虛擬導(dǎo)航超聲氣管鏡灌洗液miRNA檢測(cè)對(duì)周圍型肺癌的診斷價(jià)值*

顏晶晶 張業(yè) 劉穎 劉政 蔡青波

(1.河北中石油中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河北 廊坊 065000；2.廊坊市人民醫(yī)院感染科，河北 廊坊 065000)

肺癌是我國(guó)發(fā)病率及病死率均較高的惡性腫瘤之一，周圍型肺癌是一種起于三級(jí)支氣管以下、細(xì)小支氣管以上的肺部疾病，由于早期無(wú)典型臨床癥狀，易與其他良性結(jié)節(jié)型病變相混淆[1]，臨床誤診漏診率高，支氣管鏡有關(guān)診療技術(shù)是早期肺癌診斷的有效工具之一，但因周圍型肺癌距離肺門較遠(yuǎn)，病灶部位較難在鏡下直視，早期確診仍存在難度[2]。虛擬支氣管鏡導(dǎo)航(virtual bronchoscopic navigation，VBN)以及灌洗液檢測(cè)的應(yīng)用明顯提高了肺癌的臨床診斷率[3]，有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA在肺癌的發(fā)生及進(jìn)展中扮演著重要的角色，miRNA可調(diào)控瘤灶的生長(zhǎng)、侵襲以及轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程[4]。雖QD 目前臨床有關(guān)miRNA與肺癌病理特征關(guān)系的研究不少，但關(guān)于VBN灌洗液miRNA檢測(cè)對(duì)周圍型肺癌的診斷價(jià)值依然缺乏統(tǒng)一定論，為此本文展開(kāi)臨床回顧性分析，旨在為周圍型肺癌的早期診治提供參考，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年6月～2019年6月河北中石油中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的56例周圍型肺癌患者(疾病組)及56例肺部良性病變患者(對(duì)照組)為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①其中周圍型肺癌經(jīng)肺穿刺活檢確診，而肺部良性病變經(jīng)肺部CT及臨床表現(xiàn)確診。②檢查前未接受放化療或進(jìn)行疾病對(duì)癥用藥。③無(wú)過(guò)敏史。④采用支氣管鏡檢查并收集了VBN灌洗液。⑤患者及其家屬知曉本研究?jī)?nèi)容目的。⑥臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重肺通氣功能障礙。②存在重度心肺功能不全。③有出血傾向亦或存在重大疾病無(wú)法耐受VBN檢查。

1.2 方法 ①VBN灌洗液收集，VBN軟件自動(dòng)建立虛擬支氣管鏡圖像，引導(dǎo)支氣管鏡置入肺外周病變，支氣管鏡檢查在局麻成功后進(jìn)行操作；OlympusBF-P260F型支氣管鏡(外徑4.0 mm，工作孔徑2.0 mm)經(jīng)VBN系統(tǒng)被導(dǎo)航至目標(biāo)支氣管，在病變部位行超聲探查(單晶直探頭，型號(hào)為 0.5P-28 N)，將氣管鏡嵌入目標(biāo)病變支氣管開(kāi)口，灌洗120～300 mL生理鹽水，回收30% VBN灌洗液，制作標(biāo)本后送檢，在同一穿刺點(diǎn)再次穿刺，將標(biāo)本置入EP管中，隨后放進(jìn)-80 ℃冰箱保存待測(cè)。②VBN灌洗液miRNA檢測(cè)，RNA提取：待標(biāo)本完全融化后混勻，取樣本300 μL，加入1 mL Trizol后，室溫下放置5 min確保其充分裂解，加入200 μL氯仿，振蕩15 s，室溫放置15 min；4 ℃，12000×g離心15 min；吸取上層水相并移至另一離心管；加入75%乙醇，振蕩離心并懸浮沉淀；4 ℃ 7500×g離心5 min，去除上清液；室溫晾干8 min，加入DEPC水 40 μL溶解；20 μL反應(yīng)體系：10 μL的Geneseed@ qPCR SYBR@ Green Master Mix，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，0.4 μL的50xROX Reference Dye 2，模板DNA2，加滅菌蒸餾水至20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；40個(gè)循環(huán)，95 ℃10 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNA相對(duì)表達(dá)量，以U6為內(nèi)參基因，依據(jù)2-△△Ct公式計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)量，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(管家基因)，ΔΔCt=試驗(yàn)組ΔCt-對(duì)照組ΔCt。

1.3 觀察指標(biāo) ①疾病組、對(duì)照組VBN灌洗液中三種miRNA相對(duì)表達(dá)量比較，主要包含miRNA-21、miRNA-155和miRNA-205相對(duì)表達(dá)量。②疾病組不同病理特征患者灌洗液中三種miRNA相對(duì)表達(dá)量比較。③VBN灌洗液中miRNA檢測(cè)對(duì)周圍型肺癌的診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 疾病組男19例、女37例，年齡36～65歲，平均(51.06±5.23)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(24.14±2.06) kg/m2；分類：小細(xì)胞肺癌21例、非小細(xì)胞肺癌35例。對(duì)照組男20例、女36例，年齡35～68歲，平均(50.93±5.18)歲；BMI(23.96±2.11) kg/m2；肺部良性病變分類：肺中葉結(jié)節(jié)28例、慢性阻塞性肺病15例、肺結(jié)核6例、其它7例。兩組性別、年齡、BMI等基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2 兩組患者VBN灌洗液中三種miRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較，疾病組VBN灌洗液中miRNA-21、miRNA-155和miRNA-205相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者VBN灌洗液中三種miRNA相對(duì)表達(dá)量比較Table 1 Comparison of the relative expression of three miRNAs in VBN lavage fluid from disease group and control group

2.3 疾病組不同病理特征患者灌洗液中三種miRNA相對(duì)表達(dá)量比較 疾病組組織學(xué)分類為腺癌、臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期、分化程度為低分化患者的灌洗液中miRNA-21、miRNA-155和miRNA-205相對(duì)表達(dá)量相較同類其它明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 疾病組不同病理特征患者灌洗液中三種miRNA相對(duì)表達(dá)量比較Table 2 Comparison of the relative expression levels of three miRNAs in lavage fluid from patients with different pathological characteristics in the disease group

2.4 VBN灌洗液中miRNA相對(duì)表達(dá)量與周圍型肺癌的病理特征的關(guān)系 相關(guān)性分析提示VBN灌洗液中miRNA相對(duì)表達(dá)量與周圍型肺癌的組織學(xué)分類(腺癌)、臨床分期呈明顯正相關(guān)，與分化程度呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 VBN灌洗液中miRNA相對(duì)表達(dá)量與周圍型肺癌的病理特征的關(guān)系Table 3 Relationship between the relative expression of miRNA in VBN lavage fluid and the pathological characteristics of peripheral lung cancer

2.5 VBN灌洗液中miRNA檢測(cè)對(duì)周圍型肺癌的診斷價(jià)值 ROC曲線分析提示VBN灌洗液中miRNA-21、miRNA-155和miRNA-205檢測(cè)診斷周圍型肺癌的曲線下面積分別為0.988、0.862、0.831，其中miRNA-21診斷周圍型肺癌的靈敏度、特異度最高，見(jiàn)表4、圖1。

表4 VBN灌洗液中miRNA檢測(cè)診斷周圍型肺癌的ROC曲線參數(shù)Table 4 ROC curve parameters of miRNA detection in VBN lavage fluid for diagnosis of peripheral lung cancer

圖1 VBN灌洗液中miRNA檢測(cè)診斷周圍型肺癌的ROC曲線Figure 1 ROC curve of miRNA detection in VBN lavage fluid for diagnosis of peripheral lung cancer

3 討論

自國(guó)外學(xué)者首次提出選擇性定位支氣管肺泡灌洗液檢查以來(lái)，支氣管肺泡灌洗液檢測(cè)手段逐漸應(yīng)用于肺部疾病診治中，被視為液相肺活檢，研究證實(shí)其可直接獲取肺局部病變情況，尤其適用于無(wú)法行肺穿刺活檢或開(kāi)胸活檢的肺病診治[5]；文獻(xiàn)報(bào)道支氣管鏡在周圍型肺癌診斷中較難對(duì)病灶進(jìn)行直接定位，而經(jīng)皮肺穿刺活檢的難度及風(fēng)險(xiǎn)較大，此外氣管鏡刷片細(xì)胞學(xué)檢查以及痰液細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性較低[6]；而VBN屬于一種在CT技術(shù)基礎(chǔ)上重建支氣管數(shù)的方法，其可確保檢查者在無(wú)侵入性操作情況下觀察到氣管內(nèi)圖像，在引導(dǎo)支氣管鏡進(jìn)入靶支氣管中有明確作用[7]，國(guó)外學(xué)者研究也證實(shí)VBN可提高疾病的診斷率且有效縮短檢查時(shí)間[8]。miRNA屬于一種小分子RNA，其可結(jié)合mRNA3′UTR區(qū)域，調(diào)控蛋白質(zhì)合成并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及凋亡，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究一致認(rèn)為miRNA與肺癌發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[9-10]?；谝陨媳尘?，探究VBN灌洗液miRNA檢測(cè)對(duì)周圍型肺癌診斷價(jià)值有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

本研究結(jié)果顯示，疾病組VBN灌洗液中miRNA-21、miRNA-155和miRNA-205相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高，說(shuō)明周圍型肺癌VBN灌洗液中miRNA-21、miRNA-155和miRNA-205表達(dá)呈明顯上調(diào)趨勢(shì)，與李璽等[11]學(xué)者研究報(bào)告大體上相符。本研究結(jié)果還顯示疾病組組織學(xué)分類為腺癌、臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期、分化程度為低分化患者的灌洗液中miRNA-21、miRNA-155和miRNA-205相對(duì)表達(dá)量相較同類其它明顯升高，提示VBN灌洗液中miRNA-21、miRNA-155和miRNA-205相對(duì)表達(dá)量或與周圍型肺癌發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)[12-14]；而VBN灌洗液中miRNA相對(duì)表達(dá)量與周圍型肺癌的組織學(xué)分類(腺癌)、臨床分期呈明顯正相關(guān)，與分化程度呈明顯負(fù)相關(guān)，同時(shí)證實(shí)VBN灌洗液中miRNA-21、miRNA-155和miRNA-205檢測(cè)均對(duì)周圍型肺癌有明確診斷價(jià)值，初步推測(cè)VBN灌洗液中miRNA-21、miRNA-155和miRNA-205檢測(cè)有助于周圍型肺癌早期診治。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-21不僅在肺癌組織中呈高表達(dá)，且在肺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表現(xiàn)為高表達(dá)，其可對(duì)RAS/MEK/ERK信號(hào)通路進(jìn)行抑制[15]，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和增殖，此外其表達(dá)水平與程序性細(xì)胞凋亡因子呈顯著負(fù)相關(guān)[16-17]，故其在周圍型肺癌中的診斷價(jià)值高，并與周圍型肺癌的病理特征密切相關(guān)，表現(xiàn)為miRNA-21水平越高周圍型肺癌病理分期越高、分化程度更低而腺癌可能性更大，而本次研究結(jié)果也顯示miRNA-21水平在周圍型肺癌診斷中的靈敏度和特異度最高。國(guó)外學(xué)者文獻(xiàn)[18]報(bào)道，miRNA-205、miRNA-21表達(dá)水平在肺癌組織學(xué)分型鑒別診斷中有明確價(jià)值，并將miRNA-205視為肺鱗癌鑒別診斷的特異性標(biāo)志物，此外研究指出miRNA-155在惡性腫瘤中呈高表達(dá)，通過(guò)減少miRNA-155基因表達(dá)量可有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)和增殖[19-20]，而本次結(jié)果同時(shí)證實(shí)miRNA-205、miRNA-155與周圍型肺癌的組織學(xué)分類(腺癌)、臨床分期以及分化程度均密切相關(guān)，但不同的是本文同時(shí)分析了VBN灌洗液miRNA與周圍型肺癌惡性生物學(xué)行為的關(guān)系，進(jìn)一步明確了VBN灌洗液miRNA檢測(cè)利于周圍型肺癌的臨床診斷以及病理特征的分析，為周圍型肺癌早期診治提供參考。

4 結(jié)論與啟示

VBN灌洗液miRNA檢測(cè)對(duì)診斷周圍型肺癌的臨床價(jià)值明確，在評(píng)估周圍型肺癌病情程度中發(fā)揮重要作用，或可為患者的早期治療方案制定提供參考。但本文同時(shí)存在研究對(duì)象來(lái)源較集中和隨訪時(shí)間較短，且未分析VBN灌洗液miRNA與周圍型肺癌患者預(yù)后的關(guān)系，還需進(jìn)一步完善研究。