魏 杰，于文辰，郝若冰，楊 靜，許德鑫，高 軍

(1.遼寧大學 生命科學院，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧省林業(yè)科學研究院，遼寧 沈陽 110032)

金褐霉素(Aureofuscin)是從我國土壤中分離得到的鏈霉菌新種——金褐鏈霉菌(Streptomycesaureofuscus)產(chǎn)生的一種四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌物質(zhì)，具有多個共軛雙鍵，一個羥基側鏈基團和一個大環(huán)內(nèi)酯骨架，與納他霉素結構類似[1-2]。金褐霉素為針狀結晶，無色無味，沒有明顯的熔點，不溶于低級醚，幾乎不溶于水，LD50為28.27 mg/kg[1]。金褐霉素在食品保鮮方面具有廣闊的應用前景，極有可能開發(fā)為新型高效、低殘留、安全、穩(wěn)定的食品防腐劑。金褐霉素生物合成的調(diào)控機制尚未明確,并且金褐霉素的產(chǎn)量較低, 限制了其產(chǎn)業(yè)化應用。研究金褐霉素生物合成中關鍵調(diào)控基因以及基因改造等方法，提高金褐霉素的產(chǎn)量，成為目前需要解決的關鍵問題。

本項目組在前期研究中建立了一種新型的金褐霉素高效液相色譜(HPLC)的快速檢測方法[3]；采用核磁共振技術檢測并優(yōu)化分離提取工藝，優(yōu)化野生菌株培養(yǎng)條件、發(fā)酵工藝[4]；通過添加前體物質(zhì)提高野生型金褐鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)量[5]；克隆得到金褐霉素生物合成基因簇中完整基因aurJ3M，在GenBank上公布，登錄號為EU697915；發(fā)現(xiàn)基因aurJ3M能促進金褐霉素的生物合成，并且其對黑根霉具有很強的抑菌性；繼續(xù)深入研究基因aurJ3M的途徑特異性調(diào)控功能及其調(diào)控機制[6-8]；金褐霉素對冬棗的保鮮效果優(yōu)于納他霉素[9]，并且由茶多酚和金褐霉素組成的復合保鮮劑對蝦夷扇貝也具有很好的保鮮效果[10]。本研究擬對基因aurT的功能及其對金褐霉素生物合成的調(diào)控機制進行分析，試圖深入了解金褐霉素的調(diào)控網(wǎng)絡，希望為通過基因改造等方法提高金褐霉素的產(chǎn)量奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

金褐鏈霉菌SYAU0709(Streptomycesaureofuscus.n.sp)、大腸桿菌DH5α和JM109，由本實驗室保存。大腸桿菌ET12567(pUZ8002)和大腸桿菌/鏈霉菌穿梭載體pSET152，由中國科學院微生物研究所的謝鋒博士贈送。

可溶性淀粉、酵母浸粉、基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等均購自鼎國昌盛生物技術有限公司；DNA Marker、T4 DNA ligase、BamHI、EcoRV、XbaI、HindIII，購自Takara生物技術有限公司。

1.2 主要儀器與設備

7500型Real-Time PCR儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DYCP-31E型瓊脂糖凝膠電泳儀，北京市六一儀器廠；Veriti 96 2720 t100型PCR擴增儀，美國ABI 公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；UV-2201型紫外分光光度計，日本島津公司；冰柜，山東省青島海爾集團；SHZ-22型水浴恒溫振蕩器，江蘇省太倉市醫(yī)療器械廠；GA110 型電子天平，梅特勒-托利多國際有限公司；Laborota 4010型真空旋轉蒸發(fā)儀，德國Heidolph公司；CR-22型高速冷凍離心機，日本日立公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，江蘇省昆山市定山湖檢測儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1aurT基因的克隆與分析

參考文獻[11-13]進行實驗。根據(jù)NCBI-blast數(shù)據(jù)庫中pimT基因序列，使用Clustal-w軟件進行多序列同源性比對，用Premer Premier 5.0軟件設計引物aurT-1(5′-ATGGTGTCCACGGAGAGCAT-3′)和aurT-2(5′-CTAGTCGGCGCGGCCCGTCG-3′)，并以金褐鏈霉菌SYAU0709基因組DNA為模板進行PCR擴增;使用DNA片段純化試劑盒進行回收，交由上海生物技術公司測序，采用Clustalw(http:∥www.genome.jb/tools/clustalw/)和MEGA7.0軟件對aurT序列的同源性進行比對和分析。

1.3.2aurT基因過表達載體構建

參考文獻[6]和文獻[14]進行實驗。設計并合成具有BamHI和EcoRV限制性酶切位點的引物，上游引物aurT-Bt4(5′-GTGGATCCATGGTGTCCACGGAGAGCAT-3′)和下游引物aurT-Et5(5′-GTGATATCCTAGTCGGCGCGGCCCGTCG-3′)，獲得帶有限制性內(nèi)切酶位點的aurT基因片段；與同種限制酶消化處理的pSET152載體進行連接，得到過表達質(zhì)粒pSET152-aurT。重組質(zhì)粒pSET152-aurT通過E.coliET12567與野生型S.aureofuscusSYAU0709菌株進行接合轉移，篩選獲得重組轉化子，將轉化子DNA進行PCR和酶切驗證，獲得aurT高效表達菌株♂aurT。

1.3.3aurT基因敲除載體構建

參考文獻[15-17]進行實驗。設計引物aurT-U-F(5′-CGGAATTC TGCACTCCAC TCGCTCCGCT-3′)/aurT-U-R(5′-GCTCTAGA GGCGCTTCTG ACGGATCTCC-3′)和aurT-D-F(5′-GCTCTAGATGCCCGTCAC CTCCTGGAAT-3′)/aurT-D-R(5′-CCCAAGCTTA ACCTCCACGGCGCCCTCGT-3′)，以S.aureofuscusDNA為模板擴增獲得aurT基因的上下游同源臂aurT-5和aurT-3；同時以pC1203質(zhì)粒為模板，擴增抗性基因aac(3)IV及復制起始位點序列OriT的DNA片段aac(3)IV-OriT；以質(zhì)粒pUC18為模板，通過酶切連接并轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，將aurT-5和aurT-3及片段aac(3)IV-OriT連接在pUC18載體上，即pUC18-5129質(zhì)粒構建成功；用EcoRI/HindIII依次對pUC18-5129質(zhì)粒和pC1203質(zhì)粒雙酶切，獲得aurJ3M-5-aac(3)IV-OriT-3片段和pC1203大骨架載體，連接并轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞；挑選陽性克隆，構建含有阿泊拉霉素抗性基因的aurT基因敲除重組質(zhì)粒pDaurT，將此質(zhì)粒轉化至大腸桿菌ET12567/pUZ8002，利用接合轉移將重組質(zhì)粒導入到S.aureofuscus, 通過抗性篩選出雙交換重組菌株，獲得aurT基因敲除菌株ΔaurT。

1.3.4搖瓶發(fā)酵實驗

將野生型S.aureofuscusSYAU0709菌株、♂aurT菌株和ΔaurT菌株用挖塊法接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，29 ℃，220 r/min搖床培養(yǎng)40 h，以體積分數(shù)10%的接種量接種，搖床發(fā)酵72 h，待測。

1.3.5PI因子結構類似物對金褐霉素產(chǎn)量的影響實驗

參考文獻[18-19]進行實驗。采用紫外分光光度計在303 nm處測定樣品吸光度值，根據(jù)線性回歸方程(Y=0.295 7X+0.037 7)計算發(fā)酵液中金褐霉素的含量；篩選不同PI因子結構類似物，確定最佳PI因子及其質(zhì)量濃度；添加最佳PI因子，對比PI因子在野生型和ΔaurT菌株中對金褐霉素產(chǎn)量的影響。

1.3.6aurT基因的Real-Time PCR轉錄水平分析

參考文獻[20-22]進行實驗。提取S.aureofuscus總RNA，使用Takara公司的Reverse Transcriptase M-MLV反轉錄試劑盒，完成從mRNA至單鏈cDNA的反轉錄，通過使用SYBR Premix Ex Taq(Takara)進行Real-Time PCR反應。Real-Time PCR反應條件：第一鏈cDNA合成，50 ℃ 30 min，94 ℃加熱2 min；擴增，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 20 s,28或30個循環(huán)，72 ℃ 1 min。

aurT反轉錄檢測引物：AURT1，5′-GTCGTCGGCAACCTCATCGGCTCATAC-3′和AURT2，5′-GCGCCCAGGCCCCACAGA-3′。擴增lysA基因的引物：LYSA1，5′-CGCCCGCCCACAGCAGG TCTTC-3′和LYSA2，5′-TGGGGGTGCATGAGGAACTGAT-3′。

2 結果與分析

2.1 aurT基因的克隆與測序結果分析

PCR擴增獲得金褐鏈霉菌生物合成基因簇中645bp的aurT基因片段，結果如圖1。NCBI Genbank登錄號為MH247109.1。在NCBI-blast數(shù)據(jù)庫中比較AurT與PimT的氨基酸序列，結果如圖2。AurT與PimT的氨基酸序列同源性為92%，AurT屬于RhtB家族調(diào)節(jié)因子[15]，是金褐霉素生物合成的氨基酸轉運蛋白。

圖2 AurT與PimT的氨基酸序列同源性比較

2.2 ♂aurT菌株與野生型菌株的生長和金褐霉素產(chǎn)量的比較

通過篩選高產(chǎn)金褐霉素的♂aurT轉化子(JH-T1～JH-T15)，確定♂aurT JH-T2菌株的金褐霉素產(chǎn)量最高。圖3為野生型金褐鏈霉菌SYAU0709菌株和♂aurT JH-T2菌株的生長情況(菌體干重)及金褐霉素發(fā)酵產(chǎn)量的分析結果。由圖3(a)菌體干重對比結果可知，♂aurT JH-T2菌株的生長要比野生型菌株快；由圖3(b)可知，在96 h時，♂aurT的金褐霉素產(chǎn)量達到904 μg/mL，比野生型菌株提高了1.3倍；由圖3(c)可知，通過HPLC分析，♂aurT JH-T2菌株發(fā)酵產(chǎn)量顯著高于野生菌株，進一步證實了aurT基因的過表達能夠提高金褐霉素的產(chǎn)量，說明aurT基因能夠促進金褐霉素的合成。

M，溶劑峰(甲醇); J，金褐霉素。

2.3 aurT敲除突變株ΔaurT的構建結果

PCR擴增引物aurT-UF/aurT-UR和aurT-DF/aurT-DR，獲得502 bp的aurT-5(上游同源臂)和601 bp的aurT-3(下游同源臂)，結果如圖4。aurT基因敲除載體構建結果如圖5，圖5(a)是獲得重組基因敲除質(zhì)粒pC1203-ΔaurT的構建圖。用Xba I酶切后，獲得1 209 bp的aac(3)IV-OriT片段，證明基因敲除質(zhì)粒構建成功，驗證結果如圖5(b)。

M,marker;泳道1、2,aurT-5;泳道3、4,aurT-3。

M,marker;泳道1、2,pC1203-ΔaurT Xba I單酶切獲得aac(3)IV-OriT。

2.4 ΔaurT菌株與野生型菌株的生長和金褐霉素產(chǎn)量的比較

敲除菌株ΔaurT和野生型菌株產(chǎn)金褐霉素的比較結果見圖6。由圖6(a)可知，ΔaurT菌株在96 h時金褐霉素產(chǎn)量達到239 μg/mL，與野生型菌株的發(fā)酵產(chǎn)量(684 μg/mL)相比，降低了65%，但并未完全抑制金褐霉素的產(chǎn)生；圖6(b)的HPLC分析結果表明，ΔaurT菌株的發(fā)酵產(chǎn)量低于野生型菌株，說明aurT對金褐霉素生物合成的調(diào)控過程不同于途徑特異性調(diào)控基因aurJ3M，這很可能是通過PI因子的分泌來影響和調(diào)控金褐霉素的生物合成過程的[15]。

*表示P<0.05，**表示P<0.01。M,溶劑峰(甲醇)；J，金褐霉素。

2.5 PI因子結構類似物對金褐霉素產(chǎn)量的影響

PI因子結構類似物對金褐霉素產(chǎn)量的影響，實驗結果如圖7。圖7(a)表明，加入1,2-丙二醇、丙三醇、乙二醇、三乙醇胺后，金褐霉素的發(fā)酵產(chǎn)量分別是904、1 034、881、794 μg/mL，與空白對照組的產(chǎn)量(693 μg/mL)相比，發(fā)酵產(chǎn)量有不同程度提高，其中丙三醇對金褐霉素的生物合成影響最為明顯。

**表示P<0.01；***表示P<0.001。

圖7(b)的結果表明：在野生型菌株和ΔaurT菌株培養(yǎng)時加入0.4 mL的丙三醇，發(fā)酵96 h后，野生型菌株的金褐霉素產(chǎn)量為1 034 μg/mL，比不添加時提高了1.5倍；ΔaurT菌株的金褐霉素產(chǎn)量起初為243 μg/mL，外源加入丙三醇后增加至784 μg/mL，與野生型菌株的產(chǎn)量接近。這種現(xiàn)象說明，PI因子結構類似物通過與基因簇內(nèi)特異性受體結合，啟動相關基因的表達，參與金褐霉素的生物合成調(diào)控，能夠促進金褐霉素的合成。

2.6 aurT基因表達的RT- PCR分析

為了驗證aurT基因表達是否受到PI因子誘導，在野生型菌株培養(yǎng)中，分別不添加和添加PI因子結構類似物，實驗結果如圖8。圖8結果表明，添加PI 因子增加了aurT基因的轉錄水平，說明PI因子誘導aurT基因的表達，AurT可能是誘導物PI因子的輸出器，當PI因子達到一定濃度后與基因簇上的受體蛋白結合，調(diào)控金褐霉素的合成[15]。

在金褐鏈霉菌野生型菌株培養(yǎng)中分別存在(+)或不存在(-)PI 因子的情況下進行分析，PCR擴增循環(huán)28個(左圖)和30個(右圖)；lysA基因(編碼二氨基庚二酸脫羧酶)的轉錄作為內(nèi)部對照，顯示了在30個PCR循環(huán)后不存在(-)或存在(+)PI因子的分析結果。

3 結 論

本研究獲得了金褐鏈霉菌生物合成基因簇中aurT基因，645 bp，NCBI Genbank登錄號為MH247109.1。根據(jù)NCBI結果分析，AurT屬于RhtB家族調(diào)控因子，編碼214個氨基酸，與PimT 有92%的氨基酸序列同源性，是金褐鏈霉菌的氨基酸轉運子。

與野生型菌株比較，高效表達菌株♂aurT的金褐霉素產(chǎn)量為904 μg/mL，提高1.3倍，敲除菌株ΔaurT的金褐霉素產(chǎn)量減少65%，但是沒有完全喪失生產(chǎn)金褐霉素能力。這說明aurT對金褐霉素生物合成有促進作用，但其調(diào)控作用不同于途徑特異性調(diào)控基因aurJ3M，因為敲除基因aurJ3M會完全喪失產(chǎn)金褐霉素的能力。

比較了4種不同 PI 因子結構類似物對金褐霉素合成的調(diào)控作用，結果顯示：丙三醇的效果最佳，當丙三醇質(zhì)量濃度為0.4 μg/mL，發(fā)酵時間達96 h時，金褐霉素產(chǎn)量增加1.5倍，達到1 034 μg/mL；ΔaurT菌株金褐霉素產(chǎn)量是243 μg/mL，而外源添加丙三醇后產(chǎn)量提高到784 μg/mL，與野生型菌株的金褐霉素產(chǎn)量693 μg/mL接近，說明恢復了金褐霉素的合成。在野生型菌株培養(yǎng)中添加丙三醇后，通過RT-PCR反應驗證PI因子誘導aurT基因的表達。丙三醇的添加增加了aurT基因的轉錄水平，表明丙三醇與基因簇內(nèi)特異性受體結合并啟動了相關基因aurT的表達，參與金褐霉素的生物合成調(diào)控。

本研究發(fā)現(xiàn)，在信號轉導級聯(lián)反應中，氨基酸輸出分子參與生產(chǎn)多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物，代表著我們對于了解多烯網(wǎng)絡調(diào)控邁出了重要的一步。