生物的有效方式，巨噬細(xì)胞通過免疫抑制作用控制炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度[24]。而在膿毒癥動(dòng)態(tài)反應(yīng)過程中，細(xì)胞功能紊亂導(dǎo)致在初始的炎癥免疫反應(yīng)之后，進(jìn)入持續(xù)的免疫抑制狀態(tài)，其中巨噬細(xì)胞功能障礙是膿毒癥性免疫抑制的重要原因之一[25]。PD-L1參與了巨噬細(xì)胞免疫抑制的調(diào)控作用[26]。本研究通過提取CLP模型小鼠腹膜巨噬細(xì)胞，考查miR-140和PD-L1在CLP小鼠巨噬細(xì)胞中的作用關(guān)系。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過miR-140 agomir處理可扭轉(zhuǎn)膿毒癥引起的小鼠PD-L1陽性巨噬細(xì)胞率的升高，并且在基因和蛋白水平上也表現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)。進(jìn)一步通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了miR-140和PD-L1的靶向關(guān)系。結(jié)果表明miR-140通過靶向作用于PD-L1基因，降低PD-L1在巨噬細(xì)胞的表達(dá)，從而解除巨噬細(xì)胞的免疫抑制作用。

4 結(jié)論與展望

miR-140可激發(fā)CLP小鼠免疫功能恢復(fù)，提高CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比率，改善小鼠生存率，這一作用與miR-140靶向沉默PD-L1，解除巨噬細(xì)胞的免疫抑制作用有關(guān)。本研究為臨床膿毒癥基于PD-1/PD-L1通路的免疫治療提供新的理論依據(jù)和生物學(xué)基礎(chǔ)，但僅從miR-140對(duì)巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控角度解釋了miR-140對(duì)CLP小鼠免疫功能恢復(fù)的機(jī)制，尚存在其他靶細(xì)胞的可能性，有待在后續(xù)研究中進(jìn)一步闡明。