阿司匹林聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的作用機(jī)制研究

邊 靜，張彭輝，李佳佳(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院第二藥房，洛陽(yáng) 471300)

長(zhǎng)春瑞濱(VNR)是一種新型的半合成長(zhǎng)春堿類(lèi)抗癌藥[1]，主要作用于腫瘤細(xì)胞G2期，屬細(xì)胞周期特異性藥物[2]，可阻滯微管蛋白聚合并促進(jìn)誘導(dǎo)微管的解聚，使腫瘤細(xì)胞在有絲分裂中受阻，導(dǎo)致分裂增殖停止于有絲分裂中期。研究表明，使用其他藥物聯(lián)合VNR治療乳腺癌效果較好[3]。張旭等[4]研究表明，環(huán)氧合酶-2 (COX-2)在結(jié)腸癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌和乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，說(shuō)明COX-2參與了多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展。呂田等[5]研究表明，非甾體抗炎藥物可通過(guò)抑制 COX-2 發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，本文旨在研究阿司匹林聯(lián)合VNR對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2試藥 RPMI 1640型培養(yǎng)基(批號(hào)20181219)，武漢純度生物科技有限公司；Annexin V-FITC和PI凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20190113)，艾美捷科技有限公司；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2抗體(Bcl-2，批號(hào)2019001)，Bcl相關(guān)X蛋白抗體(Bax，批號(hào)20181203)，磷酸化絲氨酸蘇氨酸激酶抗體(P-Akt，批號(hào)20190103)，絲氨酸蘇氨酸激酶抗體(Akt，批號(hào)20190103)，半胱氨酸蛋白酶3抗體(Caspase-3，批號(hào)20190106)，半胱氨酸蛋白酶9抗體(Caspase-9，批號(hào)20190105)，均購(gòu)自Santa Cruz Animal Health公司；阿司匹林(國(guó)藥準(zhǔn)字：J20171021)，購(gòu)自阿斯利康制藥有限公司；VNR(批號(hào)20190110)，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜(批號(hào)20190122)，購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫箱中，調(diào)整二氧化碳濃度至2.23×105mol·L-1，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2分組及給藥 本實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照組(添加等量的細(xì)胞培養(yǎng)液)，VNR組(VNR 10 μg·mL-1給藥治療)，阿司匹林+VNR低劑量組(阿司匹林5 mmol·L-1和VNR 10 μg·mL-1聯(lián)合治療)，阿司匹林+VNR高劑量組(阿司匹林10 mmol·L-1和VNR 10 μg·mL-1聯(lián)合治療)[6-7]。

1.3.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，以細(xì)胞密度1×107個(gè)·L-1接種于96孔板內(nèi)，分別向3個(gè)給藥組加入對(duì)應(yīng)藥物進(jìn)行治療。培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加二甲基亞砜100 μL，振蕩待其充分溶解后，于24和48 h分別在490 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度值A(chǔ)，并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.3.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期變化 分別使用4組相關(guān)藥物處理處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，消化后恒溫離心 5 min，加入 Binding Buffer 重懸細(xì)胞100 μL，并加入 Annexin V-FITC和PI各5 μL，混勻；孵育后加入 Binding Buffer 400 μL，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.5Western Blot法檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、P-Akt和Akt蛋白表達(dá) 采用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，用Bradford調(diào)整各組蛋白濃度使一致，再經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，密封2 h，加入Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、P-Akt和Akt抗體(1∶500)于4 ℃ 孵育過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記二抗(1∶500)孵育1 h，顯色，曝光后以β-actin為內(nèi)參蛋白，蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值÷內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0，使用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1MTT觀察細(xì)胞的增殖情況 見(jiàn)表1。由表1可知，與空白對(duì)照組比較，VNR組MCF-7細(xì)胞在24，48 h抑制率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與VNR組比較，阿司匹林+VNR低劑量組MCF-7細(xì)胞在24，48 h抑制率顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與阿司匹林+VNR低劑量組比較，阿司匹林+VNR高劑量組MCF-7細(xì)胞在24，48 h抑制率均有一定程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 細(xì)胞的增殖情況觀察

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢驗(yàn)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布情況 見(jiàn)圖1、圖2和表2。由圖1可知，空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率較低；與空白對(duì)照組比較，VNR組MCF-7的細(xì)胞凋亡率有一定程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與VNR組比較，阿司匹林+VNR低劑量組MCF-7細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與阿司匹林+VNR低劑量組比較，阿司匹林+VNR高劑量組MCF-7細(xì)胞凋亡率有一定程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

由表2和圖2可知，空白對(duì)照組細(xì)胞各周期數(shù)量均正常；與空白對(duì)照組比較，VNR組MCF-7細(xì)胞G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，G2期細(xì)胞無(wú)顯著變化(P>0.05)；與VNR組比較，阿司匹林+VNR低劑量組MCF-7細(xì)胞G1期顯著減少，S期細(xì)胞顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，G2期細(xì)胞無(wú)顯著變化(P>0.05)；與阿司匹林+VNR低劑量組比較，阿司匹林+VNR高劑量組MCF-7 細(xì)胞G1期減少，S期增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，G2期無(wú)顯著變化(P>0.05)。

圖1 流式細(xì)胞凋亡觀察結(jié)果

圖2 流式細(xì)胞凋亡周期觀察結(jié)果

表2 聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響

2.3相關(guān)凋亡蛋白檢測(cè) 見(jiàn)表3和圖3。由表3和圖3可知，與空白對(duì)照組比較，VNR組Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著下降，Bax蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與VNR組比較，阿司匹林+VNR低劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著下降，Bax蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與阿司匹林+VNR低劑量組比較，阿司匹林+VNR高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)有一定程度下降，Bax蛋白表達(dá)量有一定程度升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 凋亡Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況

圖3 聯(lián)合給藥對(duì)相關(guān)凋亡蛋白的影響

2.4Caspase家族相關(guān)蛋白檢測(cè) 見(jiàn)表4和圖4。由表4和圖4可知，與空白對(duì)照組比較，VNR組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與VNR組比較，阿司匹林+VNR低劑量組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與阿司匹林+VNR低劑量組比較，阿司匹林+VNR高劑量組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)量有一定程度升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 凋亡Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)情況

圖4 聯(lián)合給藥對(duì)Caspase家族蛋白的影響

2.5磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸激酶(PI3K/Akt)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響 見(jiàn)表5和圖5。由表5和圖5可知，與空白對(duì)照組比較，VNR組P-Akt蛋白表達(dá)量有一定程度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Akt蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化(P>0.05)；與VNR組比較，阿司匹林+VNR低劑量組P-Akt蛋白表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Akt蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化(P>0.05)；與阿司匹林+VNR低劑量組比較，阿司匹林+VNR高劑量組P-Akt蛋白表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Akt蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化(P>0.05)。

表5 凋亡P-Akt和Akt蛋白表達(dá)情況

圖5 聯(lián)合給藥對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

3 討論

翁熊等[8]研究表明，腫瘤細(xì)胞周期停止于有絲分裂前期，能避免腫瘤細(xì)胞不斷進(jìn)入有絲分裂期，從而抑制其進(jìn)一步發(fā)展，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期可作為腫瘤治療的一種重要方法。白宏等[9]研究表明，細(xì)胞周期可分為G1期、S期、G2期和M期4個(gè)時(shí)期，是高度有序的運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程，只有在完成上一個(gè)時(shí)相后才能進(jìn)入下一個(gè)時(shí)相。細(xì)胞完成每一個(gè)時(shí)相時(shí)會(huì)把不同染色體準(zhǔn)確無(wú)誤地遺傳給子代細(xì)胞。這一過(guò)程中，每個(gè)誤差都可能導(dǎo)致遺傳信息的改變，從而導(dǎo)致腫瘤或其他疾病的發(fā)生。岳慶喜等[10]研究表明，許多抗腫瘤藥物直接參與對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)調(diào)控，同時(shí)細(xì)胞增殖周期的檢測(cè)是抗腫瘤作用及其機(jī)制研究的常用生物學(xué)指標(biāo)。王茜等[11]研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥和單獨(dú)給藥均能抑制MCF-7細(xì)胞，使細(xì)胞阻滯在S期并抑制Akt的磷酸化。有研究發(fā)現(xiàn)[12]，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)阿司匹林可使MCF-7細(xì)胞阻滯于G2/M期和S期。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿司匹林聯(lián)合VNR使得乳腺癌細(xì)胞的S期細(xì)胞百分比顯著增高，說(shuō)明聯(lián)合用藥可將MCF-7細(xì)胞抑制在S期，防止腫瘤細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期從而抑制其進(jìn)一步發(fā)展，這與吳穎等[13]的研究結(jié)論一致。

細(xì)胞凋亡受多種基因共同調(diào)控[14]，Caspase是重要的調(diào)控基因之一，Caspase-3和Caspase-9是Caspase家族中主要的凋亡因子[15]。Caspase-9是Caspase家族的凋亡啟動(dòng)子，可產(chǎn)生有活性的凋亡執(zhí)行基因Caspase-3并剪切Caspase 底物引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[16]。研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3和Caspase-9表達(dá)顯著升高，說(shuō)明阿司匹林聯(lián)合VNR作用后促進(jìn)了Caspase-9和Caspase-3的蛋白表達(dá)，使得細(xì)胞凋亡啟動(dòng)、執(zhí)行和發(fā)展均受到促進(jìn)。阿司匹林聯(lián)合VNR使得Caspase-9表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡子啟動(dòng)，促進(jìn)Caspase-9裂解，使得非活化狀態(tài)Caspase-3 產(chǎn)生有活性的 Caspase-3，其含量也增加，最終促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的凋亡，這與吳娟等[17]的研究結(jié)論一致。Bcl-2 家族和Caspase家族作用類(lèi)似，也可調(diào)控細(xì)胞的凋亡，在Bcl-2 家族中，當(dāng)Bcl-2蛋白表達(dá)下降時(shí)，Bax蛋白表達(dá)上升，此時(shí)細(xì)胞趨于凋亡，相反，Bcl-2蛋白表達(dá)升高時(shí)Bax蛋白表達(dá)則會(huì)下降，細(xì)胞的凋亡同時(shí)也會(huì)受到抑制[18-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，說(shuō)明阿司匹林聯(lián)合VNR可有效促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡，達(dá)到抑制乳腺癌發(fā)展的效果。

Fang W L等[21]研究表明，在癌細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路被異常激活，其作用機(jī)制主要是PI3K催化亞單位α(PIK3CA)基因突變以及10號(hào)染色體丟失磷酸酶基因(PTEN)表達(dá)的丟失等。因此，PI3K/Akt信號(hào)通路在乳腺癌的治療中起著十分重要的作用。目前以這條通路為作用靶點(diǎn)的抑制劑已成為研究熱點(diǎn)。已知的通路抑制劑包括PI3K抑制劑、PI3K/Akt雙重抑制劑和Akt抑制劑。研究顯示，阿司匹林聯(lián)合VNR能顯著降低Akt的磷酸化，但總量改變并不顯著，說(shuō)明阿司匹林聯(lián)合VNR促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡是通過(guò)抑制 PI3K/Akt 信號(hào)通路發(fā)揮效應(yīng)，減少Akt的磷酸化，促進(jìn)人甲狀腺癌細(xì)胞(IHH4)的凋亡。

綜上所述，阿司匹林聯(lián)合VNR可通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路有效誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制既與調(diào)控Caspase家族和Bcl-2家族基因相關(guān)，也與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。VNR可聯(lián)合使用的藥物較多，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可進(jìn)一步探討其他藥物聯(lián)合VNR對(duì)MCF-7細(xì)胞的作用機(jī)制。