鄧 永,劉東紅,2,3,*
(1.浙江大學 生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,浙江 杭州 310058;2.寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,浙江 寧波 315040;3.浙江大學 馥莉食品研究院,浙江 杭州 310058)
石榴(PunicagrantumL.)是一種廣受喜愛的水果,其栽種面積和產(chǎn)量每年都在上升。石榴可直接食用,也可以被加工成果汁、飲料、果凍、調(diào)味劑和著色劑等工業(yè)產(chǎn)品[1]。在食品工業(yè)生產(chǎn)中,會有大量石榴皮產(chǎn)生,這些石榴皮常被當做廢棄物丟棄,然而,石榴皮含有豐富的多酚,可作為多酚來源。多酚是一種次級代謝產(chǎn)物,能夠在很多方面發(fā)揮效用,比如抗炎[2]、抗心血管疾病[3]和抗癌[4]等。從石榴皮中提取多酚能夠有效利用這些工業(yè)副產(chǎn)物,使其得到最大化利用。
傳統(tǒng)溶劑提取法如浸漬法等因其成熟、易于放大和易操作等優(yōu)點廣泛用于各種活性成分的提取,但傳統(tǒng)方法浪費時間和能量,并且提取率較低[5];非熱加工技術,如超聲輔助提取技術,能夠很大限度地減少提取時間和能量的浪費。一般認為,超聲輔助提取的機理涉及復雜的超聲空化作用[6-7]。超聲在溶液中產(chǎn)生空化泡,空化泡的迅速產(chǎn)生和破裂會產(chǎn)生強有力的沖擊波和二次效應,如局部高溫高壓等[7-8],從而對周圍植物組織和細胞產(chǎn)生破壞,加速溶劑和細胞內(nèi)溶液的對流和溶質(zhì)的交換,提高提取效率。研究發(fā)現(xiàn),利用超聲輔助提取法從石榴皮中提取多酚,比傳統(tǒng)溶劑法的提取時間縮短了90%,而得率提高了24%[8],表明超聲輔助提取的效率非常高;但是,不同溶劑對超聲提取效果的影響和不同處理方法下多酚成分的變化尚缺乏深入研究。本研究擬采用超聲輔助提取法從石榴皮中提取多酚,并與傳統(tǒng)方法進行對比,用普魯士藍法測定超聲處理在不同溶劑(水、正己烷、乙醇、甲醇、乙醚和乙酸乙酯)中的多酚提取效果,同時對提取參數(shù)(液固比、超聲功率和超聲時間)進行優(yōu)化;此外,本研究還將對不同處理條件下的石榴皮多酚的成分及含量進行分析,用顯微觀察研究超聲對植物組織表面的破壞作用。
石榴皮購自安徽亳州康美中藥城中藥材商店,為完整的大塊石榴皮。將石榴皮在烘箱中干燥24 h,再經(jīng)粉碎后過10目和20目篩,得到粒徑為10~20目的原料,室溫下避光保存在玻璃干燥皿中。甲醇、甲酸均為色譜純,美國Sigma-Aldrich公司;蒸餾水,杭州娃哈哈公司;正己烷、乙醇、甲醇、乙醚、乙酸乙酯(均為分析純),氯化鐵、鐵氰化鉀和鹽酸,中國國藥集團;沒食子酸、香豆酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、鞣花酸、石榴皮鞣素和安石榴苷,分析對照標準品(純度≥98%),成都德思特生物技術有限公司。
JY92-IIDN型超聲波細胞粉碎機,寧波新芝生物科技股份有限公司;HH-10型數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋,金壇市科杰儀器廠;UV-2600型紫外-可見分光光度計,日本島津公司; 高效液相色譜系統(tǒng)(e2695, 配有2489可變波長紫外檢測器和Empower 3色譜工作站),美國Waters公司;XDB-C18型色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),美國安捷倫公司;UB-200i型顯微鏡,重慶UOP光電技術有限公司。
1.3.1傳統(tǒng)溶劑法提取石榴皮多酚
稱量0.5 g石榴皮,置于超聲管中,加入30 mL水,在溫度60 ℃和攪拌速度200 r/min條件下,水浴鍋中恒溫水浴60 min,然后經(jīng)離心過濾得到上清液,測定多酚得率。
1.3.2超聲輔助提取的溶劑篩選
為了篩選出超聲輔助提取的最佳溶劑,測試了6種不同溶劑下的多酚得率,包括水、正己烷、乙醇、甲醇、乙醚和乙酸乙酯。稱取0.5 g石榴皮,置于超聲玻璃管中,加入20 mL溶劑,在400 W下超聲20 min,測定多酚得率。
1.3.3超聲輔助提取石榴皮多酚
采用單因素實驗優(yōu)化超聲輔助提取多酚的相關參數(shù),包括超聲功率、超聲時間和液固比。稱取0.5 g石榴皮,置于超聲玻璃管中,按照液固比(mL∶g)為20∶1、40∶1、60∶1和80∶1,用量筒分別量取相應體積蒸餾水加入管中。在一定功率下(100、250、400、550 W),超聲一定時間(5、15、25、35 min),處理后的溶液經(jīng)離心過濾得到上清液,測定多酚得率。
1.3.4石榴皮多酚成分及含量測定
采用高效液相色譜法(HPLC)測定石榴皮多酚成分及含量。用注射器吸取樣品1 mL,在0.45 μm濾膜過濾后注射到色譜瓶中,得到色譜樣品備用。HPLC色譜條件:流動相A為體積分數(shù)2%的甲酸水溶液,流動相B為純甲醇,其他條件為注射體積10 μL,洗脫流速0.7 mL/min,溫度30 ℃和吸收波長280 nm。根據(jù)標準品曲線計算多酚各成分的含量。
1.3.5顯微觀察
將未處理或處理后的石榴皮凍干48 h,得到凍干樣品。樣品放置在載玻片上,顯微鏡倍數(shù)為40倍,分辨率為3 000×4 000,顯微鏡連接電腦,并設置相應參數(shù)使畫面盡可能接近真實且清晰。
1.3.6總多酚得率的測定
采用普魯士藍法[9]測定總多酚的含量,稍有改動。取樣品液10 μL,加入10 mL試管中,依次加入0.5 mL 0.1 mol/L FeCl3、0.5 mL 0.008 mol/L K3Fe(CN)3溶液和0.5 mL 0.1 mol/L HCl溶液,再加入蒸餾水至10 mL,混勻后室溫下避光放置15 min,然后用分光光度計測定695 nm處吸光值。配置濃度梯度為0.2、0.6、1.0、1.6 mg/mL的沒食子酸標準溶液,按照以上測定方法繪制標準曲線(y=0.602 1x-0.083 3,R2=0.999,y為吸光值,x為沒食子酸濃度)。多酚得率(以沒食子酸為標準),mg/g;用式(1)計算。
(1)
式(1)中:A為吸光度;V為溶液體積,mL;m為石榴皮干質(zhì)量,g。
本研究對比了6種不同的溶劑對石榴皮多酚提取效果的影響,結(jié)果如圖1。由圖1可見,在超聲環(huán)境下,石榴皮多酚在水中的溶解度最大,達到31.80 mg/g, 遠高于其他溶劑中多酚的得率。甲醇和乙醇中的多酚得率分別為19.43 mg/g和12.52 mg/g,而正己烷、乙醚和乙酸乙酯中的多酚得率較低,均在4 mg/g左右。實際上,石榴皮多酚在很多有機溶劑中的溶解度比水中高。王曉瑜等[10]用傳統(tǒng)溶劑法研究了采用不同溶劑從石榴皮中提取多酚,發(fā)現(xiàn)多酚得率從大到小為:甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯,與本研究結(jié)果顯著不同,這和提取方法有關。超聲在不同溶劑中的能量釋放能力,即產(chǎn)生空化泡和二次現(xiàn)象如自由基等的能力,可能存在巨大的差異,使得超聲對石榴皮組織的破壞作用和促進石榴皮多酚的釋放程度存在明顯的不同,從而導致這樣的差異。所以,不管從多酚得率,還是安全性和環(huán)境友好型溶劑方面考慮,本研究選水作為溶劑進行后續(xù)實驗研究。
圖1 超聲環(huán)境下不同溶劑對多酚得率的影響
2.2.1液固比對石榴皮多酚得率的影響
在超聲功率為400 W,超聲時間為25 min的條件下,分別研究了液固比為20∶1、40∶1、60∶1和80∶1時的多酚得率,結(jié)果如圖2。圖2表明,多酚得率會隨著液固比的增加而增加,當液固比從20∶1增加到60∶1,多酚得率從28.56 mg/g增加到39.30 mg/g。溶劑的量增加會使得細胞內(nèi)外多酚濃度差變大,并且平衡會向胞外溶液傾斜而使得溶液濃度增大[11];然而繼續(xù)增加液固比,多酚得率并沒有明顯增加,所以60∶1是在此超聲條件下的最佳液固比。
圖2 液固比對多酚得率的影響
2.2.2超聲功率對石榴皮多酚得率的影響
在液固比為60∶1,超聲時間為25 min的條件下,分別對超聲功率為150、250、400、550 W的多酚得率進行研究,結(jié)果如圖3。由圖3發(fā)現(xiàn),隨著超聲功率的提高(100~400 W),多酚得率逐漸升高,這是因為,更大的超聲功率意味著更大的能量輸入,產(chǎn)生更強有力的超聲空化效應,導致植物組織的進一步破壞,從而釋放更多的多酚[12]。在本研究中,多酚得率在超聲功率400 W時達到最大,在550 W時,多酚得率變化不顯著;因此400 W為最佳條件。
圖3 超聲功率對多酚得率的影響
2.2.3超聲時間對石榴皮多酚得率的影響
在液固比為60∶1,超聲功率為400 W的條件下,分別對超聲時間5、15、25、35 min的多酚得率進行了研究,結(jié)果如圖4。超聲時間對石榴皮多酚得率是一個積極影響[13],當超聲時間從5 min到35 min時,多酚得率一直在增加。不過,在時間達到一定程度后,多酚的增加并不明顯。所以考慮到時間與能量消耗,將25 min作為實驗最佳條件。
圖4 超聲時間對多酚得率的影響
經(jīng)過單因素實驗優(yōu)化,得到超聲提取石榴皮多酚的優(yōu)化條件為液固比60∶1、超聲功率400 W和超聲時間25 min,最佳多酚得率為39.30 mg/g,高于傳統(tǒng)溶劑提取結(jié)果(32.58 mg/g),并且時間由60 min減少到25 min。
用HPLC測定石榴皮多酚的成分和實際含量,結(jié)果如表1。石榴皮多酚主要由沒食子酸、香豆酸、綠原酸、鞣花酸、石榴皮鞣素和安石榴苷組成。從表1可以知道,安石榴苷含量最高,其次是石榴皮鞣素和沒食子酸,再次是鞣花酸,而咖啡酸和丁香酸含量較低。實際上,石榴皮多酚的成分和許多因素有關,比如環(huán)境溫度、季節(jié)和成熟度等;不過,文獻研究[14-15]均指出,石榴皮多酚中安石榴苷、石榴皮鞣素、沒食子酸和鞣花酸等的含量最高,這和本研究的結(jié)論一致。此外,通過超聲處理,各成分的含量有較大的提高,這是由于超聲處理加速了胞內(nèi)物質(zhì)的溶出。比如,安石榴苷和石榴皮鞣素分別從39.40 mg/g和12.06 mg/g提高到了47.80 mg/g和15.10 mg/g。
表1 石榴皮多酚主要成分
超聲會對植物組織和細胞造成破壞[16],因此,本研究用顯微鏡觀察石榴皮表面的形態(tài),分析超聲對植物組織是否存在破壞作用。顯微觀察結(jié)果如圖5。圖5(a)是未處理組,圖5(b)是傳統(tǒng)溶劑法處理組,圖5(c)是超聲法處理組。結(jié)果表明:圖5(a)和5(b)中的石榴皮表面結(jié)構(gòu)完整、組織緊密,即傳統(tǒng)溶劑法并不能明顯破壞植物組織表面,因此其提取率可能更依賴于滲透作用;而圖5(c)中的表面結(jié)構(gòu)存在大量孔隙,表面組織不完整,表明超聲能夠破壞植物表面形態(tài),所以超聲可以解構(gòu)植物組織,促進多酚的溶出。
白色箭頭處為主要破壞處
超聲輔助提取石榴皮多酚可以使石榴皮重新得到利用,發(fā)揮其最大價值。本研究利用超聲輔助提取方法從石榴皮中提取多酚。在超聲環(huán)境下,以不同溶劑提取多酚,發(fā)現(xiàn)用水作為溶劑比其他5種有機溶劑(正己烷、乙醇、甲醇、乙醚、乙酸乙酯)的提取效果更好,因此,選取水作為提取溶劑。經(jīng)過單因素實驗優(yōu)化,得到超聲輔助提取石榴皮多酚的優(yōu)化條件為液固比(mL∶g)60∶1、超聲功率400 W和超聲時間25 min,最佳多酚得率為39.30 mg/g,高于傳統(tǒng)溶劑提取效果(32.58 mg/g)。HPLC分析表明,石榴皮多酚主要含有安石榴苷、石榴皮鞣素、沒食子酸和鞣花酸。在超聲處理后,石榴皮多酚各成分的含量有了較大提高。顯微觀察結(jié)果表明,石榴皮在超聲環(huán)境下會被破壞,從而加速了多酚的提取。相比于傳統(tǒng)溶劑法提取石榴皮多酚,超聲輔助提取耗時短、得率高、更高效,因此,超聲輔助提取可以提高石榴皮多酚的產(chǎn)量并降低提取時間。希望本研究可以為食品工業(yè)中石榴皮的高值化利用提供理論參考。